資源簡介

選修1《生物技術實踐》知識梳理
專題一 傳統發酵技術的應用
課題1 果酒和果醋的制作
一、基礎知識
1、發酵：利用 在 條件下的生命活動來制備產物的過程。
2、發酵的類型：
（1）根據是否需要氧氣分為： 和厭氧發酵。
（2）根據產生的產物可分為： 、乳酸發酵、 等。
3、果酒的制作：
（1）菌種是 ，它屬于真核生物，兼性厭氧型微生物，在有氧條件下利用葡萄糖進行 呼吸，大量繁殖，反應式為： 。無氧條件下，能進行 發酵，反應式為： 。
（2）酵母菌繁殖的最適溫度在20℃左右，酒精發酵一般控制在 ℃。
4、果醋的制作：
（1）菌種是 ，它屬于原核生物，異養需氧型微生物。只有在氧氣充足時，才能進行旺盛的生命活動。
（2）當氧氣、糖源都充足時，醋酸菌將葡萄汁中的葡萄糖分解成 ，C6H12O6+O2 → CH3COOH+H2O；當缺少糖源時，醋酸菌將 變為醋酸，反應簡式為C2H5OH+O2 → CH3COOH+H2O。
（3）醋酸菌的最適生長溫度為30～35℃。
（4）發酵瓶要清洗干凈，用體積分數 的酒精消毒。
5、用 檢驗酒精：在酸性條件下，橙色的重鉻酸鉀與酒精反應呈現灰綠色。（二）
課題2腐乳的制作
一、基礎知識?
1、基本原理：腐乳是一種經過微生物發酵的大豆食品。多種微生物參與了豆腐的發酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是 。?
毛霉?
2、毛霉是一種絲狀真菌，生長迅速，具有發達的白色菌絲，分為直立菌絲（所謂的“白毛”）和匍匐菌絲（成形成體，“外皮”），異養需氧型，生殖方式為孢子生殖（無性）。毛霉等微生物產生的 酶能將豆腐中的蛋白質分解成小分子的肽和氨基酸； 酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸，有利于營養物質的消化吸收。
3、選取含水量70%的豆腐，水分過高不容易成形，水分過低溫度和氧氣量不適宜毛霉生長。?
4、毛霉的生長：溫度：15——18℃并保持一定濕度?，可以接種毛霉菌種、5天左右豆腐塊上長滿了毛（霉）。?
課題3制作泡菜并檢測亞硝酸鹽含量
一、基礎知識?
1、微生物： ?，其代謝類型是異養型、厭氧型。在無氧條件下，將糖分解為 ?。常見的乳酸菌有 和 。乳酸桿菌常用于生產酸奶。?
2、亞硝酸鹽為白色粉末，易溶于水，在食品生產中用作食品添加劑。?
3、測定亞硝酸鹽含量的原理：比色法?
在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發生重氮化反應后，與?N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結合形成玫瑰紅色染料，與已知濃度的標準顯色液目測比較，估算泡菜中亞硝酸鹽含量。
?二、實驗操作?
1、泡菜制作過程中乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽的變化情況分析：
發酵時期 乳酸菌 乳酸 亞硝酸鹽 發酵
初期 少(有氧氣，乳酸菌活動受到抑制) 少 增加(硝酸鹽還原菌作用) 發酵
中期 最多(乳酸抑制其他菌活動) 積累增多，pH下降 下降(硝酸鹽還原菌受抑制，部分亞硝酸鹽被分解) 發酵
后期 減少(乳酸積累，pH下降，抑制其活動) 繼續增多， pH繼續下降 下降至相對穩定(硝酸鹽還原菌被完全抑制) 停止
2、有關泡菜制作的幾個問答：
(1)用白酒擦試泡菜壇的目的是：消毒?
(2)菜壇為什么要密封：因為乳酸菌為厭氧型微生物，密封后造成缺氧環境?。若菜壇有裂縫,可能出現的結果：菜壇有裂縫，將導致乳酸菌不能正常生長，而一些雜菌大量繁殖，泡菜會變質
?(3)若制作的泡菜“咸而不酸”，可能的原因是：鹽過多，抑制了乳酸菌的發酵
?(4)加入一些“陳泡菜水”的作用是：提供乳酸菌菌種
專題二?微生物的培養與應用
課題1微生物的實驗室培養
1、培養基：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。
⑴培養基按照物理性質可分為液體培養基（主要用于工業生產）、半固體培養基（觀察細菌運動、鑒別菌種）和 （主要用于菌種的分離、計數、鑒別）。在液體培養基中加入凝固劑瓊脂后，制成瓊脂固體培養基。微生物在固體培養基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。菌落是菌種鑒定的重要依據。
⑵按照培養基的用途，可將培養基分為選擇培養基和鑒別培養基。
⑶培養基的化學成分包括：水 、無機鹽、 、 、生長因子等。
2、無菌技術：獲得純凈培養物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：
3、消毒與滅菌的區別
⑴消毒：使用 的物理或化學方法殺死物體表面或內部一部分微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒常用煮沸消毒法、 （不耐高溫的液體）、化學藥劑消毒、紫外線消毒。
⑵滅菌：則是指使用強烈的理化因素殺死物體內外 ，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。
⑶滅菌方法：①接種環、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；
②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；
③培養基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。
（4）消毒與滅菌的共同點：
①都需借助理化性質營造微生物難以生存的不良環境；
②其作用原理都是通過使蛋白質變性來抑制微生物的生命活動或殺死微生物。
4、制作牛肉膏蛋白胨固體培養基
⑴方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。
①稱量：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取；牛肉膏、蛋白胨易吸潮，稱取要快、加蓋。
②溶化：牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→瓊脂→補水定容→調pH。
思考：溶化時為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?
答：可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中,減少誤差
③倒平板：待培養基冷卻到 ℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。
【教材答案】
1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？
答：還能有效避免操作者自身被微生物感染。
2.培養基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？
答：可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。
3.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？
答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。
4.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？
答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。
5.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？
答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平板培養微生物。
5、純化大腸桿菌
⑴微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。
⑵平板劃線法是通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。數次劃線后培養，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體（菌落）。
⑶稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。
⑷用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。
⑸平板劃線法操作步驟：詳見教材
⑹平板劃線操作的討論：為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？
答：操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。
⑺稀釋涂布平板法中涂布平板操作的步驟：
①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。
②取少量菌液，滴加到培養基表面。
③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8～10s。
④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。
（8）平板劃線法與稀釋涂布平板法各自的優缺點是什么？
①共同點：都能使細菌純化；
②不同點：平板劃線法不易分離出單個菌落，不能計數；稀釋涂布平板法能使單菌落分離，便于計數。
③優缺點： 稀釋涂布平板法統計樣品中的數目往往比實際數目低，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板觀察到的只是一個菌落。
6、菌種培養
將接種后的培養基和一個未接種的培養基（起對照作用）一起放入37℃恒溫箱中培養，分別觀察并記錄結果。
7、菌種的保存
⑴對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。（于4℃的冰箱中保藏。缺點：這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產生變異。）
⑵對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。（菌液與甘油充分混勻后放在-20℃的冷凍箱中保存。）
課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
一、課題背景
尿素---是一種重要的農業氮肥，但尿素不能直接被農作物吸收。只有當土壤中的細菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶。
二、篩選菌株
（1）實驗室中微生物的篩選應用的原理
人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。
（2）選擇培養基
在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱作選擇培養基。
加入青霉素的培養基：細菌不生長，酵母菌、霉菌等真菌能生長；
不加含碳有機物的無碳培養基：分離自養型微生物；
加入高濃度的食鹽的培養基：可選擇培養金黃色葡萄球菌等。
三、統計菌落數目
（1）測定微生物數量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數法。
（2）顯微鏡直接計數法缺點:不能區分死菌與活菌.
（3）稀釋涂布平板法統計樣品中活菌的數目（又叫間接計數法或活菌計數法）
①原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。
②公式：每mL樣品中的菌株數=（C÷V）×M；C代表計數的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液體積，M代表稀釋倍數。
③為了保證結果準確，一般設置3～5個平板（至少3個），選擇菌落數在30～300的平板進行計數，并取平均值。
④缺點：統計的菌落數往往比活菌的實際數目低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統計結果一般用菌落數而不是活菌數來表示。
四、設置對照
設置對照的主要目的是:排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。
五、實驗設計
（1）土壤取樣：從富含有機物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土3cm左右，在距地表約3～8cm的土壤層取樣。
（2）制備培養基：分別配置牛肉膏蛋白胨培養基和以尿素為唯一氮源的選擇培養基。（牛肉膏蛋白胨培養基作為對照,用來判斷選擇培養基是否起到了選擇作用）
（3）樣品的稀釋和涂布：在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，以保證獲得菌落數在30~300之間、適于計數的平板。
①測定土壤中細菌的數量，一般選用104 、 105 、 106倍的稀釋液進行平板培養；
②測定放線菌的數量，一般選用103 、 104 、105倍的稀釋液進行平板培養；
③測定真菌的數量，一般選用102 、 103 、104倍的稀釋液進行平板培養；
（4）微生物的培養: 不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。
①細菌 30~37℃ 1~2天 ②放線菌 25~28℃ 5~7天
③霉菌 25~28℃ 3~4天
(5)計數：每隔24小時統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。
六、操作提示
⑴取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。
⑵應在火焰旁稱取土壤10 g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。
⑶在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行。
⑷實驗時要對培養皿作好標記。注明培養基類型、培養時間、稀釋度、培養物等。
⑸為了提高效率，在操作時更加有條不紊，應當事先規劃時間。
7、菌種鑒定
在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的 將尿素分解成了氨。氨會使培養基的堿性增強，PH 。因此，我們可以通過檢測培養基pH變化來判斷該化學反應是否發生。在以 為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，培養某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變 ，說明該細菌能夠分解尿素。
課題3分解纖維素的微生物的分離
一、實驗的具體操作步驟如下。?
1.土樣采集：方法與本專題課題2類似。土樣的采集要選擇富含 的環境，這是因為在該環境下通常會聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。?
2.選擇培養：培養基的制備參照課本旁欄中的比例配制。
選擇培養的操作：稱取土樣20g，在 條件下加入裝有30mL培養基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養1～2?d，至培養基變混濁。此時可以吸取0.1?mL培養液進行梯度稀釋和涂布平板，也可按課本中所述，重復選擇培養的步驟一次，然后再進行梯度稀釋和涂布平板。?
3.剛果紅染色法分離：?
2、 參考資料?:
1、纖維素：一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質。
2、纖維素與纖維素酶?
（1）棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。?
（2）纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即 、 和 ，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養。?
3、纖維素分解菌的篩選?
（1）篩選方法： 染色法。能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選。?
（2）剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理?
剛果紅是一種染料，它可與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅－纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。因此通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。?
四、分離分解纖維素的微生物的實驗流程：?
土壤取樣→選擇培養→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上→挑選產生透明圈的菌落?
（1）土壤采集??選擇富含纖維素的環境。?
（2）剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟：?倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板?
（3）剛果紅染色法種類?
一種是先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。
專題三 植物的組織培養技術?
課題1 菊花的組織培養
一、植物組織培養的概念
1、概念：植物的組織培養又叫 ，是指在人工培養基上，離體培養植物的器官、組織或細胞，并使其生長、增殖、分化以及再生出植株的技術。
2、植物組織培養的原理： 。
3、細胞全能性的概念：指已分化的細胞具有 的潛能。
4、細胞具有全能性的原因：生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質，都有發育成為完整個體所必需的全部基因.
二、植物組織培養的基礎知識
1、細胞分化：在生物個體發育過程中，細胞在形態、結構和生理功能上出現穩定性差異的過程。細胞分化過程中遺傳物質沒有改變，其實質是 。
2、愈傷組織：細胞排列疏松而無規則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態的 細胞。
3、由高度分化的植物組織或細胞產生愈傷組織的過程，稱為 ，或者叫做去分化。
4、脫分化產生的愈傷組織繼續進行培養，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫 。
5、植物組織培養的過程：

三、影響植物組織培養的因素
1、外植體選取：
（1）不同的植物組織，培養的難易程度差別很大。容易無性繁殖的植物，容易進行組織培養。
（2）植物的種類、材料的年齡和保存時間的長短等都會影響實驗結果。
（3）菊花組織培養一般選擇未開花植物的莖上部新萌生的側枝作材料。
2、培養基的營養成分：
（1）植物組織培養常用的培養基是MS培養基。
（2）MS培養基的主要成分：
①大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S；
②微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co；
③有機物：甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等；
④植物激素：生長素、細胞分裂素、赤霉素等；
（3）各種營養物質的作用：
微量元素和大量元素提供植物細胞生活所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持細胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質主要是為了滿足離體植物細胞對特殊營養的需求。
（4）同微生物培養基的配方相比，MS培養基的配方有哪些明顯的不同？
【答】微生物培養基以有機營養為主，MS培養基則需提供大量無機營養。
3、植物激素：
（1）植物組織培養的關鍵性激素是 。
（2）在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈現加強趨勢。
（3）生長素和細胞分裂素的使用的先后順序、用量的比例等都影響結果。
使用順序 實驗結果
先使用生長素，后使用細胞分裂素 有利于細胞分裂，但細胞不分化
先使用細胞分裂素，后使用生長素 細胞既分裂也分化
同時使用 分化頻率提高




生長素／ 細胞分裂素比值與結果
比值高時 促根分化，抑芽形成
比值低時 促芽分化，抑根形成
比值適中 促進愈傷組織生長






（4）植物組織培養至少使用三種培養基：脫分化培養基、生芽培養基、生根培養基。
4、PH、溫度、光等環境條件：
不同的植物對各種條件的要求往往不同。進行菊花的組織培養，一般將pH控制在5～8左右，溫度控制在18～22℃，并且每日用日光燈照射12h.
四、實驗操作
⑴配制MS固體培養基：
①配制各種母液：大量元素濃縮10倍、微量元素濃縮100倍、用量較小的有機物一般按1mg/ml的質量濃度單獨配置成母液。使用時根據母液的濃縮倍數，計算用量，并加蒸餾水稀釋。
②配制培養基：在菊花組織培養中，可以不添加植物激素，因菊花莖段組織培養比較容易。
③滅菌：采取的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。
⑵外植體的消毒：
流水沖洗——少許洗衣粉——軟刷刷洗——流水沖洗20分鐘——無菌紙吸干—70%酒精搖動2~3次——無菌水沖洗——無菌紙吸干——0.1%氯化汞1~2分鐘——無菌水沖洗至少三次，漂凈消毒液
⑶接種：接種過程中插入外植體時形態學上端朝上，不要倒插。每個錐形瓶接種6～8個外植體。外植體接種與細菌接種相似，操作步驟相同，而且都要求無菌操作。
⑷培養：應該放在無菌箱中進行，并定期進行消毒，保持適宜的溫度（18～22℃）和光照（12h）
⑸移栽：栽前應先打開培養瓶的封口膜，讓其在培養間生長幾日，然后用流水清洗根部培養基。然后將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環境中生活一段時間，進行壯苗。最后進行露天栽培。
⑹栽培
五：外植體在培養過程中被污染的可能原因：
(1)外植體消毒不徹底； ⑵培養基滅菌不徹底； ⑶接種中被雜菌污染； ⑷錐形瓶密封性差等。
專題2?月季的花藥培養
1、被子植物的花粉發育?：
被子植物的雄蕊含花藥，內含有許多花粉。花粉植物的生殖細胞。
?2、?產生花粉植株的兩種途徑：?
①花藥中的花粉—（脫分化）—胚狀體—（分化）—叢芽?（誘導）--生根---移栽?
②花藥中的花粉--（脫分化）—愈傷組織—（再分化）--叢芽?????????
3、影響花藥培養的因素:?材料的選擇與培養基的組成是主要的影響因素?
·親本的生理狀況：早期的花藥比后期的更容易產生花粉植株，選擇月季的初花期。?
·花蕾：選擇完全未開放的花蕾
?4、實驗操作?
（1）材料的選取：選擇花藥時，一般要通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發育期。最常用的方法是醋酸洋紅法。
（2）材料的消毒:70%酒精浸泡30s---無菌水清洗---0.1%氯化汞浸泡2-4min---無菌水沖洗?
（3）接種和培養?
注意：①植物組織培養技術與花藥培養技術的相同之處是：培養基配制方法、無菌技術及接種等基本相同。?②?兩者的不同之處在于：花藥培養的選材非常重要，需事先摸索時期適宜的花蕾；花藥裂開后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時更換培養基；花藥培養對培養基配方的要求更為嚴格。這都使花藥培養的難度大為增加。
?5、菊花組織培養和月季的花藥培養的區別：?
(1)材料的選取：菊花的組織培養實驗中，應選擇未開花植株的莖上部新萌生的側枝；月季的花藥培養實驗中，應選擇花粉發育過程中的單核期的花粉進行培養。?
(2)外植體消毒：所用消毒劑為體積分數為70%的酒精和質量分數為0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是無菌水。?
(3)培養過程：在初期，菊花的組織培養需光照，月季的花藥培養不需光照；而在后期均需光照??





酶

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