資源簡介

第二章 細胞工程
動物細胞工程
選擇性必修三
動物細胞融合技術與單克隆抗體
A細胞
B細胞
A原生質體
B原生質體
正在融合的原生質體
雜種細胞
愈傷組織
雜種植株
移栽后的植株
去壁
去壁
融合
再生出細胞壁
脫分化
再分化
移栽
植物體細胞雜交技術
溫故而知新
打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育出新的作物類型。
實例：1970年，人—鼠細胞熒光標記融合實驗
人細胞
鼠細胞
紅色熒光染料標記的膜蛋白
綠色熒光染料標記的膜蛋白
細胞融合
正在融合的細胞
37°C
培養40min
細胞融合
實驗表明：細胞膜具有流動性
有沒有技術能讓不同種動物的體細胞雜交？
1970年，科學家用發綠色熒光的染料標記小鼠細胞表面的蛋白質分子，用發紅色熒光的染料標記人細胞表面的蛋白質分子，將小鼠細胞和人細胞融合。這兩種細胞剛融合時，融合細胞的一半發綠色熒光，另一半發紅色熒光。在37℃下經過40min，兩種顏色的熒光均勻分布。
小鼠細胞
人細胞
細胞融合
37℃,40min
正常融合的細胞
融合細胞
紅色熒光染料標記的膜蛋白
綠色熒光染料標記的膜蛋白
熒光標記的小鼠細胞和人細胞融合實驗示意圖
思考：動物細胞進行融合，與植物有哪些不同之處？
無需去除細胞壁；
全能性受限制，不能培育成新的動物個體。
顯微鏡下的
動物細胞融合
一、動物細胞融合技術
1. 概念：
2. 結果：
3. 原理：細胞膜具有一定的流動性。
使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。
形成單核的雜交細胞，即融合后形成的雜交細胞是具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞。
一、動物細胞融合技術
4. 誘導融合的常用方法
（1）物理法：電融合法
（3）生物法：滅活病毒誘導法（動物細胞融合特有的誘導方法）
（2）化學法：聚乙二醇（PEG）融合法
（3）生物法：
滅活病毒誘導法
①滅活：是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構。
動物細胞融合特有的誘導方法
仙臺病毒
紫外線
滅活
喪失感染活性（不感染細胞）
保留融合活性（能誘導細胞融合）
（3）生物法：滅活病毒誘導法
動物細胞融合特有的誘導方法
②滅活病毒誘導細胞融合的原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶與細胞膜上的糖蛋白發生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合。
5. 過程
細胞膜融合
細胞核融合
細胞質融合
一、動物細胞融合技術
形成雜交細胞
滅活病毒誘導細胞融合過程
思考：19世紀30年代，科學家曾在肺結核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現象？
病人體內病毒等誘導多個體細胞融合形成了多核細胞。
細胞核融合，即兩個或多個細胞核融合為一個細胞核。
6. 動物細胞融合完成的標志：
一、動物細胞融合技術
病毒顆粒
滅活的病毒顆粒粘附于細胞表面
細胞膜融合
細胞核融合
形成雜交細胞
在病毒的作用下，使細胞互相凝聚
一、動物細胞融合技術
7. 意義：
細胞融合技術突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。至今，種間、屬間、科間、甚至動物和植物之間的細胞融合都已獲得了成功。
2016年，《ACS Synthetic Biology》雜志上報道了一個日本科學家團隊，他們將擬南芥細胞與人類HT1080細胞融合，雜交細胞中產生出了人類/植物融合染色體，同時還能穩定存活、增殖，進行基因表達的案例。
（1）研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。
（2）利用動物細胞融合技術而發展起來的雜交瘤技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。
一、動物細胞融合技術
8. 應用
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
植物體細胞雜交
動物細胞融合
原理
細胞融合前的處理方法
誘導細胞融合的方法
細胞融合成功的標志
主要用途
意義
細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性
細胞膜具有一定的流動性
用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁
用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞
電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法
再生出細胞壁
細胞核的融合
獲得完整的雜種植株
主要用于制造單克隆抗體
打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育植物新品種
突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能
9. 植物體細胞雜交和動物細胞融合比較
二、單克隆抗體及其應用
病原體
處理
呈遞
輔助性T細胞
結合
記憶B細胞
漿細胞
抗體
第一信號
分裂、分化 并分泌
細胞因子
分裂分化
促進
產生分泌
第二信號
B細胞
抗原呈遞細胞
結合
抗體與病原體結合后形成沉淀等，進而被其他免疫細胞吞噬消化。
攝取
知識回顧：抗體的產生
二、單克隆抗體及其應用
早期獲得抗體的方法
動物體內
抗原
漿細胞
抗體（血清）
反復
注射
缺點：產量低，純度低，制備的抗體特異性差。
抗原不純
抗體不純
多種
（１）動物體內產生的特異性抗體種類多達百萬種；
（２）每個B淋巴細胞（漿細胞）只分泌一種特異性的抗體。
科學家發現：
單
克隆
抗體
體外培養時，一個B淋巴細胞不能無限增殖
需解決問題：
遺憾：
如何解決這一難題？
一個B淋巴細胞
B淋巴細胞群
克隆
二、單克隆抗體及其應用
如何獲得大量、單一的抗體？
單一抗體
動物細胞融合
融合細胞
動物細胞培養
單克隆抗體
骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖
一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體
二、單克隆抗體及其應用
1975年，英國科學家米爾斯坦和德國科學家科勒設計了一個極富創造性的試驗方案：
既能迅速大量增殖，又能產生專一抗體
漿細胞
腫瘤細胞
二、單克隆抗體及其應用
由于發明了單克隆抗體的制備技術，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學或醫學獎
米爾斯坦【英國】
科勒【德國】
二、單克隆抗體及其應用
1. 制備單克隆抗體的原理
（1）每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，在體外培養條件下，不能無限增殖。
（2）骨髓瘤細胞能無限增殖，不能產生抗體。
（3）通過動物細胞融合技術將兩種細胞融合，得到的融合細胞既能迅速大量增殖，又能產生專一抗體。
骨髓瘤細胞
能無限增殖
能產生抗體
B淋巴細胞
注射特定抗原
從患骨髓瘤的小鼠體內取骨髓瘤細胞的培養
多種已免疫B淋巴細胞
骨髓瘤細胞
誘導融合
小鼠的脾臟中獲取
二、單克隆抗體及其應用
多種雜交細胞
2. 單克隆抗體的制備過程
獲得能產生特定抗體的B淋巴細胞
02
雜交瘤細胞（多種）
置于選擇性培養基上培養
第一次篩選
融合的細胞
B細胞
自身融合
未融合的
B淋巴細胞
B瘤
骨髓瘤細胞
自身融合
未融合的
骨髓瘤細胞
2. 單克隆抗體的制備過程
B瘤
B瘤
第一次篩選：用特定的選擇培養基，在該培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。
①篩選雜交瘤細胞，一般用HAT培養基，由次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），3種關鍵成分配制而成。
②哺乳動物細胞中合成DNA途徑有兩條：
一條是從頭合成途徑（簡稱D途徑），氨基蝶呤可以阻斷細胞利用D途徑合成DNA；
一條是補救途徑（簡稱S途徑），該途徑需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），這兩種酶可以催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷用來合成DNA。
第一次篩選獲得雜交瘤細胞
③骨髓瘤細胞是經過人工篩選的基因缺陷型細胞，缺乏HGPRT、TK。當它處于HAT培養基中，合成DNA的D途徑被氨基蝶呤阻斷。同時，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途徑合成DNA，會很快死亡。
④雜交瘤細胞從B淋巴細胞中獲得了HGPRT和TK，可以利用S途徑來合成DNA。
第一次篩選獲得雜交瘤細胞
細胞合成DNA有D和S兩條途徑
B淋巴細胞及同型融合細胞
不能無限增殖，死亡
骨髓瘤細胞及同型融合細胞
不能合成DNA，死亡
雜交瘤細胞
能無限增殖，生長
B淋巴細胞
合成DNA
S途徑
D途徑
不能分裂增殖
骨髓瘤細胞
合成DNA
D途徑
能無限增殖
一般用HAT培養基篩選出雜交瘤細胞，其中氨基喋呤阻斷D途徑。
第一次篩選獲得雜交瘤細胞
骨髓瘤細胞是經過人工篩選的基因缺陷型細胞，缺乏HGPRT、TK。
02
克隆化培養
抗體檢測
第二次篩選
能分泌專一抗體的雜交瘤細胞
抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞（分泌的抗體能和特定的抗原結合）
雜交瘤細胞（多種）
2. 單克隆抗體的制備過程
96孔板
第二次篩選獲得產生專一抗體的雜交瘤細胞
使用96孔板培養和篩選雜交瘤細胞，每一個孔盡量只接種一個雜交瘤細胞，即將單個雜交瘤細胞單獨培養，通過克隆化培養和抗體檢測，即可獲得大量能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。
96孔板培養和篩選
抗體檢測原理：
抗原和抗體能夠特異性結合
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
第二次篩選獲得產生專一抗體的雜交瘤細胞
抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞
抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞
體外培養
單克隆抗體
體內或體外培養
2. 單克隆抗體的制備過程
注射到小鼠腹腔
注射抗原
用特定抗原對小鼠免疫，并從其脾中獲取能產生特定抗體的B淋巴細胞
多種B淋巴細胞
培養骨髓瘤細胞
骨髓瘤細胞
細胞融合
誘導融合
多種雜交細胞
雜交瘤細胞
用特定的選擇培養基進行篩選：只有融合的雜交瘤細胞才能生長
多輪次的克隆化培養和抗體檢測
抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞
體外培養或注射到小鼠腹腔內增殖
體外培養
注射到腹腔
單克隆抗體
從培養液或小鼠腹水中獲得大量的單克隆抗體
2. 單克隆抗體的制備過程
脾中產生多種
B淋巴細胞
提取
（產生特定抗體）
給小鼠注射特定抗原
培養小鼠骨髓瘤細胞
（能無限增殖）
骨髓瘤細胞
誘導
融合
多種細胞
第一次篩選
特定的
選擇性培養基
只有融合的
雜交瘤細胞
克隆化培養、
抗體檢測
第二次篩選
抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞
體外培養
注射到
小鼠腹腔
大量單克隆抗體
腹水
培養液
B細胞 瘤細胞
B-B細胞
瘤-瘤細胞
雜交瘤細胞
2. 單克隆抗體的制備過程
獲得能產生特定抗體的B淋巴細胞
（1）注射特定抗原的目的是：
2. 單克隆抗體的制備過程
回顧重點
（2）單克隆抗體制備過程中兩次篩選的比較
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}項目
第一次篩選
第二次篩選（需多次篩選）
篩選
原因
篩選
目的
篩選出
篩選出 的雜交瘤細胞
雜交瘤細胞
能分泌所需抗體
誘導融合后得到的細胞中，除雜交瘤細胞之外，還有未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞。
由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經選擇培養獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞
（2）單克隆抗體制備過程中兩次篩選的比較
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}項目
第一次篩選
第二次篩選（要多次篩選）
篩選
方法
用特定的選擇培養基篩選：未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會 ，只有融合的雜交瘤細胞才能 。
用96孔板培養，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞的情況下進行克隆化培養和 ，經多次篩選得到足夠數量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。
死亡
抗體檢測
生長
在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的目的和方法是不相同的。
（4）抗體檢測
①原理：抗原和抗體能夠特異性結合
②技術：抗原-抗體雜交技術
2. 單克隆抗體的制備過程
（6）抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞特點：
（3）克隆化培養：由單個細胞分裂增殖獲得細胞團的培養過程。
（5）雜交瘤細胞特點：既能迅速大量增殖，又能產生抗體。
既能迅速大量增殖又能產生特異性（專一）抗體，能與特定抗原結合。
（7）獲取大量單克隆抗體的方法
Ⅰ. 優點：
Ⅱ. 缺點：規模小，產量少
Ⅰ. 優點：可大規模培養，大量生產
Ⅱ. 缺點：需要人為控制培養條件，成本相對較高
2. 單克隆抗體的制備過程
①腹腔培養
②體外培養
不需培養基，易于控制培養條件（如無需提供無菌環境等），操作簡單，成本較低
①技術：動物細胞融合、動物細胞培養
2. 單克隆抗體的制備過程
（8）應用到的細胞工程技術及原理
②原理：細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖
（1）能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發生特異性結合。
（2）可以大量制備。
二、單克隆抗體及其應用
3. 單克隆抗體的優點
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
資料1：用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”，在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。
在受精后不久，胎盤滋養層細胞就會分泌人絨毛膜促性腺激素（HCG），是由受孕婦女體內胎盤產生的一種糖蛋白類激素，在孕婦的尿液中大量存在。而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有。
資料2：使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用。
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
資料2：
抗體-藥物偶聯（antibody-drugconjugate，ADC）
通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細胞毒素）三部分組成。
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
抗體
接頭
藥物
資料2：ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細胞毒素）三部分組成，它的作用機制如下圖所示。
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
思考 ? 討論
討論1：ADC的抗體和藥物各具有什么作用？
抗體主要發揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；
藥物發揮治療效應，如殺傷靶細胞。
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
討論2： 除了細胞毒素，還有哪些物質理論上可以作為ADC偶聯的藥物？
① 可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療；
② 一些作用于細胞信號轉導通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結合進行治療。
思考 ? 討論
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
討論3：單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優勢？
思考 ? 討論
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
① 單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高。
② ADC能夠協同發揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優點。
討論4：你可以課后搜集資料，單克隆抗體在臨床上還有哪些應用？
思考 ? 討論
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
單克隆抗體在臨床上的應用涉及治療、診斷等方面。
①單克隆抗體藥物已被廣泛用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療，如利妥昔單抗被用于治療復發難治的低分化B細胞淋巴瘤；曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。
②在臨床診斷方面，單克隆抗體被廣泛用于一些感染性疾病的檢測、腫瘤的診斷、激素和細胞因子的測定等。以單克隆抗體在診斷腫瘤方面的應用為例，用放射性同位素或熒光標記抗腫瘤表面抗原的單克隆抗體，可以用這些抗體來對體內的腫瘤進行定位，輔助診斷并確定腫瘤的復發與轉移等。
（1）廣泛用作診斷試劑：例如，利用同位素或熒光標記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
結合熒光標記的單克隆抗體藥物
結合同位素的單克隆抗體藥物
優點：準確、高效、簡易、快速。
小結
（2）運載藥物（生物導彈）：例如，ADC等。
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
①抗體-藥物偶聯物（ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。
②ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細胞毒素）三部分組成。抗體主要發揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物發揮治療效應，如殺傷靶細胞。
優點：位置準確、特異性強、靈敏度高。
（3）用于治療疾病：單克隆抗體藥物已被廣泛用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療，如利妥昔單抗被用于治療復發難治的低分化B細胞淋巴瘤；曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。
二、單克隆抗體技術及其應用
4. 單克隆抗體的應用
優點：位置準確、療效高、毒副作用小。
1. 下列有關動物細胞融合與植物體細胞雜交比較的敘述，錯誤的是（ ）
A. 它們的原理都涉及細胞膜的流動性
B. 都可以用電融合法或PEG融合法誘導融合
C. 融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細胞
D. 前者主要為了獲得細胞產品，后者主要為了獲得雜種植株
C
練習與應用
一、概念檢測
2. 科學家以SARS病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關敘述正確的是 （ ）
A. 利用該單克隆抗體可以診斷是否感染 SARS病毒
B. 體外培養單個B淋巴細胞可以獲得針對SARS病毒的單克隆抗體
C. 將等量B淋巴細胞和骨髓瘤細胞混合，經誘導后融合的細胞即為雜交瘤細胞
D. 將純化的核衣殼蛋白反復注射到小鼠體內，從小鼠血清中分離出的抗體為單克隆抗體
A
練習與應用
一、概念檢測
假如你掌握了動物細胞融合技術，你想用這種技術來解決哪些問題？解決這些問題的大致思路是怎樣的？這樣做會有什么風險？請查閱相關資料，完善自己的思路，并形成文字報告，與同學交流。
可以利用動物細胞融合技術培育多倍體胚胎，研究其發育機制，甚至可能培育出新的物種。但是，目前相關技術還不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等問題，并且還可能帶來些倫理方面的問題。
練習與應用
二、拓展應用
謝 謝 觀 看

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