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(共31張PPT)
第三章 基因工程
重組DNA技術(shù)的工具
選擇性必修三
圖解“基因工程實(shí)質(zhì)”
轉(zhuǎn)移
A生物
B生物
螢火蟲
普通動植物
發(fā)光基因
轉(zhuǎn)基因抗蟲棉
接
剪
運(yùn)
限制性核酸內(nèi)切酶
“分子手術(shù)刀”
DNA連接酶
“分子縫合線”
基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體
“分子運(yùn)輸車”
限制性核酸內(nèi)切酶
來源 從微生物（主要是原核生物）體內(nèi)分離出來
功能 能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性
作用位點(diǎn) “切割”的是磷酸二酯鍵，且只切割兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
圖解專一性
EcoR I
(在G與A之間切割)
Sma I
(在G與C之間切割)
5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
限制性核酸內(nèi)切酶的命名
限制酶的命名法則是用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。
從大腸桿菌（Escherichia coli）的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoR I
流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:
Hind I
Hind II
Hind III
限制性核酸內(nèi)切酶
限制酶所識別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。
暮天遙對寒窗霧；
霧窗寒對遙天暮。
在切割部位，一條鏈從5’往3’讀的堿基順序與另一條鏈5’往3’讀的順序完全一致
寫出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ形成的黏性末端
EcoRⅠ 形成的黏性末端
Hind Ⅲ 形成的黏性末端
Bgl Ⅱ 形成的黏性末端
GATC
AATT
AGCT
GATC
總結(jié) 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
同尾酶 識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶
理性思考
01
02
03
要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？ 可產(chǎn)生幾個黏性末端？
限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？
為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？
燒腦練習(xí)
限制酶 Bam HI Ⅰ EcoR Ⅰ Sau 3A Ⅰ Kpn Ⅰ
識別序列及切割位點(diǎn) -GGATCC- -GAATTC- -GATC- -GGTACC-
已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點(diǎn)是-G GATCC-,限制酶Ⅱ的識別序列和切點(diǎn)是- GATC-，回到下列問題：
（1）能被限制酶Ⅰ切割的DNA， （填“能”，“不能”或“不一定能”）被限制酶Ⅱ切割；
（2）能被限制酶Ⅱ切割的DNA， （填“能”，“不能”或“不一定能”）被限制酶Ⅰ切割；
能
不一定能
關(guān)于DNA的連接
作用
把兩條ＤＮＡ末端之間的縫隙“縫合”起來
恢復(fù)兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵
DNA連接酶
實(shí)質(zhì)
DNA連接酶
DNA連接酶
關(guān)于DNA的連接
作用
把兩條ＤＮＡ末端之間的縫隙“縫合”起來
恢復(fù)兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵
DNA連接酶
實(shí)質(zhì)
DNA連接酶
注意 DNA連接的不是連接氫鍵（氫鍵的形成不需要酶的催化）
關(guān)于DNA的連接
類型 E.coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來源
功能 只縫合____________ 縫合____________和____________
結(jié)果 恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________ 大腸桿菌
T4噬菌體
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯鍵
思考T4 DNA連接酶連接平末端的效率和連接黏性末端的效率相同嗎？
不同，因?yàn)轲ば阅┒说膲A基是互補(bǔ)的，在連接時，黏性末端可以通過堿基互補(bǔ)配對，加快DNA連接酶的連接速度，而平末端則不能。
大自然的啟示
目的基因如何轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞？
利用病毒的侵染能力
利用接合作用中質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移能力
基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體
種類 用途 不同點(diǎn)
質(zhì)粒、噬菌體
植物病毒 動物病毒 將外源基因?qū)氪竽c桿菌
等受體細(xì)胞
將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞
將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞
來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別
將目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制
質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體
01
在基因工程中真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改造的
一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子
經(jīng)過人工改造
特殊的標(biāo)記基因 復(fù)制原點(diǎn)
啟動子 終止子 目的基因插入位點(diǎn)
質(zhì)粒的組成要素
質(zhì)粒
02
質(zhì)粒
粒是基因工程中最常用的載體
01
02
03
04
自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制
有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)
對受體細(xì)胞無害、易分離
具有多種特殊的標(biāo)記基因
能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)增
供外源DNA片段(基因)插入其中
對受體細(xì)胞無害，避免受體細(xì)胞受到損傷
便于篩選含有重組DNA分子的細(xì)胞
篩選含有重組DNA分子的細(xì)胞
抗生素的抗性基因，如: 抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)
熒光蛋白基因，如: 綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)
特殊的標(biāo)記基因可以是抗生素抗性基因，也可以是熒光蛋白基因
篩選含有重組DNA分子的細(xì)胞
四環(huán)素
抗性基因
青霉素
抗性基因
選擇抗青霉素不抗四環(huán)素的工程菌
加青霉素
0加四環(huán)素
影印培養(yǎng)法
典型例題
【例1】表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列說法錯誤的是（ ）
A.一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Smal切割
后，含有4個游離的磷酸基團(tuán)
B.用圖1中的質(zhì)粒和圖2中的目的基因
構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Smal切割
C.圖2中為防止酶切后單個含目的基因
的DNA片段自身連接成環(huán)狀，不能使用
EcORI
D.若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的Smal酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越高
典型例題
若使用 EcoRⅠ切割對目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行處理，能產(chǎn)生相同的黏性末端，理論上能構(gòu)建重組質(zhì)粒，但是……
理想結(jié)果
反向連接
甚至還會出現(xiàn)目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化的結(jié)果
典型例題
【例1】表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列說法錯誤的是（ ）
A.一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Smal切割
后，含有4個游離的磷酸基團(tuán)
B.用圖1中的質(zhì)粒和圖2中的目的基因
構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Smal切割
C.圖2中為防止酶切后單個含目的基因
的DNA片段自身連接成環(huán)狀，不能使用
EcORI
D.若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的Smal酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越高
用限制酶切割時需注意的事項(xiàng)
1.獲取目的基因和切割載體時, 通常使用同種限制酶,目的是為了 。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生 。
以及 ，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是 。
。
產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接
目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化
目的基因與質(zhì)粒反向連接
分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運(yùn)載體
2.選擇限制酶切割位點(diǎn)的基本原則：
切割目的基因時： 。
切割質(zhì)粒時： 。
。
能切下目的基因且不破壞目的基因
至少保留一個完整的標(biāo)記基因，便于篩選
燒腦練習(xí)
限制酶 Bam HI Ⅰ EcoR Ⅰ Sau 3A Ⅰ Kpn Ⅰ
識別序列及切割位點(diǎn) -GGATCC- -GAATTC- -GATC- -GGTACC-
用同尾酶構(gòu)建載體時，使切割位點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大
典型例題
【例2】（《三維設(shè)計》P76.課堂演練4）基因工程中,需使用特定的限制性內(nèi)切核酸酶切割目的基因和質(zhì)粒,便于重組和篩選。已知限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ的識別序列和切割位點(diǎn)是-G↓GAIC-,限制性內(nèi)切核酸酶Ⅱ的識別序列和切割位點(diǎn)是-↓GATC-。根據(jù)圖示分析下列敘述正確的是（ ）
A.質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限
制酶Ⅰ切割
B.用限制酶切割獲得目的基因時，有四
個磷酸二酯鍵被水解
C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后獲得的黏性末端不同
D.質(zhì)粒中標(biāo)記基因便于篩選出目的基因已經(jīng)表達(dá)的細(xì)胞
典型例題
【例3】為制備目的基因Y（圖19）與質(zhì)粒X（圖20）的重組DNA，將質(zhì)粒X與含Y的DNA片段加入含有限制性核酸內(nèi)切酶BgIⅡ與BamHⅠ的反應(yīng)混合物中，酶切后的片段再加入含有連接酶的反應(yīng)體系中。其中，質(zhì)粒X含有l(wèi)eu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR
（1）使用BgI II處理重組質(zhì)粒，可
以得到 。
A．長度為3300bp的環(huán)狀DNA
B．長度為3300bp的線形DNA
C．長度為2800bp和500bp的線形DNA
D．長度為2800bp的環(huán)狀DNA
（2）要篩選含有重組質(zhì)粒的Z細(xì)胞，應(yīng)選擇______________________的培養(yǎng)基。
A
含卡那霉素但不含亮氨酸
典型例題
【例4】某線性DNA分子含有3000個堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的識別序列和切割位點(diǎn)如圖所示。下列有關(guān)說法錯誤的是(　　)
A.在該DNA分子中，a酶與b酶的識別序列分別有2個和2個
B.a酶與b酶切出的黏性末端能相互連接
C.a酶與b酶對線性DNA分子的處理必須在細(xì)胞中完成
D.用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進(jìn)行反復(fù)切割、連接操作，若干循環(huán)后， 序列會明顯增多
DNA的粗提取與鑒定
原理一
原理二
原理三
思路
DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對它們進(jìn)行提取
DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精
DNA能溶于物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液
在一定溫度下，DNA被二苯胺試劑染成藍(lán)色
DNA的粗提取與鑒定流程圖
第一步
第四步
第三步
研磨
加酒精析出
溶解與鑒定
稱取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨
在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA
將絲狀物或沉淀物溶于試管中的NaCl溶液中。然后，向試管中各加入4mL的二苯胺試劑鑒定（注意做對照實(shí)驗(yàn)）
第二步
提取上清液
研磨液過濾到燒杯中，置于4℃冰箱中，幾分鐘后，再取上清液（也可以通過離心處理后再取上清液）
典型例題
【例5】如圖是“DNA 的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個操作步驟示意圖,下列相關(guān)敘述正確的是( )
A.圖1中的溶液a是上清液
B.圖1所示操作的原理是蛋白質(zhì)等雜質(zhì)
能溶于酒精,而DNA不溶
C.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯誤,
可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯
D.圖2中試管1的作用是證明2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色
謝 謝 觀 看

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