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第三章 基因工程
基因工程的基本操作程序
選擇性必修三
基因工程的基本操作程序
蘇云金桿菌內獲得Bt抗蟲蛋白基因
轉入棉花內
獲
構
導
檢
目的基因的篩選與獲取
基因表達載體的構建
將目的基因導入受體細胞
目的基因的檢測與鑒定
編碼區上游
與RNA聚合酶
結合位點
啟動子
終止子
非編碼區
非編碼區
編碼區
編碼區下游
與RNA聚合酶結合位點
啟動子
終止子
非編碼區
編碼區
非編碼區
原核生物
真核生物
目的基因的篩選與獲取
一
在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。
目的基因
目的基因的篩選與獲取
一
1.篩選合適的目的基因
(1)較為有效的方法：從相關的 和 的基因中進行篩選。
已知結構
功能清晰
(2)實例：
Bt蛋白基因的篩選過程
目的基因的篩選與獲取
一
相關信息P77
Bt抗蟲蛋白的原理:當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。
Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生上述影響.
目的基因的篩選與獲取
一
2.目的基因的獲取方法
①前提: 基因比較小、核普酸序列已知
②方法: 通過DNA合成儀用化學方法直接合成目的基因
（1）人工合成
目的基因的篩選與獲取
一
目的基因的mRNA
單鏈DNA
雙鏈DNA
（即目的基因）
反轉錄
合成
2.目的基因的獲取方法
（1）人工合成
反轉錄法
根據已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白質的氨基酸序列
推測
mRNA的核苷酸序列
推測
結構基因的核苷酸序列
目的基因
化學合成
目的基因的篩選與獲取
一
2.目的基因的獲取方法
（2）PCR技術
PCR是 的縮寫，是一項根據 原理，在
提供參與DNA復制的 與 ，對 進行 的技術。
聚合酶鏈式反應
DNA半保留復制的
體外
各種組分
反應條件
目的基因的核苷酸序列
大量復制
穆里斯等
1985年
全稱
原理
操作環境
目的
優點
聚合酶鏈式反應
DNA半保留復制、DNA的熱變性原理
PCR儀，DNA復制的各種組分和條件
對目的基因的核苷酸序列進行大量復制
特異性快速擴增目的基因
①
目的基因的篩選與獲取
一
2.目的基因的獲取方法
（2）PCR技術
參與的組分 在DNA復制中的作用
解旋酶 打開DNA雙鏈
DNA母鏈 提供DNA復制的模板
4中脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的
3'端開始連接脫氧核苷酸
（體外用高溫代替）
（dNTP）
（耐高溫的DNA聚合酶）
（2種）
DNA復制所需要的條件
目的基因的篩選與獲取
一
2.目的基因的獲取方法
（2）PCR技術
②PCR條件
DNA模板
4種脫氧核苷酸
引物
耐高溫的DNA聚合酶
穩定的緩沖溶液
（一般添加Mg2+）
PCR儀控制不同的溫度
目的基因的篩選與獲取
一
目的基因的篩選與獲取
一
③PCR反應過程
目的基因DNA 后 ， 與單鏈相應互補序列結合；然后以 為模板在 作用下進行 ，即將
加到 ，如此重復循環多次。
每次循環一般可以分為 、 、 三步。
由于延伸后得到的 又可以作為下一個循環的 ，因而每次循環后目的基因的量可以增加 ，即成 形式擴增。（約為2n，其中n為擴增循環的次數）。
受熱變性
解聚為單鏈
引物
單鏈DNA
DNA聚合酶
延伸
4種
脫氧核苷酸
引物的3'端
變性
復性
延伸
產物
模板
一倍
指數
目的基因的篩選與獲取
一
用PCR可以擴增mRNA嗎？
mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄形成cDNA再擴增
1.逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子;
2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈。使之變成單鏈DNA；
3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA
基因表達載體的構建
二
1.目的
獲得了足量的基因后，是否能直接將目的基因導入受體細胞呢？若這樣操作，效果如何？
核心步驟——基因表達載體的構建
目的：確保目的基因在受體細胞 中穩定存在和表達，并且 能遺傳給下一代。
基因表達載體的構建
二
2.組成
作為基因表達載體，除了目的基因外，還需要哪些元件呢？
是RNA聚合酶識別和結合位點，驅動基因轉錄出mRNA
終止轉錄
鑒別和篩選含目的基因的受體細胞
能帶著插入的目的基因一起復制
基因操作中使用的外源基因
目的基因：
啟動子：
終止子：
標記基因：
復制原點：
酶切位點：
目的基因
啟動子
終止子
標記基因
復制原點
1.下面是四種不同質粒的示意圖,其中 ori為復制必需的序列,ampr為氨芐青霉素抗性基因,tetr為四環素抗性基因,箭頭表示一種限制性內切核酸酶的酶切位點。若要得到一個能在四環素培養基上生長而不能在氨芐青霉素培養基上生長的含重組 DNA的細胞，應選用的質粒是
A
B
C
D
C
2.如圖是利用基因工程技術培育轉基因植物,生產可食用疫苗的部分過程示意圖，其中 PstI、SmaI、EcoRI、Apal為四種限制酶。下列說法錯誤的是
A.圖示對質粒和目的基因切割用到了兩種限制酶
B.抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來
C.構建基因表達載體時需要用到限制酶 SmaI
D.除圖示組成外,表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結構
將目的基因導入受體細胞
三
1.轉化
指目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程
2.轉化的受體細胞
將目的基因導入受體細胞
三
（1）農桿菌轉化法
將目的基因導入受體細胞
三
（1）農桿菌轉化法
將目的基因導入受體細胞
三
載體：農桿菌Ti質粒
（1）農桿菌轉化法
T-DNA
受體細胞：主要是雙子葉植物 和裸子植物
隨著轉化方法的突破，農桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功
（1）農桿菌轉化法
將目的基因導入受體細胞
三
Ti質粒
目的基因
基因表達載體
農桿菌
植物細胞
T-DNA攜帶目的基因插入植物細胞染色體DNA中
新性狀
構建
轉入
導入
表達
（2）花粉管通道法
將目的基因導入受體細胞
三
①用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
②在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。
同步P55
目的基因的檢測與鑒定
四
類型 檢測內容 方法 結果顯示
分子水平 的檢測 目的基因是否插入 轉基因生物的DNA上 PCR技術或 DNA分子雜交技術 是否成功顯示出雜交帶
目的基因是否 轉錄出mRNA PCR技術或 核酸分子雜交技術 目的基因是否 翻譯成蛋白質 抗原-抗體雜交 個體生物學 水平的鑒定 是否具有抗性 及抗性程度 抗性接種實驗 是否賦予了預期抗性或蛋白質活性
產品的功能活性是否相同 比較功能活性
DNA片段的擴增及電泳鑒定
五
1.實驗原理
（1）利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理
PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器，一次PCR一般要經歷30次循環。PCR擴增DNA片段還利用了半保留復制的原理。
DNA片段的擴增及電泳鑒定
五
（2）DNA片段電泳鑒定的原理
①DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，
這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
②PCR產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。
③在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。（主要考慮分子量）
④凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。
1.瓊脂糖凝膠電泳是分子實驗室中常用的分離DNA的方法
2.核酸為兩性電解質，其等電點為pH2~2.5，在常規的pH約8.5的電泳緩沖液中，核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動
3.線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。這樣就可以將不同分子量大小的DNA片段分離開
DNA片段的擴增及電泳鑒定
五
（2）DNA片段電泳鑒定的原理
謝 謝 觀 看

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