資源簡介

　 動物轉(zhuǎn)基因方法簡介
轉(zhuǎn)基因動物 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )就是基因組中含有外源基因的動物。它是按照預(yù)先的設(shè)計(jì)，通過細(xì)胞融合、細(xì)胞重組、遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移、染色體工程和基因工程技術(shù)將外源基因?qū)刖印⒙鸭?xì)胞或受精卵 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )，再以生殖工程技術(shù)，有可能育成轉(zhuǎn)基因動物。
原核顯微注射法（原核期細(xì)胞：受精卵的兩個核未融合時期的細(xì)胞）
目前最常用的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)方法，又稱DNA顯微注射法，即通過顯微操作 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )儀將外源基因直接用注射器 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。其創(chuàng)始人是Jaenisch和Mintz等。Gordon等和Palmiter等先后通過此方法獲得轉(zhuǎn)基因動物。此方法目前應(yīng)用較普遍，現(xiàn)在的轉(zhuǎn)基因動物研究大都是在Palmiter等方法的基礎(chǔ)上有所改進(jìn)而進(jìn)行的。王敏華(1996)報(bào)道用顯微注射法轉(zhuǎn)移抗瘟病毒核酸酶基因，獲得了轉(zhuǎn)基因兔。KrimPenfort運(yùn)用體外培養(yǎng)胚胎 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )再施用顯微注射法獲得了轉(zhuǎn)基因牛
這種方法的特點(diǎn)是外源基因的導(dǎo)入整合效率較高，不需要載體，直接轉(zhuǎn)移目的基因 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )。它可以直接獲得純系（應(yīng)該也不一定，如上述魚的情況），所以實(shí)驗(yàn)周期短。但需要貴重精密儀器，技術(shù)操作較難，并且外源基因的整合位點(diǎn)和整合的拷貝數(shù) ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )都無法控制，易造成宿主 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )動物基因組的插入突變，引起相應(yīng)的性狀改變，重則致死
外源基因整合到受體基因組的時機(jī)，將決定轉(zhuǎn)基因動物是否發(fā)育成嵌合體，如整合發(fā)生在第一次卵裂前，即發(fā)生在DNA合成的S期，外源基因?qū)㈦S染色體的分離均勻的分布到每一個細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)基因動物是純合體，反之，得到的將是嵌合體。顯微注射轉(zhuǎn)基因的實(shí)踐證明，受精卵DNA合成的S期是顯微注射的適宜時機(jī)。但由于整合需要一段時間，等目的基因整合至染色體后，受精卵早已分裂多次，故很難得到純合體。如魚類在原腸胚早期才開始整合，而此時細(xì)胞已多值幾千，此時轉(zhuǎn)植基因在每個細(xì)胞內(nèi)的整合情況不可能一致，所以第一代轉(zhuǎn)基因魚總是嵌合體。哺乳動物受精卵的單細(xì)胞期階段較長，還有可能得到純合體的轉(zhuǎn)基因動物。
也可在囊胚期進(jìn)行，得到的是嵌合體轉(zhuǎn)基因動物
胚胎干細(xì)胞 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )（Embryonic Stem Cell，簡稱ES細(xì)胞）介導(dǎo)法
是將基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞；然后將轉(zhuǎn)基因的胚胎干細(xì)胞注射于動物囊胚 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )后可參與宿主的胚胎構(gòu)成，形成嵌合體 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )，直至達(dá)到種系嵌合。因此，可以將其作為一種載體，導(dǎo)入外源基因，獲得轉(zhuǎn)基因動物。即從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細(xì)胞系
其優(yōu)點(diǎn)是：在將胚胎干細(xì)胞植入胚胎前，可以在體外選擇一個特殊的基因型：用外源DNA轉(zhuǎn)染 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )以后，胚胎干細(xì)胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細(xì)胞用于細(xì)胞融合 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )，由此可以得到很多遺傳上相同的轉(zhuǎn)基因動物。缺點(diǎn)就是許多嵌合體轉(zhuǎn)基因動物生殖細(xì)胞 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )內(nèi)不含有轉(zhuǎn)基因;
目前，胚胎于細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動物上應(yīng)用較晚。Evans等（1981）用不同培養(yǎng)系統(tǒng)從小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離并建立了多潛能干細(xì)胞克隆系；Stice和
Strelchenko等（1996）獲得了牛的胚胎干細(xì)胞。
注意：DNA顯微注射和胚胎顯微注射的區(qū)別
1 胚胎顯微注射得到嵌合體小鼠。
: N8 d9 {# X. g1 y DNA顯微注射得到轉(zhuǎn)基因小鼠。
+ f8 I+ X/ l' V5 s8 Z% [2 胚胎顯微注射是把是把轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)了目的基因的胚胎干注射到囊胚
7 t) k w4 P" o+ @2 E5 W$ o DNA顯微注射是把DNA注射到原核期細(xì)胞
逆轉(zhuǎn)錄 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )病毒載體 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )法
將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染的目的，通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。通過此方法，Slater等得到了轉(zhuǎn)基因雞，Haskell得到了轉(zhuǎn)基因牛。
這種逆轉(zhuǎn)錄病毒被用重組DNA技術(shù)修飾后作為基因載體在應(yīng)用中優(yōu)于微注射法之處為：無需要重排 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )，可在整合點(diǎn)整合轉(zhuǎn)移基因的單個拷貝；將胚胎置于高濃度病毒容器中，或者與被感染的細(xì)胞體外共同培養(yǎng)，或微注射雞胚盤里，整合有逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA的胚胎率高。缺點(diǎn)是：需要生產(chǎn)帶有轉(zhuǎn)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒；插入逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因有一定的大小限度；所得轉(zhuǎn)基因家畜的嵌合 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )性很高，而需要廣泛的雜交，以建立轉(zhuǎn)基因系；轉(zhuǎn)基因的表達(dá)問題尚未解決。
精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移
精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是把精子 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )作適當(dāng)處理后，使其具有攜帶外源基因的能力。然后，用攜帶有外源基因的精子給發(fā)情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的動物是整合外源基因的轉(zhuǎn)基因動物。同顯微注射方法相比，精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移有兩個優(yōu)點(diǎn)：首先是它的成本很低，只有顯微注射法成本的1/10。其次，由于它不涉及對動物進(jìn)行處理，因此，可以用生產(chǎn)牛群或羊群進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以保證每次實(shí)驗(yàn)都能夠獲得成功。
核移植轉(zhuǎn)基因法
　　 體細(xì)胞核移植是近年來新出現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)。該方法是先把外源基因與供體細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使外源基因整合到供體細(xì)胞上，然后將供體細(xì)胞細(xì)胞核移植到受體細(xì)胞——去核卵母細(xì)胞，構(gòu)成重建胚 ( http: / / www.21cnjy.com / " \o "歡迎登陸21世紀(jì)教育網(wǎng)" \t "_blank )，再把其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩，便可得到轉(zhuǎn)基因的克隆動物
體細(xì)胞核移植法
　　 先在體外培養(yǎng)的體細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)耄Y選獲得帶轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。然后，將帶轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，生產(chǎn)重構(gòu)胚胎。重構(gòu)胚胎經(jīng)移植到母體中，產(chǎn)生的仔畜百分之百是轉(zhuǎn)基因動物。
線粒體介導(dǎo)法
由于轉(zhuǎn)基因動物受遺傳鑲嵌性和雜合性的影響，其有性生殖后代變異較大，難以形成穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因品系。因而，嘗試從受體動物細(xì)胞中分離出線粒體，以外源基因?qū)ζ溥M(jìn)行離體轉(zhuǎn)化，再將轉(zhuǎn)基因線粒體導(dǎo)入受精卵，所發(fā)育成的轉(zhuǎn)基因動物雌性個體外培養(yǎng)的卵細(xì)胞與任一雄性個體交配或體外人工授精，由于線粒體的細(xì)胞質(zhì)遺傳，其有性后代可能全都是轉(zhuǎn)基因個體。

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