資源簡介

選修一 生物技術實踐
第一講 微生物的利用
考綱解讀
知識內容
考試屬性及要求
加試
微生物的培養和利用
大腸桿菌的培養和分離
實驗與探究能力
分離以尿素為氮源的微生物
實驗與探究能力
基礎知識
考點一 微生物的實驗室培養
一、培養基
1.培養基：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。
2.成分：一般都含有碳源、氮源、水和無機鹽，還需要適宜的PH、溫度及特殊營養物質、氧氣，以滿足微生物生長的要求。
3.牛肉膏蛋白胨固體培養基的配置流程：計算→稱量→熔化→滅菌→倒平板
4.培養基的種類及作用：
劃分
標準
培養基種類
特點
用途
按物理性質分
液體培養基
不加凝固劑
工業生產、擴大培養
半固體培養基
加凝固劑，如瓊脂
運動、保藏菌種
固體培養基
分離、鑒定、計數
按成分來源分
天然培養基
化學成分是天然物質
工業生產
合成培養基
將所需化學成分按需要和比例配制而成
分類、鑒定
按用
途分
選擇培養基
抑制不需要的微生物生長，促進所需微生物生長
如培養基中加青霉素，可選出酵母菌、霉菌等真菌，而細菌則不能生長
鑒定培養基
加入某種化學物質或顯色劑，鑒別不同種類的微生物
如培養基中加伊紅美藍試劑，可鑒別飲用水等食品中是否有大腸桿菌，若有，則菌落呈深紫色，帶金屬光澤
二、細菌的分離方法
1. 劃線分離法
（1）方法：用接種環蘸菌液后在含有固體培養基的培養皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細菌間的距離加大。在培養10～20h后，可由一個細菌產生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產生的后代。
（2）操作步驟：將培養皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態，在火焰旁將培養皿稍微打開。在此同時，用環狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養皿內，在平板培養基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉動培養皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養皿邊緣，也不要將培養基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養。
（3）操作注意事項
①取菌種前，灼燒接種環的目的是消滅接種環上的微生物；
②除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環的目的是消滅接種環上殘留菌種；
③取菌種和劃線前都要求接種環冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；
④最后灼燒接種環的目的是防止細菌污染環境和操作者。
2. 涂布分離法：先將培養的菌液稀釋，通常稀釋到10－5 ～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養皿的固體培養基上，用玻璃刮刀涂布在培養基平面上進行培養，在適當的稀釋度下，可產生相互分開的菌落。通常每個培養皿有20個以內的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養后，再做功能性實驗。
3.比較：劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復雜些。
三、無菌技術
1．無菌技術：為避免外來雜菌的污染，應注意：
①對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；
②將培養器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌；
③為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰旁進行；
④避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。
2．消毒方法：
①煮沸消毒法：日常生活常用方法；
②巴氏消毒法（80℃，煮15分鐘）：對一些不耐高溫的液體；
③化學藥劑消毒：實驗操作者的雙手使用酒精進行化學消毒；
④紫外線消毒法：對接種室、接種箱或超凈工作臺等實驗空間。
3．滅菌方法：
①灼燒滅菌法：如接種環、接種針、試管口等；
②高壓蒸汽滅菌法（100kPa,121℃，15～30min）：如培養基、無菌水等，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；
③干熱滅菌法（160～170℃，1～2h）：如玻璃器皿、金屬用具等不能受潮的實驗器具。
4．消毒和滅菌的比較：
比較項
理化因素的作用強度
消滅微生物的數量
芽孢和孢子能否被消滅
消毒
較為溫和
部分生活狀態的微生物
不能
滅菌
強烈
全部微生物
能
考點二 大腸桿菌的培養和分離
1. 細菌是單細胞的原核生物。與真核細胞相比，細菌無成型的細胞核，其細胞壁由肽聚糖組成。不同細菌細胞壁結構不同，細菌可分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩類。革蘭氏陽性菌細胞壁厚，無莢膜，多產生外毒素，染色后呈藍紫色；革蘭氏陰性菌細胞壁薄，有莢膜，多產生內毒素，染色后呈紅色。革蘭氏陽性菌對青霉素更為敏感。
2. 大腸桿菌是革蘭氏陰性、異氧兼性厭養型的腸道桿菌。在腸道中一般對人無害，但任何大腸桿菌進入人的泌尿系統，都會對人體產生危害。大腸桿菌在基因工程技術中被廣泛的應用，它的質粒是最常用的運載體，它也是基因工程中常用的受體細胞。
3.一般用LB液體培養基來擴大培養大腸桿菌，用LB固體培養基來劃線分離大腸桿菌。
4.大腸桿菌的培養和分離試驗流程
①培養基滅菌：將剛配置好的50ml LB液體培養基和50ml LB固體培養基分別裝入兩個250ml的三角瓶中，加上封口膜，用高壓鍋進行滅菌。
②倒平板：在酒精燈火焰旁將固體培養基分別倒在4個培養皿中，放置于水平位置并輕輕晃動，使培養基鋪平培養皿底部，待凝固后即形成平板。
③接種擴大培養：靠近酒精燈火焰旁將大腸桿菌接種到三角瓶的LB液體培養基中，三角瓶在37℃，每分鐘200轉的搖床中震蕩培養12h。
④劃線分離：將在搖床上培養12h的菌液在固體培養基的平板上連續劃線，然后將蓋好的培養皿倒置，放在37℃恒溫培養箱中進行培養，12～24h后，可看到在劃線的末端出現不連續的單個菌落，表明菌已被分離。
⑤菌種保存：在無菌操作下將單菌落用接種環取出，再用劃線分離法接種在空白斜面上，在37℃下培養24h后，置于4℃冰箱中保存。
考點三 分離以尿素為氮源的微生物
1．實驗原理：土壤環境中有一些細菌含有脲酶，它們可以通過降解尿素作為其生長的氮源。尿素分解的化學方程式為：（NH2）2C=O+H2O→2 NH3+CO2。尿素在脲酶的降解下產生NH3，使培養基的pH由原來的中性變為堿性，于是培養基中的酚紅由紅黃色變成紅色。
2. 實驗步驟：
（1）制備培養基：在60℃左右時，將兩個三角瓶中已滅菌的LB固體培養基和尿素固體培養基，在酒精燈火焰旁分別倒入兩個培養皿中，搖勻后平放至凝固。
（2） 制備細菌懸液：在無菌條件下，將土樣1g加到有99ml無菌水的三角瓶中，震蕩10min，即成10-2土壤稀釋，依此方制備出10-3、10-4和10-5的土壤稀釋液。
（3）涂布分離：取10-4和10-5土壤稀釋液各0.1ml，分別加到有LB培養基和尿素培養基的培養皿中，再將保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精燈火焰上，待刮刀上的火焰熄滅，在酒精燈火焰旁打開培養皿，將菌液涂布到整個平面上。
（4）培養：將培養皿倒置，在37℃恒溫培養箱中培養24～48h。
（5）觀察：觀察菌落數。
3.實驗結果：LB全營養固體培養基上的菌落多而雜；尿素固體培養基上的菌落少而純。
4.注意事項：
①實驗土樣要從有哺乳動物排泄物的地方取得。
②本實驗需設置對照，即以LB全營養培養基為對照組，以尿素唯一氮源、其它營養條件與對照組相同的尿素固體培養基為實驗組。實驗組的菌落數目少于對照組的菌落數目。
③尿素溶液需用G6玻璃漏斗過濾，目的是濾去細菌。
④本實驗用涂布分離法分離細菌。實驗中要用70%酒精對玻璃刮刀進行消毒并灼燒滅菌。
⑤本實驗配制固體培養基時要添加瓊脂糖，而不使用瓊脂，是因為瓊脂中含有氮元素，這樣可以排除瓊脂中氮元素對實驗結果的干擾。
⑥本實驗尿素培養基中還加入了酚紅作指示劑，因為尿素被尿酶分解后產生的氨與該指示劑顯紅色。可根據細菌菌落周圍紅色環狀區域大小判斷細菌 分解尿素能力的大小。

第二講 酶的應用
考綱解讀
知識內容
考試屬性及要求
加試
酶的應用
果汁中的果膠和果膠酶
實驗與探究能力
α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測
實驗與探究能力
基礎知識
考點一 果汁中的果膠和果膠酶
一、果膠
1．存在：植物細胞壁及胞間層的主要成分。
2．成分：由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯組成。
3．特性：果膠不溶于乙醇，因而可用乙醇提取溶液中的果膠。
二、果膠酶
1．來源：黑曲霉、蘋果青霉
2．組成：果膠酶是分解果膠一類酶的總稱，主要包括果膠酶和果膠甲酯酶。
3．作用：將果膠分解為可溶性小分子，一方面可以使果汁澄清，另一方面也可以提高出汁率。
三、探究利用蘋果或山楂勻漿制作果汁的最佳條件的實驗
1．實驗原理
（1）果膠在果膠酶和果膠甲酯酶的作用下分解為半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯。
（2）果膠酶的活性受溫度（或pH）的影響，處于最適溫度（或最適pH）時活性最高。果肉的出汁率、果汁的澄清度與果膠酶的活性大小呈正相關。
（3）果膠不溶于乙醇。
2．實驗流程
第一步
制勻漿
第二步
燒杯A
燒杯B
5g勻漿
5g勻漿
10ml黑曲霉提取液
10ml水
間歇攪拌20～30min
第三步
試管1
試管2
試管3
試管4
A燒杯混合物4ml
A燒杯混合物4ml
B燒杯混合物4ml
B燒杯混合物4ml
沸水浴
不加熱
沸水浴
不加熱
較澄清
最澄清
最渾濁
較混濁
第四步
加入95%酒精4ml
沉淀物較少
沉淀物最少
沉淀物最多
沉淀物較多
3．實驗結論：果膠酶能分解果膠，提高果汁的澄清度。
考點二 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測
1．固定化酶：將水溶性的酶用物理或者化學的方法固定在某種戒介質上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。
2．特性：固定化酶具有易儲存、運輸和可重復利用等多種優點。
3．固定化的方法：吸附法、共價偶聯法、交聯法、包埋法等。
4．α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測
（1）固定α－淀粉酶的方法：吸附法，載體是石英砂。
（2）實驗原理：常用的淀粉指示劑是KI-I2溶液，遇淀粉顯藍色。淀粉的水解產物不同，顯色也不同。
（3）實驗過程
（4）注意事項
①在固定化α-淀粉酶后，用10倍柱體積的蒸餾水洗滌注射器以除去未吸附的游離淀粉酶。
②實驗結束后，用10倍柱體積的蒸餾水洗滌此柱是為了洗去殘留的淀粉溶液和產物。

第三講 生物技術在食品加工中的應用
考綱解讀
知識內容
考試屬性及要求
加試
生物技術在食品加工中的應用
果酒及果醋的制作
實驗與探究能力
泡菜的腌制和亞硝酸鹽的測定
實驗與探究能力
基礎知識
考點一 果酒及果醋的制作
一、果酒的制作
1. 原理：酵母菌只有在無氧條件下，才能進行酒精發酵。
2. 反應式：C6H12O6+6O2+6H2O→6CO2+12H2O
3. 實驗步驟(裝置如圖)
（1）方法一：用葡萄制作葡萄酒流程
沖洗→榨汁→制作酵母懸液→裝瓶→酒精發酵→過濾、分裝、保存
（此方法制作的葡萄酒不含糖，酒精量也低，平均的體積分數為8%。）
（2）方法二：用果汁制作果酒流程
制取果汁→配料（加入蔗糖、果汁、酵母懸液）→發酵→過濾、分裝、保存
（此方法制作的果酒酒精含量較高，體積分數約為15%，糖含量也較高。）
4. 實驗要點
（1）釀酒的微生物是酵母菌，菌種的不同，所產生的酒的風味也不同。
（2）酵母菌只有在無氧條件下，才能進行酒精發酵，且當培養液中酒精濃度超過16%時，酵母菌就會死亡。
（3）本實驗葡萄的消毒用鮮紅紫色的高錳酸鉀溶液浸泡5min，再用清水沖洗。葡萄皮上本來已經有野生酵母存在，但為了加快發酵速度，還要另外添加干酵母。
（4）酒精發酵裝置中使用彎曲的玻璃管，即可以隔絕空氣，保持無氧環境，同時還能避免雜菌進入，還可以使產生的二氧化碳氣體排出容器，保持壓強平衡。
（5）發酵瓶中的溶液量不能超過容積的2/3。裝得太滿則發酵過程中溶液易溢出。發酵溫度應在25～30℃為宜。當瓶內停止出現氣泡表示發酵完畢。
（6）用純葡萄制作的葡萄酒不含糖，酒精含量也低（平均的體積分數為8%）。若要制作酒精含量（體積分數約為15%）和糖含量都較高的果酒，可用果汁制作葡萄酒，發酵液中應該加入一定的蔗糖。發酵開始時，酵母菌進行有氧呼吸，由于其細胞呼吸底物不是葡萄糖，消耗的氧氣多，產生的二氧化碳少，發酵瓶會出現負壓。獲得的果酒可用虹吸法取出。
二、果醋的制作
1. 原理：
（1）若氧氣、糖源都充足時，醋桿菌將糖分分解成醋酸。
（2）若缺少糖源時，醋桿菌在有氧條件下能把乙醇氧化為醋酸。
2. 反應式
（1）氧氣、糖源充足：C6H12O6+2O2→2CH3COOH+2CO2+2H2O
（2）缺少糖源、氧氣充足：C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O
3. 實驗步驟（裝置如圖）
把800ml酒-水混合物倒入甲瓶中→醋酸發酵在乙瓶中（裝鋸末至八分滿，將適量醋化醋桿菌的培養物或醋曲懸液加在200ml酒-水混合物中混勻，調pH至7.0后倒入乙瓶中，使鋸末均勻濕透）→向乙瓶內通入空氣，不必太快（通氣管內含有脫脂棉球，不要塞的太緊，用以過濾空氣）→醋酸發酵約48小時后，用pH試紙檢查乙瓶中流出液的pH。若呈明顯酸性→調節活塞，使甲瓶滴入乙瓶的液體流量約為每5min1滴，使滴入丙瓶中的液體也是約為每5min1滴→每天用pH試紙檢測流出液的pH，監控發酵進行的情況。等流出液的pH不再減少，或者甲瓶中的液體全部流入乙瓶時，停止實驗。
4. 實驗要點
（1）與醋制作有關的微生物是醋桿菌，菌種的不同，所產生的醋的風味也不同。
（2）醋桿菌只有在有氧條件下，才能將乙醇氧化為醋酸。用醋桿菌發酵，培養液中醋酸含量可以達到13%。
（3）因為是需氧發酵，因此在發酵過程中，必須不斷向裝置中的乙瓶通入無菌空氣，通氣的玻璃管塞上脫脂棉，可以過濾空氣，避免雜菌感染。
（4）發酵過程中，甲瓶流入乙瓶的液體流量應當等于乙瓶流入丙瓶的液體流量，流速大約是每5min1滴。
三、果酒和果醋制作的比較
比較項目
酒精發酵
醋酸發酵
微生物
酵母菌
醋桿菌
條件
無氧
有氧
實驗現象
氣味和味道
酒味
酸味
氣泡和泡沫
有氣泡和泡沫
無氣泡和泡沫
發酵液顏色
渾濁
渾濁，液面形成白色菌膜
流程
挑選新鮮的水果→沖洗→榨汁→酒精發酵→醋酸發酵
聯系
酒精發酵為醋酸發酵提供乙醇
考點二 泡菜的腌制和亞硝酸鹽的測定
一、泡菜腌制
1. 泡菜腌制過程中起作用的菌類主要是：假絲酵母和乳酸菌。但這類食品含有一定量的對人體有害的致癌物質――亞硝酸鹽。
2.泡菜腌制過程
（1）各種菜洗凈切成3～4cm長的小塊。
（2）將泡菜壇洗凈，并用熱水洗壇內壁兩次。
（3）將各種蔬菜、鹽水、糖及調味品放入壇中，混合均勻。如果希望發酵快些，可將蔬菜在開水中浸1min后入壇，再加入一些白酒。
（4）將壇口用水封好，防止外界空氣進入。
（5）腌制1周左右即可開壇食用，也可隨時加入新鮮蔬菜，不斷取用。
（6）如果加入一些已經腌制過的泡菜汁更好，這相當于已經擴增的發酵菌，可減少腌制時間。
3.實驗要點
（1）腌制泡菜時加入白酒可抑制泡菜表面雜菌的生長，也是一種調味劑，可增加醇香感。
（2）泡菜壇內的白膜是由于產膜酵母的繁殖而形成的。
（3）用水封閉壇口可起到空氣隔絕的作用，有利于壇內蔬菜中天然存在的乳酸菌進行乳酸發酵。
（4）亞硝酸鹽是由硝酸鹽還原菌促進硝酸鹽還原形成的，而不是消化細菌氧化氨形成的。
4.泡菜腌制過程中各物質的變化
發酵時期
乳酸菌
乳酸
亞硝酸鹽
發酵初期
少（有O2，乳酸菌活動受抑制）
少
增加（硝酸鹽還原菌的作用）
發酵中期
最多（乳酸抑制其他菌活動）
積累增多，pH下降
下降（硝酸鹽還原菌活動受抑制，部分亞硝酸鹽被分解）
發酵后期
減少（乳酸繼續積累，pH繼續下降，抑制乳酸菌活動）
繼續增多，pH繼續下降
下降至相對穩定（硝酸鹽還原菌被完全機制）
二、亞硝酸鹽的測定
1. 測定亞硝酸鹽含量的原理
在鹽酸酸化的條件下，亞硝酸鹽可與對氨基苯磺酸發生重氮化反應，這一產物再與N-1-萘基乙二胺偶聯 ，形成紫紅色產物。
2.檢測方法：亞硝酸鹽含量不同，顏色深淺也不同，可用光電比色法測定泡菜中的亞硝酸鹽的含量。測定時，所測溶液的顏色要與亞硝酸鈉標準溶液的顏色進行比對。

第四講 淺嘗現代生物技術
考綱解讀
知識內容
考試屬性及要求
加試
植物組織培養
植物的組織培養
實驗與探究能力
基礎知識
考點一 植物組織培養
一、植物組織培養
1.組織培養：就是取一部分植物組織，如葉、芽、莖、根、花瓣或花粉等，在無菌條件下接種在三角瓶中的瓊脂培養基上，給予一定的溫度和光照，使之產生愈傷組織，進而生根發芽。
2.培養基
（1）本實驗需要配制三種培養基，即：MS培養基、發芽培養基、生根培養基。
（2）MS培養基：為液體培養基，由大量元素、微量元素和有機成分組成。
（3）發芽培養基：在MS培養基的基礎上添加了生長素、細胞分裂素兩類激素和瓊脂等物質，是固體培養基。
（4）生根培養基：在MS培養基的基礎上添加了生長素一類激素和瓊脂等物質，是固體培養基。
3.植物組織培養過程：
4.實驗要點
（1）愈傷組織培養時，最初避光培養，后期見光培養。
（2）植物激素對再分化的影響
細胞分裂素/生長素比例
對再分化的影響
高
發芽
低
生根
相當
繼續生長不分化
（3）實驗中用到的激素都是人工合成的，如類似生長素作用的奈乙酸（NAA），類似細胞分裂素作用的芐基腺嘌呤（BA）。人工合成的激素作用時間比天然的植物激素作用時間長，是因為植物缺少分解人工合成激素的酶。
二、菊花的組織培養
1.實驗原理：植物細胞的全能性
2.實驗操作流程
配置培養基→菊花外植體消毒→接種至發芽培養基→叢壯苗→轉入生根培養基→生根→移栽至草炭土或蛭石中→鍛煉（煉苗）→定植→長成植株
3.實驗要點
（1）外植體消毒方法：先在70%乙醇中浸泡10min，再放入5%次氯酸鈉溶液總浸泡5min，然后用另一5%次氯酸鈉浸泡5min，最后在超凈臺中用無菌水清洗。
（2）鍛煉（煉苗）：待生根后，將苗移至草炭土或蛭石中，保持80%以上的濕度，2～3天后逐漸降低濕度進行鍛煉，直到處于自然濕度下為止。
（3）在菊花植物組織培養中，可以不添加植物激素，因為其莖段培養較為容易。

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