資源簡介

(共65張PPT)
目的基因的PCR擴增
及其擴增產物的鑒定分析
綜合性設計性實驗
此實驗共包括如下六個部分
第一部分，目的基因選擇
第二部分，PCR引物設計
第三部分，PCR實驗操作
第四部分，PCR產物電泳鑒定
第五部分，PCR產物測序鑒定
第六部分，目的基因序列變異分析
第一部分 目的基因選擇
候選基因簡介
在本實驗中，有三個候選基因，分別是NGAL，Fascin和Ezrin。
這三個基因在食管癌及其他多種腫瘤中呈過表達，說明它們在腫瘤的發生發展中起重要的生物學作用。
汕頭大學醫學院生物化學與分子生物學教研室李恩民課題組曾對這三個基因進行了深入研究，在國外雜志上發表SCI收錄研究論文20余篇，已形成系列優勢。
同學們可查閱相關資料，選擇感興趣的基因來做PCR實驗。
NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，是脂質運載蛋白（lipocalin) 家族的一個成員。
NGAL基因的蛋白產物具有保護調節基質金屬蛋白酶-9的活性，作為小分子鐵配合物結合蛋白參與機體鐵代謝和天然免疫反應等功能。另外，NGAL作為一種早期標志物還可以幫助判定缺血性腎損傷程度。
NGAL 基因
NGAL的mRNA信息在NCBI核酸數據庫中有來自不同實驗室登記的多個版本，包含完整編碼區的有BC033089和NM_005564等，編碼區長為597 bp，編碼198個氨基酸，包含了N端前部長為20個氨基酸的信號肽序列（為核酸序列的1-60 bp）
信號肽預測網站
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
信號肽 (signal peptide): 某種分泌蛋白質及細胞膜蛋白質等，以前體物質多肽的形式合成，其N末端含有作為通過膜時之信號的氨基酸序列，這種氨基酸序列稱信號肽或信號序列（signal sequence）。
NGAL核酸編碼區序列及其相應的蛋白序列：
前20個AA為信號肽序列
2001年汕頭大學醫學院生物化學與分子生物學教研室李恩民課題組以永生化食管上皮細胞系SHEE 和食管癌細胞系SHEEC 互為對照，用cDNA 微列陣進行篩選，用RNA 印跡和RT-PCR 進行鑒定，cDNA 克隆測序后與GenBank 進行BLAST 分析比較。結果表明NGAL 基因在SHEEC中出現顯著差異過表達，其cDNA 序列與小鼠24p3、大鼠NRL (neu-related lipocalin) 和人中性粒細胞NGAL 具有較高的相似性。這提示NGAL 基因在永生化食管上皮細胞惡性轉化中可能發揮著重要作用，可能是一種新的癌基因或促癌基因。
A
B
利用cDNA 芯片篩選兩種細胞的差異表達基因
A.永生化食管上皮細胞系SHEE
B.食管癌細胞系SHEEC
A B C
反轉錄PCR檢測NGAL在兩種細胞的mRNA水平
A.永生化食管上皮細胞系SHEE
B.食管癌細胞系SHEEC
C. 100 bp DNA marker
Fascin蛋白的mRNA全長為2767bp，由5‘端非翻譯區111bp堿基，3’端非翻譯區1174bp堿基，1482bp的全編碼序列區和6個PloyA信號肽組成，編碼493個氨基酸，分子量約為55kD。
Fascin蛋白定位于細胞質張力纖維和細胞膜皺褶(ruffles)，邊緣的絲狀偽足(filopodia)、微棘(microspikes)的核心肌動蛋白束中。
Fascin 基因
以往研究發現，Fascin基因在許多上皮來源的腫瘤細胞系，
如宮頸癌Hela、胃癌AGS、大腸癌LM1215和SW480、胰腺
癌BxPC3和T3H4等細胞系中均上調表達。
細胞的絲狀偽足和微棘與細胞的運動，癌細胞的轉移有密
切關系，提示Fascin蛋白可能在細胞遷移、細胞粘附以及
細胞間信息交流等過程中發揮作用。
ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTACTAG
MTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDGNVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNKVAIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEY
Fascin基因的編碼區序列
Fascin基因的蛋白序列
Fascin蛋白的三級結構：由4個β-三葉草結構組成，含多個β折疊
目前已有課題組發現，在永生化食管上皮細胞SHEE向食管癌細胞SHEEmt的惡性轉化中，Fascin基因呈現上調表達，并且在食管癌組織中也檢測到Fascin蛋白呈陽性表達。
Fascin在食管癌中的具體功能以及過表達的機制至今仍沒有得到很好的闡明。為此我們設計并合成了靶向Fascin基因的siRNA，試圖通過RNA干擾的方法減少Fascin基因的表達，從而探討Fascin對腫瘤的分化、分裂增殖和浸潤等生物學行為的影響。
掃描電鏡結果顯示抑制Fascin表達后，EC109細胞突觸形成明顯減少。
細胞免疫熒光結果顯示代表Fascin蛋白的綠色熒
光在被干擾細胞（A）中要比對照細胞（B）的
弱
A
B
Ezrin基因
Ezrin為ERM（Ezrin,radixin,moesin ）蛋白家族成員之一，ERM家族成員大多位于絲狀突和膜伸展部位，基本功能就是將肌動蛋白栓系到細胞膜和將膜蛋白錨定在特定的部位，這樣可維持細胞膜表面的一些特殊結構，如微絨毛和細胞膜突起等。
ERM家族蛋白還參與細胞表面粘附分子的定位，通過細胞與細胞、細胞與基質之間的相互作用參與細胞粘附作用降。
ERM家族蛋白還是酪氨酸激酶的受體，并通過Rho-GTP酶參與信號轉導。
Ezrin含有585個氨基酸，等電點為6.15，理論分子量為69kD。
Ezrin分子帶有大量電荷（38.5%的氨基酸殘基帶電荷），這可能是導致它的理論分子量與實際分子量不同的原因（Ezrin實際分子量為80kD）。
Ezrin定位與染色體6q25.2-q26，DNA長度為1761個堿基，含13個外顯子。
ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAA
ACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAG
GATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTC
CGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAA
GGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGT
TTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAG
CACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGC
TATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAA
CAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTT
CCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTT
TGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCC
GCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGG
CAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT
GATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGC
AGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAG
GAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAA
GATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGG
ATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCG
GTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGG
CATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGC
TGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAA
GGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAA
Ezrin的編碼區序列
Ezrin蛋白含有四個功能域
名稱 起始 終點 功能
FERM_N 9 86 將胞漿蛋白連接到膜上
FERM_M 88 206
FERM_C 210 299
ERM 338 586 結合胞漿蛋白
目前已發現Ezrin在食管癌及切緣食管粘膜組織中的位置分布有胞膜分布、胞漿分布和胞膜胞漿混合分布等三種模式。惡性程度越高的癌細胞越易具有胞漿分布模式，說明Ezrin細胞定位的變化可能在食管癌的發生發展過程中發揮重要作用。
第二部分，PCR引物設計
引物決定了PCR產物的長度和特異性。目前有多種引物設計軟件，如primer premier5、Oligo和北京軍事醫學科學院李伍舉教授開發的Biosun等，Internet免費引物設計網站有primer 3，Primerfinder等。
引物設計有以下幾個原則：
（1）引物的特異性。引物應根據目的序列進行設計，引物與非靶序列之間不要超過 70％的同源性或連續8個的堿基互補，減少非特異產物；
（2）引物的長度。一般指引物中能與模板序列互補結合的部分，不包括在5‘端額外增加的酶切位點序列和其他序列。引物長度以18～24 bp為佳。
（3）引物3’末端的堿基。引物3’末端是延伸的始端，堿基錯配會影響延伸效率。當最后一個堿基是A時，容易發生錯配，所以引物3’末端最好不要為A；
（4）引物的G+C含量一般為40％～60％，過高或過低都不利于引發反應；
（5）兩條引物不能形成穩定的二聚體，或引物自身不能形成穩定的二級發夾結構，這些都會影響引物與模板的結合。
（6）兩條引物的融解溫度Tm值盡量不要相差太大，引物的Tm值粗略計算公式為Tm = 4 （G+C）+2（A+T）；
（7）引物的5'端對擴增特異性沒有影響，因此可以被修飾而不影響擴增的特異性，引物5′端修飾包括加酶切位點、標記生物素和熒光等，引物3'端是延伸的開始，不能進行任何修飾。
引物設計軟件primer premier 5.0的使用
可通過兩個方法將序列輸入軟件中
在表中粘貼序列
打開原有的序列文件
選擇序列文件所在位置
在對話框中輸入待擴增序列
點擊左上角的“Primer”按鈕
Hairpin: 引物自身是否會形成發夾結構
Dimer: 同一種引物是否會形成二聚體
False primiring: 引物在待擴增序列中其他位置是否有配對
Cross Dimer: 正向與反向引物間是否會形成二聚體
引物設計界面
正向和反向引物的互換
正向和反向引物的評價
正向和反向引物的信息
每點擊左邊紅色的按鈕，就出現相應的內容
對正向和反向引物進行編輯
可對引物進行增加或減少堿基
用鍵盤輸入了5個堿基
引物的信息
改動后引物的信息
重新回到雙引物的界面
“Edit”－“Copy”－“Sense Primer”
5' CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3'
輸出引物序列
了解并掌握PCR基因擴增的基本原理
熟悉PCR基因擴增技術的具體操作過程
實驗目的
第三部分 PCR實驗操作
一、概述
PCR：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用DNA合成 酶和四種脫氧核糖核酸進行DNA的體外合成反應。
PCR技術具有靈敏度高，特異性高、操作方便和重復性好等特點，能夠在幾個小時內獲得多達幾百萬拷貝的目的基因。
該技術在上個世紀80年代中期由美國K.Mullis發明建立，經過近二十年已發展成包括多種衍生技術，在很多領域中廣泛使用，K.Mullis也因此獲得1993年度的諾貝爾化學獎。
二、PCR基本原理
DNA在細胞中的復制是一個復雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是 DNA聚合酶、DNA連接酶、引發酶、RNA引物、四種脫氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、離子環境等多成份參與的過程。
PCR是在試管內使用最基本的成份模擬了細胞內的DNA復制，所以在一個PCR中必需成分是
1. 模板DNA
2. DNA聚合酶
3. 四種脫氧核糖核酸
4. 正向和反向兩條引物
5. 適當的緩沖體系。
模板序列：待擴增的DNA序列，一般為雙鏈的DNA可包括線形雙螺旋DNA，如基因組DNA，及閉環雙鏈DNA，如質粒；
模板的來源很廣，如從細胞/細菌中提取基因組DNA、提取mRNA經反轉錄得到cDNA、質粒、病毒等；
每個反應中模板的量為1 ng～1 μg。質粒DNA和純化的DNA的量可少一些，而基因組DNA的量應多一些。
PCR靈敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否則會導致PCR的非特異性擴增。
1.模板DNA
引物（primer）也稱為寡核苷酸引物，常規的PCR反應需要兩種引物，分別成為5′端引物和3’端引物，或稱為正向引物和反向引物。
通常DNA及mRNA序列的寫法為5′→3′，所以5′端引物與目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物與目的序列的3′末端序列反向互補。
2.引物
它們作為DNA擴增的起始部分，能限定待擴增DNA序列的長度。
為了保證擴增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應至少有15～18bp。
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′
3′
上游引物
下游引物
DNA聚合酶：以DNA為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的DNA的一種酶。
早期的PCR反應使用的DNA聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但該酶在高溫下容易失活，需要在每次合成反應進行時候再加入一份酶。
隨著新的耐熱DNA聚合酶的發現及在PCR反應中的應用，使PCR操作更方便，產量更穩定。
目前商品化的DNA聚合酶有Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。
Taq DNA聚合酶最適工作溫度為75-80℃。該酶具有5′→3′聚合酶活性，在鎂離子存在情況下可催化核苷酸沿5′→3′方向發生聚合反應。
3. DNA聚合酶
4.脫氧核糖核酸
四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，為PCR反應中DNA合成原料。
在新的一個反應體系中，這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應該都相等，如果其中一種的濃度明顯不同于其他的就會誘發錯配，并降低新鏈合成速度。
緩沖液提供PCR反應所必需的合適酸堿度與離子環境。主要成分有KCl、Tris-Cl和MgCl2。
其中Mg2＋的濃度最重要，它能影響DNA聚合酶的活性，以及模板與PCR產物的解鏈溫度。
5.緩沖液
變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版DNA成為單鏈的DNA分子；在應用Taq DNA聚合酶進行PCR反應時，變性往往在94℃～95℃條件下進行。這也是Taq DNA聚合酶進行30個左右的PCR循環而活力不致受到過多損失時所能耐受的最適溫度。
退火：是指引物和模板在局部形成互補的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物的熔解溫度低5～10℃，PCR實驗要對退火溫度進行優化。
二、PCR基本步驟
延伸：在鎂離子存在條件下，DNA聚合酶按堿基互補原則，催化四種脫氧核糖核酸加在引物的3′端，使引物沿5′→3′方向生成與模版DNA互補的新DNA鏈。
雙鏈模版DNA
變性
退火
5′
3′
5′
3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′
3′
上游引物
下游引物
延伸
3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′
多次循環
（2n 拷貝）
下面為一個典型的PCR循環參數設置：
備注：* 比兩條引物的Tm值低5~10℃。
94℃ 5 min
94℃ 30 s
X ℃* 30 s
72℃ 1 kb/min
72℃ 5 min
25-35個循環
三、影響PCR因素
雖然PCR操作很方便，但影響因素也很多，從而影響PCR的特異性和高效性。
引物
變性溫度和時間
退火溫度和時間
延伸溫度和時間
循環次數
引物決定了PCR產物的長度和特異性。
引物的設計要求請看本實驗講義“引物設計”部分。
1.引物
在PCR反應剛開始時，為保證作為模板的雙鏈DNA完全變性成單鏈DNA，一般設為95℃、5 min；在隨后的循環中，可設為95℃、30s。
有些模板DNA的G+C含量較高，變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長的變性時間會影響DNA聚合酶的活性。
2.變性溫度和時間
退火溫度與引物的Tm值相關，一般比Tm值低5~10℃。
退火溫度設置過低，會導致非特異性擴增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結合而降低PCR效率。
在退火時間里，引物與模板相結合，時間太短會使引物與模板未完全結合而導致無法延伸；時間過長容易產生引物在模板上的非特異性結合或形成引物二聚體。退火時間設置為30s基本上就足夠了。
3.退火溫度和時間
所用DNA聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如Taq聚合酶的最佳溫度為70～80度，所以延伸溫度設為72℃即可。
在實踐中Taq DNA聚合酶的延伸效率約為500 bp/30 s，若待擴增的片段較長，可適當延長時間，但時間過長又會致非特異性擴增。
4.延伸溫度和時間
在經過一定的循環次數后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素，PCR產物不再呈指數增加，此時稱為平臺效應。
循環次數設為25~30次，即可滿足一般的分子生物學實驗要求。過多的循環次數會導致堿基錯配增加和非特異性擴增的出現。
5.循環次數
DNA模板：以pPIC9-NGAL為模板，來擴增不包含信號肽序列的NGAL編碼區
引物：
PCR上游引物（P1）：5′-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA -3′
PCR下游引物（P2）：5′-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC -3′
底下有橫線的堿基為酶切位點：XholI (P1)，EcoRI(P2)
2×Taq PCR Master Mix （廣州佰路生物科技有限公司生產，產品成份為： 0.1 U Taq DNA Polymerase/ml 500 mM dNTP each 50 mM Tris-HCl (pH8.7) 20 mM KCl 4 mM MgCl2
無菌水
100bp plus ladder DNA marker
本實驗所用試劑
實驗操作
95℃ 2min
94℃ 30s
60℃ 30s
72℃ 30s
72℃ 5min
30個循環
按以下次序將各成分加PCR管中。
2×Taq PCR MasterMix 5 l
P1 (12.5 M ) 1 l
P2 (12.5 M) 1 l
無菌水 2 l
pPIC9-NGAL 1 l
反應體系：10 l
混勻，稍加離心并標記。
PCR反應于ABI 2720 Thermer cycler進行，PCR反應條件：
凝膠準備
① 稱1g瓊脂糖置三角瓶中，加100ml 1×TAE；
② 微波爐加熱大約2分鐘，熔化瓊脂糖；
③ 熔化的瓊脂糖自然冷卻到60～70℃時，加入EB 5μl，并輕輕混勻。
膠床準備
① 將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內，梳齒底端和床面有1mm的間隙；
② 將膠床放在調整好的水平臺上；
鋪膠：將冷卻致60℃的凝膠倒入準備好的膠床內，凝膠厚度約5 mm；
室溫下靜置30分鐘左右，凝膠固化。將帶凝膠 的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場負極；
第四部分 PCR產物電泳鑒定
向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可；
輕輕拔出固定在凝膠中的梳子；
樣品準備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻
上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為10μl
蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳；
電泳條件：電壓80v；時間20～25分鐘；
電泳結束后，切斷電源，取出凝膠；
電泳結果分析：
① 紫外檢測儀直接觀察電泳條帶
② 攝影記錄
瓊脂糖凝膠電泳預期結果：
500 bp
560 bp
PCR產物的直接測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產物后測序。
PCR產物連接到載體后測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產物，利用連接酶將PCR產物連接到載體如pGEM-T后，轉化大腸桿菌提取質粒后測序。
美國應用生物系統公司 3130 基因分析儀
24 小時無人監控操作
儀器設置更方便更簡單
新型自動灌膠系統進行灌膠
檢測池加熱器改進了溫度控制
通過 96 孔和 384 孔板自動進樣
多色熒光檢測
第五部分 PCR產物測序鑒定
觀看測序結果的軟件Chromas
軟件運行界面
打開一個測序結果
峰型排列良好，無高大雜峰，說明測序結果可靠
將測序結果輸出為文本文件
雖然現在的PCR技術使PCR擴增有很高的真實性，即PCR產物與模板DNA的一致性很高，但由于PCR擴增畢竟是在試管內進行的DNA復制，沒有類似細胞內DNA錯配修復機制，所以，在PCR產物擴增以后，仍要分析其與模板DNA的是否完全一致。最好的方法是將PCR產物測序，將測序結果與數據庫作序列比對分析。
第六部分 目的基因序列變異分析
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
核酸序列比對
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
BLAST分析界面
輸入測序結果
結果界面之一
結果界面之二

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