資源簡(jiǎn)介

課題3　血紅蛋白的提取和分離
一覽眾山小
三維目標(biāo)
1.嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離，體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法。?
2.簡(jiǎn)述色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。通過(guò)查資料或?qū)嶋H操作，理解這些方法的運(yùn)用過(guò)程。提高搜集獲取信息、分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力。
學(xué)法指導(dǎo)
本節(jié)從課題背景著手引出本節(jié)重點(diǎn)是凝膠色譜法的原理和方法。理解凝膠色譜法的原理，可以結(jié)合教科書(shū)上的插圖，對(duì)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和過(guò)程有一個(gè)直觀的認(rèn)識(shí)。具體實(shí)驗(yàn)中要注意凝膠拄充填時(shí)，應(yīng)注意那些事項(xiàng)。電泳的原理以及常用的兩種方法是本課題的重點(diǎn)內(nèi)容。
誘學(xué)導(dǎo)入

材料：天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（約占80%）及瓊脂膠組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。
問(wèn)題：為什么運(yùn)用電泳法能達(dá)到分離生物大分子的目的？?
導(dǎo)入：電泳利用了各種生物大分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生了不同的遷移速度，從而達(dá)到分離各種分子的目的。專題5
DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)
課題3
血紅蛋白的提取和分離
教材習(xí)題點(diǎn)撥
（一）旁欄思考題
你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？
答：凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)數(shù)的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。
（二）練習(xí)
1．答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類(lèi)化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。此外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子質(zhì)量大的分子通過(guò)這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空隙時(shí)阻力大，而相對(duì)分子質(zhì)量小的分子通過(guò)時(shí)阻力小，因此不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離。
2．答：在一定范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液。
緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH不變。在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過(guò)程都是在精確的pH下進(jìn)行的，受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程有與體內(nèi)過(guò)程完全相同的pH。
3．答：電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。
4．答：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。
5．答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。專題5
DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)
課題1
DNA的粗提取與鑒定
教材習(xí)題點(diǎn)撥
（一）旁欄思考題
1．為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？
答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA。
2．加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？
答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
3．如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？
答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。
4．此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？
答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。
5．為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？
答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。
6．方案二與方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。
（二）練習(xí)
1．答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。
2．答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是因?yàn)椋cDNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒(méi)有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。課題1　DNA的粗提取與鑒定
一覽眾山小
三維目標(biāo)
1.簡(jiǎn)述DNA的物理化學(xué)性質(zhì)、鑒定DNA的方法、DNA的溶解性，并在此基礎(chǔ)上理解DNA粗提取的原理。?
2.描述DNA粗提取和鑒定的主要過(guò)程，建立對(duì)DNA的感性印象。?
3.認(rèn)同生物學(xué)科和物理、化學(xué)等學(xué)科協(xié)同發(fā)展的關(guān)系，理解科學(xué)工作者提純生物大分子的艱辛。
學(xué)法指導(dǎo)
實(shí)驗(yàn)前，大家要學(xué)會(huì)比較各種實(shí)驗(yàn)材料的優(yōu)劣并選擇理想實(shí)驗(yàn)材料。在操作過(guò)程中，要注意分析主要操作步驟的目的和意義，特別要注意比較相同操作的目的，例如，兩次加入蒸餾水，兩次析出，多次用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌等。跟蹤含DNA的物質(zhì)在濾液和濾渣之間的過(guò)渡，并分析每一次過(guò)濾為什么能去掉雜質(zhì)，并嘗試用流程圖的形式記錄操作過(guò)程。
誘學(xué)導(dǎo)入
材料：
1944年，艾弗里等人從光滑型(S型)肺炎雙球菌中分別提取DNA、蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)，并將上述每一種物質(zhì)單獨(dú)放入粗糙型(R型)肺炎雙球菌的培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有DNA能使一部分粗糙型肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化為光滑型。并首次提出DNA是肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化因子，但是這一結(jié)論，并沒(méi)有得到很多科學(xué)家的支持。直到后來(lái)艾弗里等人又設(shè)置了多組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，才最終使其他科學(xué)家信服了他們的結(jié)論，為DNA是遺傳物質(zhì)提供了有力的實(shí)驗(yàn)支持，這在分子遺傳學(xué)上具有極其重要的意義。
問(wèn)題：科學(xué)家為什么不支持艾弗里等人的結(jié)論？艾弗里又設(shè)置了哪些對(duì)照實(shí)驗(yàn)？

導(dǎo)入：受當(dāng)時(shí)技術(shù)水平的限制，提純生物大分子的技術(shù)很不成熟，從光滑型(S型)肺炎雙球菌中分別提取DNA、蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)的純度很低，不能排除轉(zhuǎn)化大分子中雜質(zhì)的作用，要分析為什么提取過(guò)程中含有雜質(zhì)，會(huì)含有哪些雜質(zhì)。艾弗里通過(guò)設(shè)置對(duì)照發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化率與供體菌細(xì)胞的DNA純度有關(guān)，DNA越純，轉(zhuǎn)化率也就越高，如果事先用DNA酶降解供體菌細(xì)胞中的DNA，那么轉(zhuǎn)化作用就不復(fù)存在了，用酶避免了提取DNA不純的問(wèn)題，從反面證明了轉(zhuǎn)化作用是由DNA引起的。專題5
DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)
課題2
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段
庖丁巧解牛
知識(shí) 巧學(xué)
一、PCR原理
1.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（又稱PCR技術(shù)）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。
2.用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程類(lèi)似。
要點(diǎn)提示
DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械摹榱嗣鞔_表示DNA的方向，通常將DNA的羥基末端稱為3′端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5′端。DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從引物的3′端延伸DNA鏈。
辨析比較
DNA聚合酶和DNA連接酶?
（1）DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。
?
（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。因此DNA連接酶不需要模板。
3.在80～100
℃范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱為變性。當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。
疑點(diǎn)突破
Taq
DNA聚合酶是從Thermus
aquaticus菌提取的熱穩(wěn)定性酶，分子量大約為94
kDa。這種酶的天然形式可在74
℃復(fù)制DNA，
Taq
DNA聚合酶在鎂存在的條件下可催化核苷酸沿5′→3′方向發(fā)生聚合反應(yīng)，形成雙鏈DNA。
二、PCR的反應(yīng)過(guò)程
PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。
1.變性　當(dāng)溫度上升到90
℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。
2.復(fù)性　溫度下降到50
℃左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。
3.延伸　溫度上升到72
℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。
要點(diǎn)提示
PCR的反應(yīng)過(guò)程和DNA的復(fù)制過(guò)程的區(qū)別：體外DNA進(jìn)行、不需解旋酶、條件不同。PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供：DNA模板、兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA的復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。
三、實(shí)驗(yàn)操作?
1.用微量移液器，按照下列配方在微量離心管中依次加入各組分?
PCR反應(yīng)體系的配方?
10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液　　　　　　　　　　　　
5
μL?
20
mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液
1
μL?
20
mmol/L的引物Ⅰ
2.5
μL?
20
mmol/L的引物Ⅱ
2.5
μL?
H2O
28～33
μL?
1～5
U/mL的Taq
DNA聚合酶
1～2
U?
模板DN
A5～10
μL?
總體積
50
μL
2.參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序
循環(huán)數(shù)
變性
復(fù)性
延伸
第1次
94
℃,10
min
——
——
30次
94
℃,30
s
55
℃,30
s
72
℃,1
min
最后1次
94
℃,1
min
55
℃,30
s
72
℃,1
min
問(wèn)題 探究
?
問(wèn)題1
PCR技術(shù)怎樣擴(kuò)增DNA ?
探究:待擴(kuò)增DNA模板加熱變性后，兩引物分別與兩條DNA鏈的兩端序列實(shí)現(xiàn)特異性復(fù)性結(jié)合。此時(shí)，兩引物的3′端相對(duì)，5′端相背，擴(kuò)增的片段由5′端向3′端延伸。在適當(dāng)?shù)膒H和離子強(qiáng)度下，由TaqDNA聚合酶催化引物的延伸。?
上述反應(yīng)過(guò)程是通過(guò)溫度控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。熱變性—復(fù)性—延伸的一個(gè)周期過(guò)程稱為一個(gè)PCR循環(huán)。PCR全過(guò)程就是在適當(dāng)條件下的這種循環(huán)的多次重復(fù)。首次PCR中延伸的產(chǎn)物在進(jìn)入第二次循環(huán)變性后，再與引物互補(bǔ)，充當(dāng)引導(dǎo)DNA合成的新模板。因此，第二輪循環(huán)后，模板由首輪循環(huán)后得到的4條增為8條（包括原始模板在內(nèi)），以此類(lèi)推，以后每一循環(huán)后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。從理論上講，擴(kuò)增DNA產(chǎn)量可呈指數(shù)上升，即n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)量為2n?拷貝。
問(wèn)題2
引物的特點(diǎn)是什么？?
思路:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。?
探究:（1）引物長(zhǎng)度：15～30
bp，常用為20
bp左右。?
（2）引物擴(kuò)增跨度：以200～500
bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10
kb的片段。
?
（3）引物3′端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。?
（4）引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其他序列無(wú)明顯同源性。
典題 熱題
例1關(guān)于PCR引物的下列說(shuō)法，不正確的是（　　）?
A.引物是PCR過(guò)程中與模板DNA部分序列互補(bǔ)，并能引導(dǎo)模板DNA的互補(bǔ)鏈合成的（脫氧）核苷酸序列?
B.引物常根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列用化學(xué)合成的方法獲得?
C.DNA聚合酶只能使DNA鏈從引物的3′端開(kāi)始向引物的5′端延伸?
D.引物的3′端必須具有游離的-OH基團(tuán)?
解析：DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；延伸DNA鏈?zhǔn)菑?′端向3′端延伸。?
答案：C
例22002年4月，以杭州華大基因研究中心和浙江大學(xué)生物信息研究中心為主體的中國(guó)科學(xué)家協(xié)會(huì)成功破譯了水稻基因的信息。下圖1表示DNA測(cè)序儀顯示的堿基序列，則圖2中顯示的堿基序列為（　　）?
A.AGGTT　　?　B.ATTGG?　　
C.TAAGG　　　
D.TGGAA?
解析：本題為信息題，通過(guò)分析圖1可知由上到下代表的是脫氧核苷酸序列，數(shù)字代表的是脫氧核苷酸的種類(lèi)。?
答案：B專題5
DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)
課題1
DNA的粗提取與鑒定
庖丁巧解牛
知識(shí) 巧學(xué)

一、提取DNA的方法?
1.基本思路?
利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
2.DNA的理化性質(zhì)?
（1）DNA的溶解性，DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，此外，DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用上述特點(diǎn)可達(dá)到分離DNA的目的。?
（2）DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性,蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80
℃的高溫，而DNA在80
℃以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。
要點(diǎn)提示
DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：當(dāng)NaCl溶液濃度低于?0.14
mol/L?時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當(dāng)NaCl溶液濃度高于?0.14
mol/L?時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。
3.DNA的鑒定
DNA遇二苯胺（沸水浴）會(huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定Ｄ.Ａ的試劑。
知識(shí)拓展
蛋白質(zhì)的溶解度與鹽溶液濃度的關(guān)系：在中性鹽溶液中，低濃度時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度較高即鹽溶現(xiàn)象；高濃度時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度較低，并可析出即鹽析現(xiàn)象。
二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)?
1.實(shí)驗(yàn)材料的選取?
一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難。
2.破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液?
以動(dòng)物細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，破碎細(xì)胞較容易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。以植物細(xì)胞為材料時(shí)，充分研磨破壞了細(xì)胞壁，洗滌劑中的表面活性劑成分能夠與膜蛋白結(jié)合從而破壞細(xì)胞膜，這些為核DNA的釋放提供了通道。
3.去除濾液中的雜質(zhì)?
根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)。
4.DNA的析出與鑒定
難點(diǎn)剖析
在DNA的析出步驟中，用玻璃棒攪拌時(shí)，注意動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較少，再被玻璃容器吸附一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過(guò)程中的DNA損失。
辨析比較
（1）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有兩次需要加入蒸餾水，第一次的目的是使紅細(xì)胞膜破裂，第二次的目的是稀釋NaCl溶液使其濃度降低至0.14
mol/L，使DNA沉淀析出。?
（2）兩次析出DNA所依據(jù)的原理也不同：①DNA在NaCl溶液濃度為0.14
mol/L時(shí)溶解度最低；②DNA在冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精中能沉淀析出。
問(wèn)題 探究
?
問(wèn)題1
析出DNA時(shí)為什么要用冷卻的酒精溶液？?
思路:DNA溶于一定濃度的NaCl溶液，但不溶于酒精，而且冷卻的酒精可以降低分子運(yùn)動(dòng)，有利于DNA的聚合和析出，同時(shí)低溫有利于增加DNA分子的柔韌性以減少斷裂，便于用玻璃棒卷起。此外，冷卻的酒精還可以降低并抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解，從而提取到較多的DNA物質(zhì)。?
探究:可以通過(guò)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，向含有DNA物質(zhì)的濾液中分別加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻酒精和常溫態(tài)酒精，比較最終獲得的白色絲狀物的數(shù)量。
問(wèn)題2
制備雞血細(xì)胞液時(shí)，為什么要在新鮮的雞血中加入檸檬酸鈉？?
思路:制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入抗凝劑——檸檬酸鈉，防止血液凝固。其原理是檸檬酸鈉能與血漿中Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的Ca2+大大減少，血液便不會(huì)凝固，因?yàn)殡u血紅細(xì)胞、白細(xì)胞都有細(xì)胞核，DNA主要存在于細(xì)胞核中，所以在離心或靜置沉淀后，要棄出上層清液——血漿。?
探究:雞血中加入檸檬酸鈉和不加入檸檬酸鈉的血液狀態(tài)如何？得到的淡黃色半透明的液體的成分有何不同？
典題 熱題
例1本實(shí)驗(yàn)中有三次過(guò)濾，以下三次過(guò)濾分別為了獲得（　　）?
①過(guò)濾用蒸餾水稀釋過(guò)的雞血細(xì)胞液　②過(guò)濾含黏稠物的0.14
mol/L的NaCl溶液　③過(guò)濾溶解有DNA的2
mol/L的NaCl溶液?
A.含核物質(zhì)的濾液、紗布上的黏稠物、含DNA的濾液?
B.含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA黏稠物、含DNA的濾液?
C.含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA黏稠物、紗布上的DNA?
D.含較純的DNA濾液、紗布上的黏稠物、含DNA的濾液?
解析：用蒸餾水稀釋雞血細(xì)胞液，使血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜破裂，釋放出核物質(zhì)，此時(shí)過(guò)濾只能得到含DNA和其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濾液，這種濾液必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)中其他步驟的相繼處理，方能得到較純的DNA。DNA在0.14
mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，成絲狀黏稠物，可經(jīng)過(guò)濾留在紗布上。?
答案：A
方法歸納
過(guò)濾操作的目的無(wú)非兩種，獲得濾液，獲得濾渣，關(guān)鍵是分析DNA存在于那種組分里面，根據(jù)提取DNA的原理，DNA在0.14
mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，DNA沉淀析出，存在于濾渣中，DNA在2
mol/L的NaCl溶液中溶解度較高，DNA存在于濾液中。
例2下列關(guān)于DNA的粗提取和鑒定的有關(guān)說(shuō)法，正確的是（　　）?
A.DNA在NaCl溶液中的溶解度隨NaCl溶液濃度的增大而增大?
B.溶有DNA的NaCl溶液中加入4mL二苯胺試劑即變藍(lán)色
?
C.DNA粗提取和鑒定時(shí)，選材最好用雞血而不用豬血
?
D.提取洋蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，食鹽有利于DNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)?
解析：本題考查DNA的粗提取和鑒定中相關(guān)步驟的模糊點(diǎn)。需要對(duì)每一個(gè)選項(xiàng)認(rèn)真分析，用排除法選擇。從DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線可知，NaCl溶液在低于?0.14
mol/L?時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度增加而逐漸下降，?0.14
mol/?L時(shí)溶解度最低，當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA溶解度逐漸增加。A選項(xiàng)只注重一段范圍內(nèi)的變化，不夠全面。二苯胺試劑使用時(shí)需要水浴加熱才出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。豬的成熟紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核，無(wú)DNA，故不能用于本實(shí)驗(yàn)。而提取洋蔥的DNA時(shí)，食鹽的作用是溶解釋放后的DNA，洗滌劑才能使DNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)。?
答案：C專題5
DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)
課題3
血紅蛋白的提取和分離
庖丁巧解牛
知識(shí) 巧學(xué)
一、凝膠色譜法
凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，通過(guò)的路程短，移動(dòng)速度快；相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量小的分子后流出。
二、緩沖溶液
緩沖溶液能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持溶液pH基本不變。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內(nèi)所溶解的溶質(zhì)（化合物）稱之為緩沖劑，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比即可制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。
知識(shí)拓展
緩沖溶液由足夠濃度的酸堿對(duì)組成。其中，能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)堿的稱為共軛酸，能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)酸的稱為共軛堿，這一對(duì)共軛酸堿通常稱為緩沖對(duì)、緩沖劑或緩沖系，常見(jiàn)的緩沖對(duì)主要有三種類(lèi)型：弱酸及其對(duì)應(yīng)的鹽；多元弱酸的酸式鹽及其對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽；弱堿及其對(duì)應(yīng)的鹽。
三、電泳
電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的的。
要點(diǎn)提示
電泳分離方法主要就是根據(jù)大分子的分子量及電性差異將大分子在電場(chǎng)中彼此分來(lái)的。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些帶電粒子在電泳時(shí)的遷移率，與粒子所帶的電荷量成正比，與分子量大小成反比。??
四、實(shí)驗(yàn)操作：蛋白質(zhì)的提取和分離?
1.樣品處理?
（1）紅細(xì)胞的洗滌　洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白。采用低速短時(shí)間離心，吸出上層透明的黃色液體，再加入五倍體積的生理鹽水，重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。
要點(diǎn)提示
洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法去除血漿蛋白；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)高會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。
（2）血紅蛋白的釋放紅細(xì)胞在蒸餾水和40%的甲苯作用下破裂，釋放血紅蛋白。?
（3）分離血紅蛋白溶液將混合液進(jìn)行離心后會(huì)分層，第3層的紅色透明液體是血紅蛋白。
（4）透析　目的是除去樣品中的分子量較小的雜質(zhì)。
2.凝膠色譜操作
（1）凝膠色譜柱的制作?
（2）凝膠色譜柱的裝填?
①裝填前，凝膠用蒸餾水或者洗脫液充分溶脹。?
②凝膠裝填要均勻，色譜柱內(nèi)不能有氣泡，一旦發(fā)現(xiàn)有，必須重裝。?
③裝填完后，立即用300
ml
20
mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12
h，使凝膠裝填緊密。
（3）樣品的加入和洗脫?
①按正確方法加樣，不能破壞凝膠面。?
②進(jìn)行洗脫時(shí)，等紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，采用試管收集。
方法點(diǎn)撥
血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步?
包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌和紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。
疑點(diǎn)突破
血紅蛋白的分離是否成功
如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。
3.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(選做)?
SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量,是根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陽(yáng)離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結(jié)合成復(fù)合物,使蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng),使蛋白質(zhì)分子相對(duì)遷移率的大小完全取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)和相對(duì)遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出供試品的分子量。
問(wèn)題 探究
?
問(wèn)題1
凝膠色譜柱的裝填應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？?
思路:凝膠色譜柱的高度、平整程度以及均勻與否都可能會(huì)影響樣品的分離度。?
探究:（1）裝填前為了加速膨脹，可以加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)約時(shí)間，除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)空氣。?
（2）裝填時(shí)不能有氣泡，氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。?
（3）裝填后不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。
問(wèn)題2
蛋白質(zhì)是如何分離的？?
思路:蛋白質(zhì)是根據(jù)離心原理分離的。?
探究:當(dāng)含有細(xì)小顆粒的懸浮液靜置不動(dòng)時(shí)，由于重力場(chǎng)的作用，使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會(huì)上浮。微粒在重力場(chǎng)下移動(dòng)的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且又與重力場(chǎng)的強(qiáng)度及液體的粘度有關(guān)。象紅血球大小的顆粒，直徑為數(shù)微米，就可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過(guò)程。
典題 熱題
例1下列關(guān)于凝膠色譜法的原理及操作不正確的是（　　）?
A.是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開(kāi)的一種方法?
B.在洗脫過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而最先流出，而小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部而流速緩慢，以致最后流出?
C.凝膠內(nèi)部有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小與被分離的物質(zhì)分子的大小無(wú)相應(yīng)關(guān)系?
D.一般情況下，凝膠對(duì)要分離的物質(zhì)沒(méi)有吸附作用，因此所有要分離的物質(zhì)都應(yīng)該被洗脫出來(lái)。
解析：本題考查凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理。凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，凝膠是由多糖類(lèi)化合物構(gòu)成的，其內(nèi)部有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子蛋白質(zhì)可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部，路程較短，移動(dòng)速度快，因此在洗脫過(guò)程中分離。選用不同種凝膠，其立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不同，孔隙大小不同，因此可分離的分子大小也不同，故應(yīng)相關(guān)。凝膠一般對(duì)分離的物質(zhì)無(wú)吸附作用，所有要分離的物質(zhì)都應(yīng)該被洗脫出來(lái)。這是凝膠色譜法與一般層析法的不同。
答案：C?
例2電泳技術(shù)可分離和解析氨基酸和核苷酸等有機(jī)物，下圖是把含有21個(gè)氨基酸的多肽進(jìn)行水解，將氨基酸混合物進(jìn)行電泳的結(jié)果。據(jù)圖分析該多肽由幾種氨基酸組成（　　）
A.6
B.4?
C.5
D.3
解析：電泳分離方法主要就是根據(jù)大分子的分子量及電性差異將大分子在電場(chǎng)中彼此分離開(kāi)的。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些帶電粒子在電泳時(shí)的遷移率，與粒子所帶的電荷量成正比，與分子量大小成反比。由于組成多肽的氨基酸的分子量，所帶電荷不同，會(huì)形成不同的電泳帶，因?yàn)樾纬闪鶙l電泳帶，所以該多肽由六種不同氨基酸組成。?
答案：A

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