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第42講　基因工程的基本工具和基本操作程序
[課標內容]　1.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。3.DNA的粗提取與鑒定實驗。4.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定,或運用軟件進行虛擬PCR實驗。
微考點大突破
考點一　重組DNA技術的基本工具
　
1.基因工程的概念
(1)手段:基因工程是指按照人們的愿望,通過__________等技術,賦予生物新的遺傳特性。
(2)目的:創造出更符合人們需要的新的生物類型和__________。
(3)水平:DNA分子水平。
(4)基礎:生物化學、分子生物學和微生物學等學科。
(5)意義:克服遠緣雜交不親和的障礙,定向改造生物的__________。
提醒　基因工程的理論基礎
2.基因工程的基本工具
(1)限制性內切核酸酶——“分子手術刀”。
提醒　①限制酶的識別序列一般由6個核苷酸組成,少數由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。
②限制酶作用的化學鍵只能是磷酸二酯鍵。
③在切割含目的基因的DNA分子時,需用限制酶切割兩次此DNA分子,產生4個末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。
(2)DNA連接酶——“分子縫合針”。
(3)基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”。
(1)基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA連接酶、載體。(源自選擇性必修3 P70)()
(2)限制酶能夠識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的氫鍵斷開。(源自選擇性必修3 P71)()
(3)限制酶在識別序列中心軸線兩側切開形成的是黏性末端,在識別序列中心軸線處切開形成的是平末端。(源自選擇性必修3 P71)()
(4)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵,形成重組DNA。(源自選擇性必修3 P72)()
(5)載體質粒通常以抗生素合成基因作為篩選的標記基因。(源自選擇性必修3 P72)()
將從蘇云金桿菌中獲取的Bt基因轉入棉花細胞內培育轉基因抗蟲棉的過程中,需借助多種分子工具且經歷多個操作步驟。實驗人員使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割質粒。如圖表示常用的限制酶識別序列和切割位點以及質粒上的限制酶切割位點。請回答下列問題:
(1)請用圖示法寫出限制酶Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成黏性末端的過程。
(2)切割圖示中的目的基因應選用哪類限制酶 請說明理由。
答:__________________________________________________________________。
限制酶的選擇
(1)不破壞目的基因原則:如圖中可選擇PstⅠ,而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則,如圖所示。
(3)善用“雙酶切”,注意方向性:目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點時,一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點的兩種不同的限制酶,對目的基因所在序列和載體進行剪切,即“雙酶切法”。其優點和作用是①防止目的基因環化;②避免目的基因與載體反向連接,即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上,目的基因和載體啟動子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動方向”)必須是相同的,否則目的基因導入后無法正常表達。如圖甲、乙也可選擇Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制酶。
(4)巧用“同尾酶”:“同尾酶”指來源不同,但能產生相同黏性末端的限制酶。當不適合選擇某種限制酶時,可用其“同尾酶”替換,以獲得相同的黏性末端。
(5)根據Ti質粒的T DNA片段選擇限制酶,圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取,而丙Ti質粒宜選取(設切割目的基因的限制酶為Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。
能力　辨析基因工程的基本工具(考查科學思維)
1.(2025·連云港模擬)質粒是基因工程中最常用的載體,質粒有標記基因(如圖所示),通過標記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉移成功。質粒上箭頭表示三種限制酶的酶切位點。外源基因插入的位置不同,細菌在培養基上的生長情況不同。如表是外源基因插入(插入點有a、b、c)后細菌的生長情況。下列有關敘述正確的是(　　)
項目 細菌在含氨芐青霉素的培養基上生長情況 細菌在含四環素的培養基上生長情況
① 能生長 不能生長
② 能生長 能生長
③ 不能生長 能生長
A.質粒的復制原點上有RNA聚合酶的結合位點
B.①②③三種重組后細菌的外源基因插入點①是a,②是c,③是b
C.質粒被一種限制酶切開時,被水解的磷酸二酯鍵有2個
D.將外源基因與質粒連接時需用DNA聚合酶
2.用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性,創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶,其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示。
回答下列問題:
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。圖中______________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是______________________。
(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征。如質粒DNA分子上有復制原點,可以保證質粒在受體細胞中能__________;質粒DNA分子上有__________,便于外源DNA插入;質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因),利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞,方法是____________________________________________。
(4)表達載體含有啟動子,啟動子是指____________________________________________。
與DNA有關的幾種酶的比較
考點二　基因工程的基本操作程序
　
1.目的基因的篩選與獲取
(1)篩選合適的目的基因。
①目的基因:在基因工程的設計和操作中,用于改變__________或獲得__________等的基因,主要是指______________的基因。
②篩選目的基因的方法。
a.從已知______________清晰的基因中進行篩選。
b.利用序列數據庫和序列比對工具進行篩選。
(2)利用PCR獲取和擴增目的基因。
①原理:__________。
②條件:基本條件。
參與的組分 在DNA復制中的作用
解旋酶 (體外用__________代替) 打開DNA雙鏈
DNA母鏈 提供DNA復制的模板
__________ 合成DNA子鏈的原料
__________ 催化合成DNA子鏈
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的__________端開始連接脫氧核苷酸
③過程。
④結果:每次循環后目的基因的量增加一倍,即成__________形式擴增(約為2n,其中n為擴增循環的次數)。
⑤PCR產物的鑒定:常采用__________來鑒定。
提醒　①在PCR過程中實際加入的原料為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作為合成DNA子鏈的原料,又可為DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸,作為新子鏈的合成起點,只能結合在母鏈的3'端,使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。
③復性溫度過高,則引物難以與模板鏈結合,溫度過低則易使兩條母鏈配對結合,均無法獲得PCR產物。
④真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反應緩沖液中一般要添加Mg2+。
2.基因表達載體的構建——基因工程的核心
(1)目的。
①使目的基因在__________中穩定存在,并且可以遺傳給下一代。
②使目的基因能夠表達和發揮作用。
(2)基因表達載體的組成及作用。
(3)基因表達載體的構建過程。
提醒　啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
項目 本質 位置 功能
啟動子 DNA片段 目的基 因上游 RNA聚合酶識別和結合的部位,驅動基因轉錄出mRNA
終止子 DNA片段 目的基 因下游 使轉錄在所需要的地方停下來
起始 密碼子 mRNA上三個 相鄰的堿基 mRNA 首端 翻譯的起始信號(編碼氨基酸)
終止 密碼子 mRNA上三個 相鄰的堿基 mRNA 尾端 翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)
3.將目的基因導入受體細胞
受體 細胞 導入 方法 內容
植物 細胞 花粉管 通道法 用微量注射器將含__________的DNA溶液直接注入______中等
農桿菌 轉化法 農桿菌細胞內的Ti質粒上的__________可攜帶目的基因整合到受體細胞的__________DNA上
動物 細胞 _______________技術 常用受體細胞:__________
原核 細胞 Ca2+處 理法 用Ca2+處理細胞,使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態
提醒　①農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入:第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上。第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌。第二次導入(非人工操作)是指將含目的基因的T DNA導入受體細胞。
②導入的目的基因,可能存在于細胞質中,也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物中,造成“基因污染”。
4.目的基因的檢測與鑒定
(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。(選擇性必修3 P77“相關信息”)()
(2)PCR技術擴增目的基因時不必知道基因的全部序列,該技術既可以擴增DNA又可以直接擴增mRNA。(選擇性必修3 P79“旁欄思考”)()
(3)構建基因表達載體是轉基因工程的核心工作,唯一不需要進行堿基互補配對的過程是將目的基因導入受體細胞。(源自選擇性必修3 P80)()
(4)啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段,它是RNA聚合酶識別和結合的部分,有了它才能驅動DNA的復制過程。(源自選擇性必修3 P80)()
(5)可以將生物的所有DNA通過注射或花粉管通道法轉入植物細胞中,就可獲得具有理想性狀的轉基因植物。(選擇性必修3 P80“旁欄思考”)()
(6)轉化是指目的基因進入受體細胞內,并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。(選擇性必修3 P81“資料卡”)()
(7)應用PCR技術,可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因是否存在及其是否表達。(源自選擇性必修3 P82)()
Bt抗蟲蛋白基因(簡稱Bt基因)是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因,篩選Bt基因后可以利用PCR技術對其進行大量擴增。回答下列問題:
(1)什么是引物 DNA復制時為什么需要引物
答:____________________________________________。
(2)PCR擴增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列嗎
答:____________________________________________。
(3)為檢測Bt基因在轉基因抗蟲棉細胞中是否轉錄,科研人員提取棉花細胞中的總RNA,經逆轉錄過程獲得總cDNA,通過PCR技術可在總cDNA中專一性地擴增出Bt基因的cDNA,原因是什么
答:____________________________________________。
(4)PCR擴增過程中的循環圖示與規律如圖所示,若一個Bt抗蟲蛋白基因在PCR中經過n輪循環,理論上得到多少個DNA分子 含引物的DNA分子多少個 含引物A(或B)的DNA分子多少個 同時含兩種引物的DNA分子多少個 共需要消耗多少個引物 含不等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個 含等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個
答:________________________________________________________________________________________。
1.體內DNA復制與PCR技術的比較
PCR技術 體內DNA復制
原則 堿基互補配對
條件 DNA母鏈作為模板、引物(體內引物RNA、體外引物DNA)、4種脫氧核苷酸為原料
延伸方向 新鏈都是從5'端向3'端延伸
解旋方式 90℃以上高溫解旋 解旋酶催化
場所 PCR擴增儀 主要在細胞核
延伸用酶 耐高溫的DNA聚合酶 DNA聚合酶
溫度 控制溫度,需要在不同溫度下進行 細胞內溫和條件
過程
結果 大量的DNA片段(或目的基因) 形成完整的子代DNA
2.引物設計應注意的問題
(1)設計引物的依據:目的基因兩端的核苷酸序列。
(2)引物設計時既要考慮目的基因序列,又要考慮載體序列,原因:為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接,需在引物的5'端加上限制酶的酶切位點。
(3)使用的一對引物的序列不相同,因為目的基因兩端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物設計的要求(或引物失效的原因):每種引物內部不能發生局部堿基互補配對;兩種引物之間不能在局部發生堿基互補配對。
①每種引物內部不能發生局部堿基互補配對的原因:防止引物自身折疊。
②兩種引物之間不能在局部發生堿基互補配對的原因:防止引物之間配對,導致引物不能同模板鏈結合。
(5)兩種引物都結合在DNA模板鏈的3'端;脫氧核苷酸連接在引物的3'端進行延伸。
3.農桿菌轉化法分析
(1)構建基因表達載體需要兩種工具酶:限制酶和DNA連接酶。
(2)基因表達載體(重組質粒)導入農桿菌細胞時,要用Ca2+處理農桿菌細胞,使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,有利于重組質粒的導入。
(3)將導入目的基因的受體細胞培育成完整的植株要用到植物組織培養技術。
4.如何篩選出含有目的基因的受體細胞
(1)原理:將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時,如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內部,則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖,目的基因插入了四環素抗性基因內部,則四環素抗性基因失活。
(2)被轉化的細菌有三種:含目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含質粒的細菌。
(3)篩選方法:將細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養,能生長的是含重組質粒的細菌和含質粒的細菌,如圖中1、2、3、4、5菌落,再利用滅菌的絨布影印到含有四環素的培養基上,如圖能生長的菌落為2、3、4,則在含四環素培養基上不生長的即含有重組質粒的菌落,如圖中1、5菌落。最后,可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。
能力一　PCR的過程和應用分析(考查科學思維)
1.(2024·黑吉遼卷,T7)關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物的實驗,下列敘述正確的是(　　)
A.瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小
B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置
C.在同一電場作用下,DNA片段越長,向負極遷移速率越快
D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來
2.(2024·浙江1月選考,T22)鋅轉運蛋白在某種植物根部細胞特異性表達并定位于細胞質膜,具有吸收和轉運環境中Zn2+的功能。為研究該植物2種鋅轉運蛋白M和N與吸收Zn2+相關的生物學功能,在克隆M、N基因基礎上,轉化鋅吸收缺陷型酵母,進行細胞學鑒定。
回答下列問題:
(1)鋅轉運蛋白基因M、N克隆。以該植物__________為材料提取并純化mRNA,反轉錄合成cDNA。根據序列信息設計引物進行PCR擴增,PCR每個循環第一步是進行熱變性處理,該處理的效果類似于生物體內__________的作用效果。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳時,DNA分子因為含__________而帶負電荷,凝膠點樣孔端應靠近電泳槽負極接口;當2個PCR產物相對分子質量接近時,若延長電泳時間,凝膠中這2個條帶之間的距離會__________。回收DNA片段,連接至克隆載體,轉化大腸桿菌,測序驗證。
(2)重組表達載體構建。分別將含M、N基因的重組質粒和酵母表達載體同時進行雙酶切處理,然后利用______________連接,將得到的重組表達載體轉化大腸桿菌,用PCR快速驗證轉化是否成功,此反應可以用大腸桿菌懸液當模板的原因是______________________。
(3)酵母菌轉化。取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株,直接在固體培養基進行__________培養,活化后接種至液體培養基,采用__________以擴大菌體數量,用重組表達載體轉化酵母菌。檢測M、N基因在受體細胞中的表達水平,無顯著差異。
(4)轉基因酵母功能鑒定。分別將轉化了M、N基因的酵母菌株于液體培養基中培養至OD600為0.6,將菌液用______________法逐級稀釋至OD600為0.06、0.006和0.000 6,然后各取10 μL菌液用涂布器均勻涂布在固體培養基上,培養2天,菌落生長情況如圖。該實驗中陰性對照為__________。由實驗結果可初步推測:轉運蛋白M和N中,轉運Zn2+能力更強的是__________,依據是________________________________________。
[注]　OD600為波長600 nm下的吸光值,該值越大,菌液濃度越高;空載體為未插入M、N基因的表達載體。
能力二　基因工程的基本操作程序分析(考查科學思維、科學探究)
3.(2023·全國乙卷,T38節選)GFP是水母體內存在的能發綠色熒光的一種蛋白。科研人員以GFP基因為材料,利用基因工程技術獲得了能發其他顏色熒光的蛋白,豐富了熒光蛋白的顏色種類。回答下列問題:
(1)構建目的基因表達載體。科研人員從構建的GFP突變基因文庫中提取目的基因(均為突變基因)構建表達載體,其模式圖如圖所示(箭頭為GFP突變基因的轉錄方向)。圖中①為__________;②為__________,其作用是____________________________________________。
(2)目的基因的表達。科研人員將構建好的表達載體導入大腸桿菌中進行表達,發現大腸桿菌有的發綠色熒光,有的發黃色熒光,有的不發熒光。請從密碼子特點的角度分析,發綠色熒光的可能原因是____________________________________________(答出1點即可)。
(3)新蛋白與突變基因的關聯性分析。將上述發黃色熒光的大腸桿菌分離純化后,對其所含的GFP突變基因進行測序,發現其堿基序列與GFP基因的不同,將該GFP突變基因命名為YFP基因(黃色熒光蛋白基因)。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達,實驗思路是__________________________________________________________________。
4.(2024·湖南卷,T21)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價值,科研人員對其進行了多種育種技術研究。回答下列問題:
圖a
圖b
圖c
(1)體細胞雜交育種。進行不同種百合體細胞雜交前,先用__________去除細胞壁獲得原生質體,使原生質體融合,得到雜種細胞后,繼續培養,常用__________(填植物激素名稱)誘導愈傷組織形成和分化,獲得完整的雜種植株。
(2)單倍體育種。常用__________的方法來獲得單倍體植株,鑒定百合單倍體植株的方法是____________________________________________。
(3)基因工程育種。研究人員從野生百合中獲得一個抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因L,該基因及其上游的啟動子pL和下游的終止子結構如圖a。圖b是一種Ti質粒的結構示意圖,其中基因gus編碼GUS酶,GUS酶活性可反映啟動子活性。
①研究病原微生物對L的啟動子pL活性的影響。從圖a所示結構中獲取L,首先選用__________酶切,將其與相同限制酶酶切的Ti質粒連接,再導入煙草。隨機選取3組轉基因成功的煙草(P1、P2和P3)進行病原微生物脅迫,結果如圖c。由此可知:三種病原微生物都能誘導pL的活性增強,其中__________的誘導作用最強。
②現發現栽培種百合B中也有L,但其上游的啟動子與野生百合不同,且抗病性弱。若要提高該百合中L的表達量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種,簡要寫出實驗思路:____________________________________________。
考點三　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定
　
1.DNA的粗提取與鑒定
(1)實驗原理。
(2)方法步驟(以洋蔥為例)。
提醒　加入酒精和用玻璃棒攪拌時,動作要輕緩,以免加劇DNA分子的斷裂,導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
2.DNA片段的擴增
(1)原理:DNA的__________原理。
(2)PCR實驗的操作步驟。
提醒　①為避免外源DNA等因素的污染,PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
②每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換。
3.DNA片段的電泳鑒定
(1)原理。
①電泳的原理:DNA分子具有______________,在一定的pH下,這些基團可以帶上__________。在電場的作用下,這些帶電分子會向著與它所帶電荷__________的電極移動。
②鑒定的原理:PCR的產物一般通過__________來鑒定,在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的__________等有關;凝膠中的DNA分子通過__________,可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。
(2)過程。
(3)結果分析與評價。
①成功擴增出DNA片段的判斷依據是____________________________________________。
②進行電泳鑒定的結果應該是__________條條帶。如圖所示,該片段大小約為__________bp。
提醒　電泳時,DNA的相對分子質量越大,遷移速率越慢;DNA的相對分子質量越小,遷移速率越快。
能力一　DNA的粗提取與鑒定(考查科學探究)
1.(2023·廣東卷,T11)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的基本過程是裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是(　　)
A.裂解:使細胞破裂釋放出DNA等物質
B.分離:可去除混合物中的多糖、蛋白質等
C.沉淀:可反復多次以提高DNA的純度
D.鑒定:加入二苯胺試劑后即呈現藍色
2.(2024·山東卷,T13)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗,下列說法正確的是(　　)
A.整個提取過程中可以不使用離心機
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后,應充分搖勻再倒入燒杯中
C.鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發生改變
D.僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾
能力二　DNA片段的擴增及電泳鑒定(考查科學探究)
3.(2023·福建卷,T4)關于“DNA片段的擴增及電泳鑒定”(實驗Ⅰ)和“DNA的粗提取與鑒定”(實驗Ⅱ)的實驗操作,下列相關敘述正確的是 (　　)
A.實驗Ⅰ中,PCR實驗所需的移液器、槍頭、蒸餾水等必須進行高壓滅菌處理
B.實驗Ⅰ中,將擴增得到的PCR產物進行凝膠電泳,加樣前應先接通電源
C.實驗Ⅱ中,取洋蔥研磨液的上清液,加入等體積冷酒精后析出粗提取的DNA
D.實驗Ⅱ中,將白色絲狀物直接加入二苯胺試劑中并進行沸水浴,用于鑒定DNA
4.(2023·浙江6月選考,T19)某研究小組利用轉基因技術,將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只,交配以期獲得Gata3 GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型,設計了引物1和引物2用于PCR擴增,PCR產物電泳結果如圖乙所示。
甲
乙
下列敘述正確的是(　　)
A.Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因表達
B.翻譯時先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白
C.2號條帶的小鼠是野生型,4號條帶的小鼠是Gata3 GFP基因純合子
D.若用引物1和引物3進行PCR,能更好地區分雜合子和純合子
微真題重體悟
　
1.(2024·湖南卷,T5)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時,發現DNA完全沒有被酶切,分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是(　　)
A.限制酶失活,更換新的限制酶
B.酶切條件不合適,調整反應條件如溫度和酶的用量等
C.質粒DNA突變導致酶識別位點缺失,更換正常質粒DNA
D.酶切位點被甲基化修飾,換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
2.(2024·江西卷,T12)γ 氨基丁酸在醫藥等領域有重要的應用價值。利用L 谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L 谷氨酸脫羧是高效生產γ 氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L 谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E.coliA,構建了以L 谷氨酸鈉為底物高效生產γ 氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是(　　)
A.圖中表明,可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB
B.E.coliB發酵生產γ 氨基丁酸時,L 谷氨酸鈉的作用是供能
C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ 氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒
3.(2024·山東卷,T5)制備熒光標記的DNA探針時,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標記的dATP)的反應管①~④中,分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區遵循堿基互補配對原則,且在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續堿基對的雙鏈DNA區。能得到帶有熒光標記的DNA探針的反應管有(　　)
反應管 加入的單鏈DNA
① 5'—G C C G A T C T T T A T A—3' 3'—G A C C G G C T A G A A A—5'
② 5'—A G A G C C A A T T G G C—3'
③ 5'—A T T T C C C G A T C C G—3' 3'—A G G G C T A G G C A T A—5'
④ 5'—T T C A C T G G C C A G T—3'
A.①② B.②③
C.①④ D.③④
4.(2024·貴州卷,T21)研究者用以蔗糖為唯一碳源的液體培養基,培養真菌A的野生型(含NV基因)、突變體(NV基因突變)和轉基因菌株(轉入NV基因),檢測三種菌株NV酶的生成與培養液中的葡萄糖含量,結果如表所示(表中“+”表示有,“-”表示無)。
檢測用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培養液中)
野生型 + + +
野生型 - - -
突變體 + - -
轉基因菌株 + + +
回答下列問題:
(1)據表可推測__________誘導了NV基因表達。NV酶的作用是__________。檢測NV酶活性時,需測定的指標是________________________________________(答出1點即可)。
(2)表中突變體由T DNA隨機插入野生型菌株基因組DNA篩選獲得。從野生型與突變體中分別提取基因組DNA作為模板,用與__________(填“T DNA”或“NV基因”)配對的引物進行PCR擴增。若突變體擴增片段長度__________(填“>”“=”或“<”)野生型擴增片段長度,則表明突變體構建成功,從基因序列分析其原因是__________________________________________________________________。
(3)為進一步驗證NV基因的功能,表中的轉基因菌株是將NV基因導入__________細胞獲得的。在構建NV基因表達載體時,需要添加新的標記基因,原因是____________________________________________。
5.(2024·廣東卷,T21)駒形桿菌可合成細菌纖維素(BC)并將其分泌到胞外組裝成膜。作為一種性能優異的生物材料,BC膜應用廣泛。研究者設計了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表達載體,將其轉入駒形桿菌后構建出一株能合成BC膜并可實現光控染色的工程菌株,為新型紡織原料的綠色制造及印染工藝升級提供了新思路(圖1)。
圖1
回答下列問題:
(1)研究者優化了培養基的______________(答出兩點)等營養條件,并控制環境條件,大規模培養工程菌株后可在氣液界面處獲得BC菌膜(菌體和BC膜的復合物)。
(2)研究者利用T7噬菌體來源的RNA聚合酶(T7RNAP)及藍光光敏蛋白標簽,構建了一種可被藍光調控的基因表達載體(光控原理見圖2,載體的部分結構見圖3)。構建載體時,選用了通用型啟動子PBAD(被工程菌RNA聚合酶識別)和特異型啟動子PT7(僅被T7RNAP識別)。為實現藍光控制染色,啟動子①②及③依次為__________,理由是____________________________________________。
圖2
注:基因1編碼酪氨酸酶,基因2編碼T7RNAP N端-nMag,基因3編碼pMag-T7RNAP C端。
圖3
(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素,其作用為____________________________________________(答出兩點)。
(4)根據預設的圖案用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間,隨后將其轉至染色池處理,發現只有經藍光照射的區域被染成黑色,其原因是____________________________________________。
(5)有企業希望生產其他顏色圖案的BC膜。按照上述菌株的構建模式提出一個簡單思路:____________________________________________。
第42講　基因工程的基本工具和基本操作程序
微考點·大突破
考點一
教材解讀
1.(1)轉基因　(2)生物產品　(5)遺傳性狀
2.(1)原核生物　數千　特定核苷酸序列　磷酸二酯鍵　磷酸二酯鍵
(2)限制酶　(3)環狀　噬菌體　一個至多個　自我復制　受體DNA　標記
教材基礎辨析
　(1)×　(2)×　(3)√　(4)×　(5)×
教材素材拓展
　提示　(1)限制酶Nhe Ⅰ:
限制酶EcoR Ⅰ:
(2)用限制酶Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端相同,限制酶Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ切割后形成的黏性末端相同,實驗人員使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割質粒,應選用Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因
能力提升
1.C　解析　質粒的復制原點上有DNA聚合酶的結合位點,A項錯誤;①②③三種重組后細菌的外源基因插入點①是b,②是c,③是a,B項錯誤;將外源基因與質粒連接時需用DNA連接酶,D項錯誤。
2.答案　(1)EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ　(2)磷酸二酯鍵　(3)自我復制　限制酶切割位點　將待篩選的宿主細胞接種到含該抗生素的培養基中,能夠生長的是含有質粒載體的宿主細胞　(4)RNA聚合酶識別、結合并啟動轉錄的DNA片段
解析　(1)T4 DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端,又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端,題圖中四種限制酶切割后的DNA片段都可以用T4 DNA連接酶進行連接。(2)DNA連接酶是通過催化兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵,將雙鏈DNA片段“縫合”起來的。(3)作為載體,質粒DNA分子上必須有復制原點,才能使質粒在受體細胞中能進行自我復制;且質粒DNA分子上應具有一個至多個限制酶切割位點,便于外源DNA插入;質粒DNA分子上有標記基因,可以用添加特定抗生素的選擇培養基培養經轉化處理的宿主細胞,以達到篩選目的。(4)啟動子是指RNA聚合酶識別、結合并啟動轉錄的DNA片段。
考點二
教材解讀
1.(1)①受體細胞性狀　預期表達產物　編碼蛋白質　②a.結構和功能　(2)①DNA半保留復制　②高溫　4種脫氧核苷酸　耐高溫的DNA聚合酶　3'　③兩種引物　耐高溫的DNA聚合酶　④指數　⑤瓊脂糖凝膠電泳
2.(1)①受體細胞　(2)啟動子　標記基因
3.目的基因　子房　T DNA　染色體　顯微注射　受精卵
4.目的基因　雜交帶
教材基礎辨析
　(1)√　(2)×　(3)√　(4)×　(5)×　(6)√　(7)×
教材素材拓展
提示　(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。在DNA擴增時,DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從引物的3'端延伸DNA鏈,因此復制DNA時應加入兩種引物
(2)不需要,只要知道Bt基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據這部分序列合成兩種引物)
(3)引物是依據Bt抗蟲蛋白基因的一段已知序列設計合成的(或引物能與Bt基因的cDNA特異性結合)
(4)經過n輪循環,得到2n個DNA分子,含引物的DNA分子2n個,含引物A(或B)的DNA分子數(2n-1)個,同時含兩種引物的DNA分子(2n-2)個,共需要消耗(2n+1-2)個引物。含不等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子2n個,含等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子(2n-2n)個
能力提升
1.A　解析　瓊脂糖凝膠濃度太高會影響DNA片段的遷移,濃度太低則會導致分辨率降低,因此瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小,A項正確;凝膠載樣緩沖液中的指示劑可避免DNA分子遷移出凝膠,起到指示電泳進程的作用,不能指示DNA分子的具體位置,B項錯誤;DNA分子具有可解離的基團,在一定的pH下,這些基團可以帶上正電荷或負電荷,在同一電場作用下,DNA片段不一定向負極遷移,一般情況下,DNA片段越長移動速率越慢,C項錯誤;凝膠中的DNA分子通過染色后,可在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來,D項錯誤。
2.答案　(1)根　解旋酶　磷酸基團　變長　(2)DNA連接酶　熱變性使大腸桿菌細胞破裂,DNA流出　(3)劃線　振蕩培養　(4)梯度稀釋　鋅吸收缺陷型酵母+空載體　N　轉入N基因的這組酵母菌數量多
解析　(1)鋅轉運蛋白在某種植物根部細胞特異性表達,說明鋅轉運蛋白基因在該種植物根部細胞可轉錄出mRNA,再以mRNA為模板翻譯出鋅轉運蛋白,所以進行鋅轉運蛋白基因M、N克隆時,可以該植物根為材料提取并純化mRNA,反轉錄合成cDNA。PCR中熱變性處理時溫度超過了90 ℃,雙鏈DNA解旋為2條單鏈,該處理的效果類似于生物體內解旋酶的作用效果。DNA分子含磷酸基團,故帶負電荷。在凝膠中DNA分子的遷移速率與DNA分子的大小等有關,當2個PCR產物相對分子質量接近時,電泳時間過短會導致2個PCR產物分離不完全,而延長電泳時間可使2個PCR產物即凝膠中相應2個條帶之間的距離變長。(2)構建重組表達載體時,先分別將含M、N基因的重組質粒和酵母表達載體同時進行雙酶切處理,以得到相同的黏性末端或平末端,再利用DNA連接酶連接,將得到的重組表達載體轉化大腸桿菌,用PCR快速驗證重組轉化是否成功,此反應可以用大腸桿菌懸液當模板的原因是若轉化成功,則大腸桿菌的DNA中含有M、N基因,熱變性會使大腸桿菌細胞破裂,DNA流出。(3)菌株一般低溫保存于固體培養基上,故取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株,可直接在固體培養基上進行劃線培養。有氧條件下,酵母菌可以大量繁殖,故活化后接種至液體培養基,可采用振蕩培養以擴大菌體數量。(4)可采用梯度稀釋法對菌液逐級稀釋。該實驗中陰性對照為鋅吸收缺陷型酵母+空載體,其不含M、N基因。由“OD600為波長600 nm下的吸光值,該值越大,菌液濃度越高”及題圖中相同吸光值下(OD0.006和OD0.000 6),鋅吸收缺陷型酵母+N基因表達載體組酵母菌數量明顯多于鋅吸收缺陷型酵母+M基因表達載體組,可知,轉運蛋白M和N中,轉運Zn2+能力更強的是N。
3.答案　(1)終止子　啟動子　被RNA聚合酶識別并結合,驅動GFP突變基因的轉錄
(2)密碼子的簡并性使GFP基因突變后編碼的蛋白質與突變前相同
(3)選擇合適的運載體,利用合適的限制酶和DNA連接酶將YFP基因和運載體連接起來,構建基因表達載體,之后將基因表達載體導入酵母菌,檢測酵母菌是否會發黃色熒光
解析　(1)一個基因表達載體的組成,除了目的基因,還必須有啟動子、終止子以及標記基因等。啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶識別和結合的部位,有了它才能驅動基因轉錄出mRNA,最終表達出人類需要的蛋白質。終止子相當于一盞紅色信號燈,使轉錄在所需要的地方停下來,位于基因的下游,也是一段有特殊序列結構的DNA片段。(2)結合題中信息可知,將構建好的表達載體導入大腸桿菌中進行表達,發現有的大腸桿菌發綠色熒光,即GFP蛋白的熒光顏色,推測發綠色熒光的可能原因是密碼子的簡并性使GFP基因突變后編碼的蛋白質與突變前的相同。(3)欲通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達,可通過基因工程的方法將目的基因導入酵母菌,之后檢測酵母菌是否發黃色熒光,如果發黃色熒光,則可證明YFP基因能在真核細胞中表達,否則,不能證明YFP基因能在真核細胞中表達。
4.答案　(1)纖維素酶和果膠酶　生長素和細胞分裂素　(2)花藥離體培養　利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細胞中染色體的數目　(3)①HindⅢ和BamHⅠ　交鏈格孢　②利用轉基因技術將百合B中L基因的啟動子替換為野生百合中L基因的啟動子pL
解析　(1)植物細胞細胞壁的主要成分是纖維素和果膠,因此獲得原生質體的方法是用纖維素酶和果膠酶對植物細胞進行處理。原生質體融合后形成雜種細胞,給予適宜的條件培養雜種細胞,并添加生長素和細胞分裂素誘導愈傷組織形成和分化,從而獲得完整的雜種植株。(2)獲得單倍體植株的常用方法是花藥(花粉)離體培養;鑒定百合單倍體植株的方法是利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細胞中染色體的數目,如果染色體數目為百合植株根尖有絲分裂中期的一半,則獲得的植株為單倍體植株。(3)①根據目的片段以及質粒上限制酶的識別位點,若要獲得pL并將其連接到質粒上,可選用限制酶HindⅢ、BamHⅠ進行酶切,以替換Ti質粒中的啟動子,從而達到根據GUS酶活性反映病原微生物對啟動子pL活性的影響的目的。根據題圖c的結果可知,交鏈格孢處理的每一組轉基因煙草中的GUS酶活性都最高,可確定其誘導作用最強。②欲提高百合B中L基因的表達量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種,可利用轉基因技術將百合B中L基因的啟動子替換為野生百合中L基因的啟動子pL。
考點三
實驗基礎
1.(1)不溶于　2 mol/L　二苯胺　(2)研磨　上清液　95%　一個方向　2 mol/L　二苯胺　5 min　藍色
2.(1)熱變性　(2)微量移液器　離心管　底部　PCR儀
3.(1)①可解離的基團　正電荷或負電荷　相反　②瓊脂糖凝膠電泳
大小和構象　染色　(2)電泳　凝膠載樣　紫外燈　(3)①可以在波長為300 nm的紫外燈下直接觀察到DNA條帶　②一　750
能力提升
1.D　解析　裂解的目的是使細胞破裂釋放出DNA等物質,A項正確;DNA不溶于酒精,但某些蛋白質溶于酒精,利用這一原理,可以初步分離DNA與蛋白質等,DNA分離過程中混合物中的多糖、蛋白質等可被去除,B項正確;DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質,可反復多次以提高DNA的純度,C項正確;將DNA溶于NaCl溶液中,加入二苯胺試劑,沸水浴五分鐘,待冷卻后,溶液能呈現藍色,D項錯誤。
2.A　解析　DNA的提取過程中可以不使用離心機,可將過濾好的研磨液在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后,直接取上清液放入燒杯中,A項正確,B項錯誤;鑒定過程需要沸水浴加熱,DNA分子在高溫下會解螺旋,雙螺旋結構會發生改變,C項錯誤;加熱是唯一變量,設置一個加二苯胺不加DNA的對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾,D項錯誤。
3.C　解析　為避免外源DNA等因素的污染,PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理,但移液器不需要,A項錯誤;在將擴增得到的PCR產物進行凝膠電泳時,應先加樣,然后接通電源,B項錯誤;由于DNA不溶于酒精,但某些蛋白質溶于酒精,因此取洋蔥研磨液的上清液,加入等體積冷酒精后,析出的白色絲狀物即粗提取的DNA,C項正確;鑒定DNA時,需要把白色絲狀物溶解在2 mol·L-1的NaCl溶液中,再加入二苯胺試劑進行沸水浴,D項錯誤。
4.B　解析　由題圖甲可知,Gata3基因與GFP基因共用一個啟動子,且由題干可知兩基因能正常表達出相關蛋白質,A項錯誤;由于啟動子在左側,基因在右側,轉錄基因時,先轉錄Gata3基因,再轉錄GFP基因,且翻譯的方向是沿mRNA的5'→3',因此翻譯時先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白,B項正確;由題圖乙可知,大片段包含GFP基因編碼區片段,小片段不包含GFP基因編碼區片段,則2號小鼠是Gata3 GFP基因純合子,4號小鼠是野生型,C項錯誤;若用引物1和引物3進行PCR,雜合子和Gata3 GFP基因純合子均能擴增出條帶,僅有Gata3基因時無法擴增出條帶,不利于區分雜合子和純合子,D項錯誤。
微真題·重體悟
1.B　解析　限制酶失活會使DNA完全不被酶切,此時應更換新的限制酶,A項正確;酶切條件不合適通常會使切割效果下降,此時應有部分DNA被酶切,B項錯誤;質粒DNA突變導致限制酶識別位點缺失,會造成限制酶無法進行切割,因此應更換為正常質粒DNA,C項正確;質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾,會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切,此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶,D項正確。
2.A　解析　分析題圖可知,可以從釀酒酵母S中篩選、分離出目的基因gadB,A項正確;由題意知,L 谷氨酸鈉是生產γ 氨基丁酸的底物,不能用來供能,B項錯誤;將目的基因(gadB)導入菌株E.coliA構建高效生產γ 氨基丁酸的菌株E.coliB,E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ 氨基丁酸,C項錯誤;選擇限制酶時需考慮多種條件,如確保目的基因不被限制酶破壞、切割位點應精準位于啟動子和終止子之間、避免對啟動子和終止子造成任何損害等,同時在設計特異性引物時,還需要在其5'端設計限制酶酶切位點,以便構建重組質粒,根據題干提供的信息,無法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ,D項錯誤。
3.D　解析　反應管②和④雖然只有一種單鏈,但是單鏈含回文序列,可以同種單鏈之間發生互補,四個反應管中單鏈DNA互補配對情況如圖所示:
由圖分析可知,D項正確。
4.答案　(1)蔗糖　催化蔗糖轉化成葡萄糖　單位時間單位體積的培養液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的減少量)　(2)NV基因　>　與野生型相比,突變體是由T DNA插入NV基因中,使NV基因發生了堿基對的增添而引起的,因此突變體相應基因的序列更長　(3)突變體　突變體的T DNA上會存在相應的標記基因,干擾NV基因表達載體導入成功與否的檢測
解析　(1)據題表中野生型菌株的兩組結果對比分析可知,如果培養液中添加了蔗糖,NV基因就會表達形成NV酶,否則沒有NV酶的形成,由此推測蔗糖誘導了NV基因表達。分析題表可知,當蔗糖和NV酶同時存在時,培養液中就會出現葡萄糖,由此說明NV酶的作用是催化蔗糖轉化成葡萄糖。酶的活性可以用單位時間單位體積反應物的減少量或生成物的增加量表示,因此NV酶的活性可以用單位時間單位體積的培養液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的減少量)表示。(2)根據題意,突變體是由T DNA隨機插入野生型菌株,使NV基因發生了突變產生的,說明T DNA插入了NV基因中,使NV基因發生了堿基對的增添,即突變體中NV基因突變后的序列比野生型的NV基因序列更長,所以用與NV基因配對的引物進行擴增,擴增的結果是突變體擴增片段的長度更長。(3)為了進一步驗證NV基因的功能,在突變體(NV基因突變)細胞中,轉入NV基因,以便將轉基因植株與突變體(NV基因突變)的結果進行對比。由于突變體的T DNA上會存在原有的標記基因,干擾NV基因表達載體導入成功與否的檢測,因此在構建NV基因表達載體時,需要添加新的標記基因。
5.答案　(1)碳源、氮源　(2)PT7、PBAD、PBAD　基因2、3可正常表達出無活性產物,藍光照射時再激活基因1(或酪氨酸酶基因或目的基因)的表達　(3)選擇含有重組質粒的駒形桿菌,殺死其他雜菌避免污染　(4)藍光照射誘導nMag和pMag結合,激活T7RNAP,從而與特異型啟動子PT7結合,酪氨酸酶基因表達合成酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素　(5)將酪氨酸酶基因換成合成其他色素酶的基因,催化產生不同的色素
解析　(1)培養基的營養物質包括水、無機鹽、碳源、氮源等,研究者培養工程菌,需要優化培養基的碳源、氮源等營養條件,并控制環境條件。(2)依據題圖2及題干信息可知,為實現藍光控制染色,應該先合成無活性的T7RNAP,故基因2、3的上游應連接通用型啟動子。在藍光誘導下合成酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素,實現藍光控制染色。此過程中酪氨酸酶需要特異性合成,因此基因1上游應連接僅被T7RNAP識別的PT7啟動子。(3)將攜帶大觀霉素抗性基因的光控表達載體導入駒形桿菌,會獲得未成功導入的菌株和成功導入的工程菌株,長時間培養時也可能感染其他雜菌,在培養液中加入大觀霉素(抗生素)可以篩選出工程菌株,同時也能抑制其他雜菌的生長,提高工程菌的生產效率。(4)詳見答案。(5)為獲得不同顏色圖案的BC膜,可以利用題述光控基因表達載體,將酪氨酸酶基因換成控制合成其他色素酶的基因,催化產生不同的色素。(共131張PPT)
第42講
第九單元　生物技術與工程
基因工程的基本工具和基本操作程序
課
標
內
容
1.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。3.DNA的粗提取與鑒定實驗。4.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。
微考點 大突破
內容
索引
微真題 重體悟
考點一　重組DNA技術的基本工具
考點二　基因工程的基本操作程序
考點三　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定
考點一　重組DNA技術的基本工具
微考點/大突破
第一部分
1.基因工程的概念
(1)手段：基因工程是指按照人們的愿望，通過________等技術，賦予生物新的遺傳特性。
(2)目的：創造出更符合人們需要的新的生物類型和_________。
(3)水平：DNA分子水平。
(4)基礎：生物化學、分子生物學和微生物學等學科。
(5)意義：克服遠緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的_________。
轉基因
生物產品
遺傳性狀
提醒　基因工程的理論基礎
2.基因工程的基本工具
(1)限制性內切核酸酶——“分子手術刀”。
原核生物
數千
特定核苷酸序列
磷酸二酯鍵
磷酸二酯鍵
提醒　①限制酶的識別序列一般由6個核苷酸組成，少數由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。
②限制酶作用的化學鍵只能是磷酸二酯鍵。
③在切割含目的基因的DNA分子時，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產生4個末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。
(2)DNA連接酶——“分子縫合針”。
限制酶
(3)基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”。
環狀
噬菌體
一個至多個
自我復制
受體DNA
標記
教材基礎辨析
(1)基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA連接酶、載體。(源自選擇性必修3 P70)( )
(2)限制酶能夠識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的氫鍵斷開。(源自選擇性必修3 P71)( )
(3)限制酶在識別序列中心軸線兩側切開形成的是黏性末端，在識別序列中心軸線處切開形成的是平末端。(源自選擇性必修3 P71)( )
×
×
√
(4)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA。(源自選擇性必修3 P72)( )
(5)載體質粒通常以抗生素合成基因作為篩選的標記基因。(源自選擇性必修3 P72)( )
×
×
教材素材拓展
將從蘇云金桿菌中獲取的Bt基因轉入棉花細胞內培育轉基因抗蟲棉的過程中，需借助多種分子工具且經歷多個操作步驟。實驗人員使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割質粒。如圖表示常用的限制酶識別序列和切割位點以及質粒上的限制酶切割位點。請回答下列問題：
(1)請用圖示法寫出限制酶Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成黏性末端的過程。
限制酶Nhe Ⅰ：

限制酶EcoR Ⅰ：
(2)切割圖示中的目的基因應選用哪類限制酶 請說明理由。
答：_______________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
用限制酶Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，限制酶Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，實驗人員使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割質粒，應選用Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因
限制酶的選擇
(1)不破壞目的基因原則：如圖中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。
(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則，如圖所示。
(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點時，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點的兩種不同的限制酶，對目的基因所在序列和載體進行剪切，即“雙酶切法”。其優點和作用是①防止目的基因環化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動方向”)必須是相同的，否則目的基因導入后無法正常表達。如圖甲、乙也可選擇Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制酶。
(4)巧用“同尾酶”：“同尾酶”指來源不同，但能產生相同黏性末端的限制酶。當不適合選擇某種限制酶時，可用其“同尾酶”替換，以獲得相
同的黏性末端。
(5)根據Ti質粒的T-DNA片段選擇限制酶，圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取，而丙Ti質粒宜選取(設切割目的基因的限制酶為Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。
能力　辨析基因工程的基本工具(考查科學思維)
1.(2025·連云港模擬)質粒是基因工程中最常用的載體，質粒有標記基因(如圖所示)，通過標記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉移成功。質粒上箭頭表示
三種限制酶的酶切位點。外源基因插入的位置不同，細菌在培養基上的生長情況不同。如表是外源基因插入 (插入點有a、b、c)后細菌的生長情況。下列有關敘述正確的是(　　)
項目 細菌在含氨芐青霉素的培養基上生長情況 細菌在含四環素的培養基上生長情況
① 能生長 不能生長
② 能生長 能生長
③ 不能生長 能生長
A.質粒的復制原點上有RNA聚合酶的結合位點
B.①②③三種重組后細菌的外源基因插入點①是a，②是c，③是b
C.質粒被一種限制酶切開時，被水解的磷酸二酯鍵有2個
D.將外源基因與質粒連接時需用DNA聚合酶
質粒的復制原點上有DNA聚合酶的結合位點，A項錯誤；①②③三種重組后細菌的外源基因插入點①是b，②是c，③是a，B項錯誤；將外源基因與質粒連接時需用DNA連接酶，D項錯誤。
解析
2.用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示。

回答下列問題：
(1)常用的DNA連接酶有E.coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶。圖中__________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接。
(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是______________。
EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ
磷酸二酯鍵
(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征。如質粒DNA分子上有復制原點，可以保證質粒在受體細胞中能____________；質粒DNA分子上有__________________，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞，方法是_________________________________
_____________________________________________________。
自我復制
限制酶切割位點
將待篩選的宿主細胞接種到含該抗生素的培養基中，能夠生長的是含有質粒載體的宿主細胞
(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指___________________________
______________________。
RNA聚合酶識別、結合并啟動轉錄的DNA片段
(1)T4 DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，題圖中四種限制酶切割后的DNA片段都可以用T4 DNA連接酶進行連接。(2)DNA連接酶是通過催化兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，將雙鏈DNA片段“縫合”起來的。(3)作為載體，質粒DNA分子上必須有復制原點，才能使質粒在受體細胞中能進行自我復制；且質粒DNA分子上應具有一個至多個限制酶切割位點，便于外源DNA插入；質粒DNA分子上有標記基因，可以用添加特定抗生素的選擇培養基培養經轉化處理的宿主細胞，以達到篩選目的。 (4)啟動子是指RNA聚合酶識別、結合并啟動轉錄的DNA片段。
解析
與DNA有關的幾種酶的比較
考點二　基因工程的基本操作程序
微考點/大突破
第一部分
1.目的基因的篩選與獲取
(1)篩選合適的目的基因。
①目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變_____________或獲得______________等的基因，主要是指____________的基因。
②篩選目的基因的方法。
a.從已知____________清晰的基因中進行篩選。
b.利用序列數據庫和序列比對工具進行篩選。
受體細胞性狀
預期表達產物
編碼蛋白質
結構和功能
(2)利用PCR獲取和擴增目的基因。
①原理：_________________。
②條件：基本條件。
參與的組分 在DNA復制中的作用
解旋酶 (體外用______代替) 打開DNA雙鏈
DNA母鏈 提供DNA復制的模板
DNA半保留復制
高溫
______________ 合成DNA子鏈的原料
____________________ 催化合成DNA子鏈
引物 使DNA聚合酶能夠從引物的______端開始連接脫氧核苷酸
4種脫氧核苷酸
耐高溫的DNA聚合酶
3'
③過程。
兩種引物
④結果：每次循環后目的基因的量增加一倍，即成________形式擴增(約為2n，其中n為擴增循環的次數)。
⑤PCR產物的鑒定：常采用_________________來鑒定。
耐高溫的DNA聚合酶
指數
瓊脂糖凝膠電泳
提醒　①在PCR過程中實際加入的原料為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，作為新子鏈的合成起點，只能結合在母鏈的3'端，使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。
③復性溫度過高，則引物難以與模板鏈結合，溫度過低則易使兩條母鏈配對結合，均無法獲得PCR產物。
④真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反應緩沖液中一般要添加Mg2+。
2.基因表達載體的構建——基因工程的核心
(1)目的。
①使目的基因在__________中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。
②使目的基因能夠表達和發揮作用。
受體細胞
(2)基因表達載體的組成及作用。
啟動子
標記基因
(3)基因表達載體的構建過程。
項目 本質 位置 功能
啟動子 DNA片段 目的基 因上游 RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA
終止子 DNA片段 目的基 因下游 使轉錄在所需要的地方停下來
起始 密碼子 mRNA上三個 相鄰的堿基 mRNA 首端 翻譯的起始信號(編碼氨基酸)
終止 密碼子 mRNA上三個 相鄰的堿基 mRNA 尾端 翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)
提醒　啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
3.將目的基因導入受體細胞
受體細胞 導入方法 內容
植物 細胞 花粉管 通道法 用微量注射器將含_________的DNA溶液直接注入______中等
農桿菌 轉化法 農桿菌細胞內的Ti質粒上的________可攜帶目的基因整合到受體細胞的________DNA上
目的基因
子房
T-DNA
染色體
動物 細胞 ____________技術 常用受體細胞：________
原核 細胞 Ca2+處 理法 用Ca2+處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態
顯微注射
受精卵
提醒　①農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上。第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入農桿菌。第二次導入(非人工操作)是指將含目的基因的T-DNA導入受體細胞。
②導入的目的基因，可能存在于細胞質中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的檢測與鑒定
目的基因
雜交帶
教材基礎辨析
(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。(選擇性必修3 P77“相關信息”)( )
(2)PCR技術擴增目的基因時不必知道基因的全部序列，該技術既可以擴增DNA又可以直接擴增mRNA。(選擇性必修3 P79“旁欄思考”) ( )
(3)構建基因表達載體是轉基因工程的核心工作，唯一不需要進行堿基互補配對的過程是將目的基因導入受體細胞。(源自選擇性必修3 P80)( )
√
×
√
(4)啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結合的部分，有了它才能驅動DNA的復制過程。(源自選擇性必修3 P80)( )
(5)可以將生物的所有DNA通過注射或花粉管通道法轉入植物細胞 中，就可獲得具有理想性狀的轉基因植物。(選擇性必修3 P80“旁欄思考”)( )
(6)轉化是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。(選擇性必修3 P81“資料卡”)( )
(7)應用PCR技術，可以檢測轉基因抗凍番茄植株中目的基因是否存在及其是否表達。(源自選擇性必修3 P82)( )
×
×
√
×
教材素材拓展
Bt抗蟲蛋白基因(簡稱Bt基因)是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因，篩選Bt基因后可以利用PCR技術對其進行大量擴增。回答下列問題：
(1)什么是引物 DNA復制時為什么需要引物
答：_______________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________。
引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3'端延伸DNA鏈，因此復制DNA時應加入兩種引物
(2)PCR擴增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列嗎
答：_______________________________________________________
_________________________。
(3)為檢測Bt基因在轉基因抗蟲棉細胞中是否轉錄，科研人員提取棉花細胞中的總RNA，經逆轉錄過程獲得總cDNA，通過PCR技術可在總cDNA中專一性地擴增出Bt基因的cDNA，原因是什么
答：_______________________________________________________
________________________________。
不需要，只要知道Bt基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據這部分序列合成兩種引物)
引物是依據Bt抗蟲蛋白基因的一段已知序列設計合成的(或引物能與Bt基因的cDNA特異性結合)
(4)PCR擴增過程中的循環圖示與規律如圖所示，若一個Bt抗蟲蛋白基因在PCR中經過n輪循環，理論上得到多少個DNA分子 含引物的DNA分子多少個 含引物A(或B)的DNA分子多少個 同時含兩種引物的DNA分子多少個
共需要消耗多少個引物 含不等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個 含等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個
答：_______________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
經過n輪循環，得到2n個DNA分子，含引物的DNA分子2n個，含引物A(或B)的DNA分子數(2n-1)個，同時含兩種引物的DNA分子(2n-2)個，共需要消耗(2n+1-2)個引物。含不等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子2n個，含等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子(2n-2n)個
1.體內DNA復制與PCR技術的比較
PCR技術 體內DNA復制
相同點 原則 堿基互補配對
條件 DNA母鏈作為模板、引物(體內引物RNA、體外引物DNA)、4種脫氧核苷酸為原料
延伸方向 新鏈都是從5'端向3'端延伸
不同點 解旋方式 90℃以上高溫解旋 解旋酶催化
場所 PCR擴增儀 主要在細胞核
延伸用酶 耐高溫的DNA聚合酶 DNA聚合酶
溫度 控制溫度，需要在不同溫度下進行 細胞內溫和條件
不同點 過程

結果 大量的DNA片段(或目的基因) 形成完整的子代DNA
2.引物設計應注意的問題
(1)設計引物的依據：目的基因兩端的核苷酸序列。
(2)引物設計時既要考慮目的基因序列，又要考慮載體序列，原因：為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的5'端加上限制酶的酶切位點。
(3)使用的一對引物的序列不相同，因為目的基因兩端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物設計的要求(或引物失效的原因)：每種引物內部不能發生局部堿基互補配對；兩種引物之間不能在局部發生堿基互補配對。
①每種引物內部不能發生局部堿基互補配對的原因：防止引物自身折疊。
②兩種引物之間不能在局部發生堿基互補配對的原因：防止引物之間配對，導致引物不能同模板鏈結合。
(5)兩種引物都結合在DNA模板鏈的3'端；脫氧核苷酸連接在引物的3'端進行延伸。
3.農桿菌轉化法分析
(1)構建基因表達載體需要兩種工具酶：限制酶和DNA連接酶。
(2)基因表達載體(重組質粒)導入農桿菌細胞時，要用Ca2+處理農桿菌細胞，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，有利于重組質粒的導入。
(3)將導入目的基因的受體細胞培育成完整的植株要用到植物組織培養技術。
4.如何篩選出含有目的基因的受體細胞
(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。
(2)被轉化的細菌有三種：含目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含質粒的細菌。
(3)篩選方法：將細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含質粒的細菌，如圖中1、2、3、4、5菌 落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即含有重組質粒的菌落，如圖中1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。
能力一　PCR的過程和應用分析(考查科學思維)
1.(2024·黑吉遼卷，T7)關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物的實驗，下列敘述正確的是(　　)
A.瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小
B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置
C.在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快
D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來
瓊脂糖凝膠濃度太高會影響DNA片段的遷移，濃度太低則會導致分辨率降低，因此瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小，A項正確；凝膠載樣緩沖液中的指示劑可避免DNA分子遷移出凝膠，起到指示電泳進程的作用，不能指示DNA分子的具體位置，B項錯誤；DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH 下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在同一電場作用下，DNA片段不一定向負極遷移，一般情況下，DNA片段越長移動速率越慢，C項錯誤；凝膠中的DNA分子通過染色后，可在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來，D項錯誤。
解析
2.(2024·浙江1月選考，T22)鋅轉運蛋白在某種植物根部細胞特異性表達并定位于細胞質膜，具有吸收和轉運環境中Zn2+的功能。為研究該植物2種鋅轉運蛋白M和N與吸收Zn2+相關的生物學功能，在克隆 M、N基因基礎上，轉化鋅吸收缺陷型酵母，進行細胞學鑒定。
回答下列問題：
(1)鋅轉運蛋白基因M、N克隆。以該植物________為材料提取并純化mRNA，反轉錄合成cDNA。根據序列信息設計引物進行PCR擴增，PCR每個循環第一步是進行熱變性處理，該處理的效果類似于生物體內________的作用效果。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳時，DNA分子因為含__________而帶負電荷，凝膠點樣孔端應靠近電泳槽負極接口；當2個PCR產物相對分子質量接近時，若延長電泳時間，凝膠中這2個條帶之間的距離會________。回收DNA片段，連接至克隆載體，轉化大腸桿菌，測序驗證。
根
解旋酶
磷酸基團
變長
(2)重組表達載體構建。分別將含M、N基因的重組質粒和酵母表達載體同時進行雙酶切處理，然后利用____________連接，將得到的重組表達載體轉化大腸桿菌，用PCR快速驗證轉化是否成功，此反應可以用大腸桿菌懸液當模板的原因是_____________________________
_____________。
(3)酵母菌轉化。取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，直接在固體培養基進行________培養，活化后接種至液體培養基，采用__________以擴大菌體數量，用重組表達載體轉化酵母菌。檢測M、N基因在受體細胞中的表達水平，無顯著差異。
DNA連接酶
熱變性使大腸桿菌細胞破裂，DNA流出
劃線
振蕩培養
(4)轉基因酵母功能鑒定。分別將轉化了M、N基因的酵母菌株于液體培養基中培養至OD600為0.6，將菌液用____________法逐級稀釋至OD600為0.06、0.006和0.000 6，然后各取10 μL菌液用涂布器均勻涂布在固體培養基上，培養2天，菌落生長情況如圖。該實驗中陰性對照為_________________________。由實驗結果可初步推測：轉運蛋白M和N中，轉運Zn2+能力更強的是________，依據是______________
__________________。
梯度稀釋
鋅吸收缺陷型酵母+空載體
N
轉入N基因的這組酵母菌數量多
[注]　OD600為波長600 nm下的吸光值，該值越大，菌液濃度越高；空載體為未插入M、N基因的表達載體。
(1)鋅轉運蛋白在某種植物根部細胞特異性表達，說明鋅轉運蛋白基因在該種植物根部細胞可轉錄出mRNA，再以mRNA為模板翻譯出鋅轉運蛋白，所以進行鋅轉運蛋白基因M、N克隆時，可以該植物根為材料提取并純化mRNA，反轉錄合成cDNA。PCR中熱變性處理時溫度超過了90 ℃，雙鏈DNA解旋為2條單鏈，該處理的效果類似于生物體內解旋酶的作用效果。DNA分子含磷酸基團，故帶負電荷。在凝膠中DNA分子的遷移速率與DNA分子的大小等
解析
有關，當2個PCR產物相對分子質量接近時，電泳時間過短會導致2個PCR產物分離不完全，而延長電泳時間可使2個PCR產物即凝膠中相應2個條帶之間的距離變長。(2)構建重組表達載體時，先分別將含M、N基因的重組質粒和酵母表達載體同時進行雙酶切處理，以得到相同的黏性末端或平末端，再利用DNA連接酶連接，將得到的重組表達載體轉化大腸桿菌，用PCR快速驗證重組轉化是否成功，此反應可以用大腸桿菌懸液當模板的原因是若轉化成
解析
功，則大腸桿菌的DNA中含有M、N基因，熱變性會使大腸桿菌細胞破裂，DNA流出。(3)菌株一般低溫保存于固體培養基上，故取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，可直接在固體培養基上進行劃線培養。有氧條件下，酵母菌可以大量繁殖，故活化后接種至液體培養基，可采用振蕩培養以擴大菌體數量。(4)可采用梯度稀釋法對菌液逐級稀釋。該實驗中陰性對照為鋅吸收缺陷型酵母+空載
解析
體，其不含M、N基因。由“OD600為波長600 nm下的吸光值，該值越大，菌液濃度越高”及題圖中相同吸光值下(OD0.006和OD0.000 6)，鋅吸收缺陷型酵母+N基因表達載體組酵母菌數量明顯多于鋅吸收缺陷型酵母+M基因表達載體組，可知，轉運蛋白M和N中，轉運Zn2+能力更強的是N。
解析
能力二　基因工程的基本操作程序分析(考查科學思維、科學探究)
3.(2023·全國乙卷，T38節選)GFP是水母體內存在的能發綠色熒光的一種蛋白。科研人員以GFP基因為材料，利用基因工程技術獲得了能發其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類。回答下列問題：
(1)構建目的基因表達載體。科研人員從構建的GFP突變基因文庫中提取目的基因(均為突變基因)構建表達載體，其模式圖如圖所示(箭頭為GFP突變基因的轉錄方向)。圖中①為_______；②為________，其作用是_________________________________________________。
終止子
啟動子
被RNA聚合酶識別并結合，驅動GFP突變基因的轉錄
(2)目的基因的表達。科研人員將構建好的表達載體導入大腸桿菌中進行表達，發現大腸桿菌有的發綠色熒光，有的發黃色熒光，有的不發熒光。請從密碼子特點的角度分析，發綠色熒光的可能原因是___________________________________________________________ (答出1點即可)。
密碼子的簡并性使GFP基因突變后編碼的蛋白質與突變前相同
(3)新蛋白與突變基因的關聯性分析。將上述發黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對其所含的GFP突變基因進行測序，發現其堿基序列與GFP基因的不同，將該GFP突變基因命名為YFP基因(黃色熒光蛋白基因)。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達，實驗思路是___________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________。
選擇合適的運載體，利用合適的限制酶和DNA連接酶將YFP基因和運載體連接起來，構建基因表達載體，之后將基因表達載體導入酵母菌，檢測酵母菌是否會發黃色熒光
(1)一個基因表達載體的組成，除了目的基因，還必須有啟動子、終止子以及標記基因等。啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質。終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉錄在所需要的地方停下來，位于基因的下游，也是一段有特殊序列結構的DNA片段。(2)結合題中信息可知，將構建好的表達載體導入大腸桿菌中進行表達，
解析
發現有的大腸桿菌發綠色熒光，即GFP蛋白的熒光顏色，推測發綠色熒光的可能原因是密碼子的簡并性使GFP基因突變后編碼的蛋白質與突變前的相同。(3)欲通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細胞中表達，可通過基因工程的方法將目的基因導入酵母菌，之后檢測酵母菌是否發黃色熒光，如果發黃色熒光，則可證明YFP基因能在真核細胞中表達，否則，不能證明YFP基因能在真核細胞中表達。
解析
4.(2024·湖南卷，T21)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價值，科研人員對其進行了多種育種技術研究。回答下列問題：
(1)體細胞雜交育種。進行不同種百合體細胞雜交前，先用________
____________去除細胞壁獲得原生質體，使原生質體融合，得到雜種細胞后，繼續培養，常用____________________(填植物激素名稱)誘導愈傷組織形成和分化，獲得完整的雜種植株。
纖維素
酶和果膠酶
生長素和細胞分裂素
(2)單倍體育種。常用________________的方法來獲得單倍體植株，鑒定百合單倍體植株的方法是_________________________________
_____________________。
(3)基因工程育種。研究人員從野生百合中獲得一個抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因L，該基因及其上游的啟動子pL和下游的終止子結構如圖a。圖b是一種Ti質粒的結構示意圖，其中基因gus編碼GUS酶，GUS酶活性可反映啟動子活性。
花藥離體培養
利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細胞中染色體的數目
①研究病原微生物對L的啟動子pL活性的影響。從圖a所示結構中獲取L，首先選用__________________酶切，將其與相同限制酶酶切的Ti質粒連接，再導入煙草。隨機選取3組轉基因成功的煙草(P1、P2和P3)進行病原微生物脅迫，結果如圖c。由此可知：三種病原微生物都能誘導pL的活性增強，其中___________的誘導作用最強。
HindⅢ和BamHⅠ
交鏈格孢
②現發現栽培種百合B中也有L，但其上游的啟動子與野生百合不 同，且抗病性弱。若要提高該百合中L的表達量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，簡要寫出實驗思路：_________________
_________________________________________________________。
利用轉基因技術將百合B中L基因的啟動子替換為野生百合中L基因的啟動子pL
(1)植物細胞細胞壁的主要成分是纖維素和果膠，因此獲得原生質體的方法是用纖維素酶和果膠酶對植物細胞進行處理。原生質體融合后形成雜種細胞，給予適宜的條件培養雜種細胞，并添加生長素和細胞分裂素誘導愈傷組織形成和分化，從而獲得完整的雜種植株。(2)獲得單倍體植株的常用方法是花藥(花粉)離體培養；鑒定百合單倍體植株的方法是利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細胞中染色體的數目，如果染色體數目為百合植株根尖有絲分裂中期的一半，則獲得的植株為單倍體植株。(3)①根據目的片段以
解析
及質粒上限制酶的識別位點，若要獲得pL并將其連接到質粒上，可選用限制酶HindⅢ、BamHⅠ進行酶切，以替換Ti質粒中的啟動子，從而達到根據GUS酶活性反映病原微生物對啟動子pL活性的影響的目的。根據題圖c的結果可知，交鏈格孢處理的每一組轉基因煙草中的GUS酶活性都最高，可確定其誘導作用最強。②欲提高百合B中L基因的表達量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，可利用轉基因技術將百合B中L基因的啟動子替換為野生百合中L基因的啟動子pL。
解析
考點三　DNA的粗提取與鑒定、DNA片段
的擴增及電泳鑒定
微考點/大突破
第一部分
1.DNA的粗提取與鑒定
(1)實驗原理。
不溶于
2 mol/L
二苯胺
(2)方法步驟(以洋蔥為例)。
研磨
上清液
95%
一個方向
提醒　加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
2 mol/L
二苯胺
5 min
藍色
2.DNA片段的擴增
(1)原理：DNA的__________原理。
(2)PCR實驗的操作步驟。
熱變性
微量移液器
離心管
提醒　①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
②每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
底部
PCR儀
3.DNA片段的電泳鑒定
(1)原理。
①電泳的原理：DNA分子具有______________，在一定的pH下，這些基團可以帶上________________。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷__________的電極移動。
②鑒定的原理：PCR的產物一般通過_________________________來鑒定，在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的______________等有關；凝膠中的DNA分子通過________，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來。
可解離的基團
正電荷或負電荷
相反
瓊脂糖凝膠電泳
大小和構象
染色
(2)過程。
電泳
凝膠載樣
紫外燈
(3)結果分析與評價。
①成功擴增出DNA片段的判斷依據是__________________________
___________________________。
②進行電泳鑒定的結果應該是________條條帶。如圖所示，該片段大小約為________bp。
可以在波長為300 nm的紫外燈下直接觀察到DNA條帶
一
750
提醒　電泳時，DNA的相對分子質量越大，遷移速率越慢；DNA的相對分子質量越小，遷移速率越快。
能力一　DNA的粗提取與鑒定(考查科學探究)
1.(2023·廣東卷，T11)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的基本過程是裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是(　　)
A.裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質
B.分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等
C.沉淀：可反復多次以提高DNA的純度
D.鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現藍色
裂解的目的是使細胞破裂釋放出DNA等物質，A項正確；DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質等，DNA分離過程中混合物中的多糖、蛋白質等可被去除，B項正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不 同，通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質，可反復多次以提高DNA的純度，C項正確；將DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺試劑，沸水浴五分鐘，待冷卻后，溶液能呈現藍色，D項錯誤。
解析
2.(2024·山東卷，T13)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是(　　)
A.整個提取過程中可以不使用離心機
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中
C.鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發生改變
D.僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾
DNA的提取過程中可以不使用離心機，可將過濾好的研磨液在 4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，直接取上清液放入燒杯中，A項正確，B項錯誤；鑒定過程需要沸水浴加熱，DNA分子在高溫下會解螺旋，雙螺旋結構會發生改變，C項錯誤；加熱是唯一變量，設置一個加二苯胺不加DNA的對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾，D項錯誤。
解析
能力二　DNA片段的擴增及電泳鑒定(考查科學探究)
3.(2023·福建卷，T4)關于“DNA片段的擴增及電泳鑒定”(實驗Ⅰ)和“DNA的粗提取與鑒定”(實驗Ⅱ)的實驗操作，下列相關敘述正確的是(　　)
A.實驗Ⅰ中，PCR實驗所需的移液器、槍頭、蒸餾水等必須進行高壓滅菌處理
B.實驗Ⅰ中，將擴增得到的PCR產物進行凝膠電泳，加樣前應先接通電源
C.實驗Ⅱ中，取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積冷酒精后析出粗提取的DNA
D.實驗Ⅱ中，將白色絲狀物直接加入二苯胺試劑中并進行沸水浴，用于鑒定DNA
為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理，但移液器不需要，A項錯誤；在將擴增得到的PCR產物進行凝膠電泳時，應先加樣，然后接通電源，B項錯誤；由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，因此取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積冷酒精后，析出的白色絲狀物即粗提取的DNA，C項正確；鑒定DNA 時，需要把白色絲狀物溶解在2 mol·L-1的NaCl溶液中，再加入二苯胺試劑進行沸水浴，D項錯誤。
解析
4.(2023·浙江6月選考，T19)某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。
下列敘述正確的是(　　)
A.Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因表達
B.翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C.2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子
D.若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區分雜合子和純合子
由題圖甲可知，Gata3基因與GFP基因共用一個啟動子，且由題干可知兩基因能正常表達出相關蛋白質，A項錯誤；由于啟動子在左側，基因在右側，轉錄基因時，先轉錄Gata3基因，再轉錄GFP基因，且翻譯的方向是沿mRNA的5'→3'，因此翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B項正確；由題圖乙可知，大片段包含GFP基因編碼區片段，小片段不包含GFP基因編碼區片段，
解析
則2號小鼠是Gata3-GFP基因純合子，4號小鼠是野生型，C項錯 誤；若用引物1和引物3進行PCR，雜合子和Gata3-GFP基因純合子均能擴增出條帶，僅有Gata3基因時無法擴增出條帶，不利于區分雜合子和純合子，D項錯誤。
解析
微真題/重體悟
第二部分
1.(2024·湖南卷，T5)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發現DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是(　　)
A.限制酶失活，更換新的限制酶
B.酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等
C.質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質粒DNA
D.酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，A項正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，此時應有部分DNA被酶切，B項錯誤；質粒DNA突變導致限制酶識別位點缺 失，會造成限制酶無法進行切割，因此應更換為正常質粒DNA，C項正確；質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D項正確。
解析
2.(2024·江西卷，T12)γ-氨基丁酸在醫藥等領域有重要的應用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產菌株E.coliA，構建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是(　　)
A.圖中表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB
B.E.coliB發酵生產γ-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能
C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒
分析題圖可知，可以從釀酒酵母S中篩選、分離出目的基因 gadB，A項正確；由題意知，L-谷氨酸鈉是生產γ-氨基丁酸的底 物，不能用來供能，B項錯誤；將目的基因(gadB)導入菌株E.coliA構建高效生產γ-氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸，C項錯誤；選擇限制酶時需考慮多種條件，如確保目的基因不被限制酶破壞、切割位點應精準位于啟動子和
解析
終止子之間、避免對啟動子和終止子造成任何損害等，同時在設計特異性引物時，還需要在其5'端設計限制酶酶切位點，以便構建重組質粒，根據題干提供的信息，無法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ，D項錯誤。
解析
3.(2024·山東卷，T5)制備熒光標記的DNA探針時，需要模板、引 物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標記的dATP)的反應管①~④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續堿基對的雙鏈DNA區。能得到帶有熒光標記的DNA探針的反應管有(　　)
A.①② B.②③ C.①④ D.③④
反應管 加入的單鏈DNA
① 5'—G C C G A T C T T T A T A—3'
3'—G A C C G G C T A G A A A—5'
② 5'—A G A G C C A A T T G G C—3'
③ 5'—A T T T C C C G A T C C G—3'
3'—A G G G C T A G G C A T A—5'
④ 5'—T T C A C T G G C C A G T—3'
反應管②和④雖然只有一種單鏈，但是單鏈含回文序列，可以同種單鏈之間發生互補，四個反應管中單鏈DNA互補配對情況如圖所示：
由圖分析可知，D項正確。
解析
4.(2024·貴州卷，T21)研究者用以蔗糖為唯一碳源的液體培養基，培養真菌A的野生型(含NV基因)、突變體(NV基因突變)和轉基因菌株 (轉入NV基因)，檢測三種菌株NV酶的生成與培養液中的葡萄糖含 量，結果如表所示(表中“+”表示有，“-”表示無)。
檢測用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培養液中)
野生型 + + +
野生型 - - -
突變體 + - -
轉基因菌株 + + +
回答下列問題：
(1)據表可推測________誘導了NV基因表達。NV酶的作用是________
________________。檢測NV酶活性時，需測定的指標是__________
__________________________________________________(答出1點即可)。
蔗糖
催化蔗
糖轉化成葡萄糖
單位時間單位體積的培養液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的減少量)
(2)表中突變體由T-DNA隨機插入野生型菌株基因組DNA篩選獲得。從野生型與突變體中分別提取基因組DNA作為模板，用與________ (填“T-DNA”或“NV基因”)配對的引物進行PCR擴增。若突變體擴增片段長度________(填“>”“=”或“<”)野生型擴增片段長度，則表明突變體構建成功，從基因序列分析其原因是_________________________
_________________________________________________________________________________________________。
NV基因
>
與野生型相比，突變體是由T-DNA插入NV基因中，使NV基因發生了堿基對的增添而引起的，因此突變體相應基因的序列更長
(3)為進一步驗證NV基因的功能，表中的轉基因菌株是將NV基因導入________細胞獲得的。在構建NV基因表達載體時，需要添加新的標記基因，原因是_____________________________________________
____________________________________。
突變體
突變體的T-DNA上會存在相應的標記基因，干擾NV基因表達載體導入成功與否的檢測
(1)據題表中野生型菌株的兩組結果對比分析可知，如果培養液中添加了蔗糖，NV基因就會表達形成NV酶，否則沒有NV酶的形 成，由此推測蔗糖誘導了NV基因表達。分析題表可知，當蔗糖和NV酶同時存在時，培養液中就會出現葡萄糖，由此說明NV酶的作用是催化蔗糖轉化成葡萄糖。酶的活性可以用單位時間單位體積反應物的減少量或生成物的增加量表示，因此NV酶的活性可以用單位時間單位體積的培養液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的減少 量)表示。(2)根據題意，突變體是由T-DNA隨機插入野生型菌株，
解析
使NV基因發生了突變產生的，說明T-DNA插入了NV基因中，使NV基因發生了堿基對的增添，即突變體中NV基因突變后的序列比野生型的NV基因序列更長，所以用與NV基因配對的引物進行擴增，擴增的結果是突變體擴增片段的長度更長。(3)為了進一步驗證NV基因的功能，在突變體(NV基因突變)細胞中，轉入NV基因，以便將轉基因植株與突變體(NV基因突變)的結果進行對比。由于突變體的T-DNA上會存在原有的標記基因，干擾NV基因表達載體導入成功與否的檢測，因此在構建NV基因表達載體時，需要添加新的標記基因。
解析
5.(2024·廣東卷，T21)駒形桿菌可合成細菌纖維素(BC)并將其分泌到胞外組裝成膜。作為一種性能優異的生物材料，BC膜應用廣泛。研究者設計了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表達載體，將其轉入駒形桿菌后構建出一株能合成BC膜并可實現光控染色的工程菌株，為新型紡織原料的綠色制造及印染工藝升級提供了新思路(圖1)。
回答下列問題：
(1)研究者優化了培養基的____________(答出兩點)等營養條件，并控制環境條件，大規模培養工程菌株后可在氣液界面處獲得BC菌膜(菌體和BC膜的復合物)。
碳源、氮源
(2)研究者利用T7噬菌體來源的RNA聚合酶(T7RNAP)及藍光光敏蛋白標簽，構建了一種可被藍光調控的基因表達載體(光控原理見圖2，載體的部分結構見圖3)。構建載體時，選用了通用型啟動子PBAD(被工程菌RNA聚合酶識別)和特異型啟動子PT7(僅被T7RNAP識別)。為實現藍光控制染色，啟動子①②及③依次為________________，理由是_________________________________________________________
_________________________________________________________。
PT7、PBAD、PBAD
基因2、3可正常表達出無活性產物，藍光照射時再激活基因1(或酪氨酸酶基因或目的基因)的表達
(3)光控表達載體攜帶大觀霉素(抗生素)抗性基因。長時間培養時在培養液中加入大觀霉素，其作用為_______________________________
________________________(答出兩點)。
(4)根據預設的圖案用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時 間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色，其原因是_____________________________________________
_________________________________________________________________________________________。
選擇含有重組質粒的駒形桿菌，殺死其他雜菌避免污染
藍光照射誘導nMag和pMag結合，激活T7RNAP，從而與特異型啟動子PT7結合，酪氨酸酶基因表達合成酪氨酸酶，酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素
(5)有企業希望生產其他顏色圖案的BC膜。按照上述菌株的構建模式提出一個簡單思路：_________________________________________
_____________________。
將酪氨酸酶基因換成合成其他色素酶的基因，催化產生不同的色素
(1)培養基的營養物質包括水、無機鹽、碳源、氮源等，研究者培養工程菌，需要優化培養基的碳源、氮源等營養條件，并控制環境條件。(2)依據題圖2及題干信息可知，為實現藍光控制染色，應該先合成無活性的T7RNAP，故基因2、3的上游應連接通用型啟動子。在藍光誘導下合成酪氨酸酶，酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素，實現藍光控制染色。此過程中酪氨酸酶需要特異性合 成，因此基因1上游應連接僅被T7RNAP識別的PT7啟動子。(3)將
解析
攜帶大觀霉素抗性基因的光控表達載體導入駒形桿菌，會獲得未成功導入的菌株和成功導入的工程菌株，長時間培養時也可能感染其他雜菌，在培養液中加入大觀霉素(抗生素)可以篩選出工程菌株，同時也能抑制其他雜菌的生長，提高工程菌的生產效率。(4)詳見答案。(5)為獲得不同顏色圖案的BC膜，可以利用題述光控基因表達載體，將酪氨酸酶基因換成控制合成其他色素酶的基因，催化產生不同的色素。
解析課時微練(四十二)　基因工程的基本工具和基本操作程序
　
一、選擇題:本題共12小題,在每小題給出的四個選項中,只有一項是符合題目要求的
1.(2025·廣州模擬)下列有關基因工程中載體的說法,正確的是(　　)
A.在進行基因工程操作中,被用作載體的質粒都是天然質粒
B.所有的質粒都可以作為基因工程中的載體
C.質粒是一種獨立于細菌染色體外的鏈狀DNA分子
D.作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因
2.(2025·南通統考)如圖所示三個DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制酶的識別序列與切割位點。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A.三種限制酶切割產生的末端的長度大小相同
B.這三種限制酶切割后形成的都是黏性末端
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此連接
D.圖中的DNA片段被EcoRⅠ切割后,會增加兩個游離的磷酸基團
3.(2023·湖北卷,T4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒,構建基因表達載體(重組質粒),并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(　　)
A.若用HindⅢ酶切,目的基因轉錄的產物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四環素)培養基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否
D.若用SphⅠ酶切,攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養基中能形成菌落
4.蛛絲蛋白是一種特殊的纖維蛋白,有著超強的抗張強度,被稱為“生物鋼”。某科研小組欲利用轉基因大腸桿菌生產蛛絲蛋白。如圖為蛛絲蛋白基因對應的DNA片段結構示意圖,其中1~4表示PCR過程中DNA上引物可能結合的位置。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A.若從該DNA片段中直接獲取蛛絲蛋白基因,限制酶會破壞4個磷酸二酯鍵
B.若用PCR技術獲取目的基因,則圖中的1、4分別是2種引物結合的位置
C.在PCR反應緩沖液中加入Mg2+的作用是激活耐高溫的DNA聚合酶
D.受體細胞一般需先用Ca2+處理,更利于實現轉化
5.(2025·重慶調研)葉綠體遺傳轉化體系是近年發展起來的一種新的植物生物反應器。研究人員以HIV病毒包膜蛋白上的V3環和C4結構域序列的基因作為目的基因,與葉綠體特異性啟動子、終止子等序列整合后,構建成基因表達載體,轉入葉綠體成功表達出C4V3抗原。下列說法不正確的是(　　)
A.植物生物反應器主要依賴基因工程和細胞工程等現代生物學技術
B.構建葉綠體遺傳轉化體系需要的工具酶有限制酶、DNA聚合酶
C.按上述方式構建的基因表達載體使得目的基因只能在葉綠體中表達
D.C4V3抗原表達成功與否,可以用凝膠電泳法進行分子水平的檢測
6.研究人員發現高強度光照下,番茄會通過NPQ(一種光保護機制)散失過多熱能,避免高強度光照造成損傷。為研究V基因對NPQ的作用機制,科研人員利用病毒誘導基因沉默技術(VIGS技術)特異性地使V基因沉默,發現高強度光照下番茄葉片的損傷明顯增強。技術原理如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A.本實驗中的目的基因應選用V基因,該基因可通過PCR技術獲得
B.該過程中目的基因整合到特殊農桿菌的T DNA上
C.該過程中VIGS技術通過降解V基因的mRNA進而抑制V基因的表達
D.V基因的表達可能促進了NPQ機制的活化
7.(2025·湖北模擬)瘧疾是一種嚴重危害人類健康的紅細胞寄生蟲病,可用氯喹治療。瘧原蟲pfcrt基因編碼的蛋白,在第76位發生了賴氨酸到蘇氨酸的改變,從而獲得了對氯喹的抗性。現有6份血樣,處理后進行PCR擴增pfcrt基因。產物用限制酶ApoⅠ消化,酶解產物的電泳結果如圖所示。1~6號血樣中,來自氯喹抗性患者的是(　　)
[注]　泳道號對應血樣號。
A.1號和6號_______B.2號和4號
C.3號和5號_______D.1號、2號、4號和6號
8.(2025·湖北模擬)研究人員利用農桿菌介導法和花粉管通道法培育出轉抗寒基因PgLCBF1的月季石榴,主要過程示意圖如圖。下列說法正確的是(　　)
A.用限制酶XbaⅠ分別切割質粒和抗寒基因產生平末端,便于目的基因插入到質粒
B.過程②篩選時,使用的液體培養基需加入新霉素、碳源、氮源和水等物質
C.實驗中過程③主要目的是使轉基因大腸桿菌快速增殖,獲得更多的重組質粒
D.花粉管通道轉化法不需要經過植物組織培養,并且獲得的種子一定為轉基因種子
9.(2025·淮安質檢)限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶,下列說法正確的是(　　)
A.DNA連接酶能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵
B.限制酶只能切割雙鏈DNA片段,不能切割煙草花葉病毒的核酸
C.只有用相同限制酶處理含目的基因的DNA片段和質粒,才能形成重組質粒
D.限制酶主要從原核生物中分離純化而來,能剪切自身的DNA
10.青蒿素是有效的抗瘧疾藥物,但野生黃花蒿中青蒿素的產量較低。為緩解青蒿素供應不足的狀況,科學家將基因tms和tmr導入黃花蒿的愈傷組織,獲得了黃花蒿的冠癭組織,改造過程用到的部分結構如圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
A.將目的基因導入黃花蒿愈傷組織細胞常用的方法是農桿菌轉化法
B.圖中P位于基因的首端,作用是RNA聚合酶識別和結合的部位,驅動轉錄
C.圖中還缺少的結構是標記基因,標記基因的作用是表達出目的基因產物
D.欲檢測目的基因是否導入冠癭組織細胞的染色體DNA上可采用PCR技術
11.(2024·湖南卷,T15改編)最早的雙脫氧測序法是在PCR反應體系中,分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子鏈延伸時,雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補配對原則,以加入ddATP的體系為例:若配對的為ddATP,延伸終止;若配對的為脫氧腺苷三磷酸(dATP),繼續延伸;PCR產物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及對照個體的一段序列,結果如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A.上述PCR反應體系中需加入兩種引物
B.電泳時產物的片段越小,遷移速率越慢
C.5'—CTACCCGTGAT—3'為對照個體的一段序列
D.患者該段序列中某位點的堿基C突變為G
12.大麗輪枝菌(一種絲狀真菌)是引起棉花黃萎病的主要病原菌。為觀察大麗輪枝菌對棉花根的侵染路徑,研究人員用綠色熒光蛋白基因(sGFP)轉染大麗輪枝菌,培育出表達綠色熒光蛋白的轉基因菌株,主要過程如圖。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A.圖中啟動子能被RNA聚合酶識別并結合,驅動sGFP基因的持續轉錄
B.被相關限制酶處理后,圖中b鏈上黏性末端的堿基序列(5'→3')為AGCT
C.若①是利用PCR擴增出含有限制酶酶切位點的sGFP,則5輪后消耗引物數為32個
D.③過程用含潮霉素的培養基篩選農桿菌,得到多個菌落的質粒DNA中可能不含sGFP
二、非選擇題
13.(2024·黑吉遼卷,T25)將天然Ti質粒改造成含有Vir基因的輔助質粒(輔助T DNA轉移)和不含有Vir基因、含有T DNA的穿梭質粒,共同轉入農桿菌,可提高轉化效率。細菌和棉花對密碼子偏好不同,為提高翻譯效率,增強棉花抗病蟲害能力,進行如下操作。回答下列問題:
[注]　F1~F3,R1~R3表示引物;T DNA LB表示左邊界;T DNA RB表示右邊界;Ori表示復制原點;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)從蘇云金桿菌提取DNA時,需加入蛋白酶,其作用是________________。提取過程中加入體積分數為95%的預冷酒精,其目的是________________________________________________________。
(2)本操作中獲取目的基因的方法是_______和_______。
(3)穿梭質粒中p35s為啟動子,其作用是_____________________________________,驅動目的基因轉錄;插入兩個p35s啟動子,其目的可能是___________________________________。
(4)根據圖中穿梭質粒上的KanR和HygBR兩個標記基因的位置,用______________基因對應的抗生素初步篩選轉化的棉花愈傷組織。
(5)為檢測棉花植株是否導入目的基因,提取棉花植株染色體DNA作模板,進行PCR,應選用的引物是_______和_______。
(6)本研究采用的部分生物技術屬于蛋白質工程,理由是_______(填選項字母)。
A.通過含有雙質粒的農桿菌轉化棉花細胞
B.將蘇云金桿菌Bt基因導入棉花細胞中表達
C.將1~1 362基因序列改變為棉花細胞偏好密碼子的基因序列
D.用1~1 362合成基因序列和1 363~1 848天然基因序列獲得改造的抗蟲蛋白
14.(科學探究)(2025·邯鄲模擬)稻米胚乳直鏈淀粉含量高會導致食用品質差。研究發現,水稻蠟質基因(Wx)編碼直鏈淀粉合成酶。Wx基因模板鏈第226位堿基為G,此時胚乳中直鏈淀粉含量最高(表現為非糯性),記為品種G;若該位點突變成T,胚乳中直鏈淀粉的合成水平會降低(表現為糯性),記為品種T。已知品種G和品種T雜交,后代均表現為非糯性,如圖表示品種G和品種T中Wx基因的部分堿基序列,請回答下列問題:
(1)研究人員以待測水稻葉片總DNA為材料進行PCR擴增,若引物1的核苷酸序列為5'—GCTTCACTTCTCTGCTTGTG—3',則引物2的核苷酸序列為5'—_____________________—3'。
(2)研究人員對PCR擴增產物經AccⅠ酶(已知AccⅠ酶的識別位點為,兩引物之間無另外的AccⅠ酶的識別位點)切割后進行______________可以檢測出該待測水稻屬于哪種品種。若檢測結果只觀察到長度為_______bp的DNA條帶,則表明該水稻為品種T。
(3)將品種T的Wx基因與載體結合構建基因表達載體的過程中用到的工具酶有______________。若利用我國科學家獨創的目的基因導入方法獲得轉基因水稻,此種方法_______(填“需要”或“不需要”)進行植物組織培養,原因是__________________________________。
(4)若利用基因工程改造品種G,獲得胚乳直鏈淀粉含量低的新品種水稻,可以將Wx基因_______(填“正向”或“反向”)接入質粒,導入品種G的受體細胞進而獲得轉基因水稻,從_______水平抑制Wx基因表達。
課時微練(四十二)　基因工程的基本工具和基本操作程序
1.D　解析　在進行基因工程操作中,被用作載體的質粒是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的,A項錯誤;具有一個至多個限制酶切割位點、具有標記基因的質粒才可以作為基因工程中的載體,B項錯誤;質粒是一種獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外的環狀DNA分子,C項錯誤;作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因,D項正確。
2.C　解析　根據題圖并結合三種限制酶的切割位點可知,這三種限制酶切割后形成的都是黏性末端,且長度大小相同,A、B兩項正確;用BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段會形成相同的黏性末端,故BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端能按照堿基互補配對彼此連接,C項錯誤;題圖中的DNA片段被EcoRⅠ切割后,會斷裂兩個磷酸二酯鍵,從而增加兩個游離的磷酸基團,D項正確。
3.D　解析　用HindⅢ酶切后,目的基因可能會出現正向插入和反向插入兩種情況,而轉錄的方向是不變的,故目的基因轉錄的產物可能不同,A項正確;用PvuⅠ酶切后,TetR未被破壞,無論該質粒是否含有目的基因,都能在含Tet的培養基中存活,B項正確;插入目的基因的重組質粒比空質粒大,故重組質粒與空質粒電泳后條帶的位置不同,故可以用電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否,C項正確;用SphⅠ酶切后,插入目的基因的質粒上的TetR被破壞,受體菌不能在含Tet的培養基上存活,D項錯誤。
4.B　解析　若從該DNA片段中直接獲取蛛絲蛋白基因,DNA每條鏈上會破壞2個磷酸二酯鍵,共會破壞4個磷酸二酯鍵,A項正確;由于DNA聚合酶只能從5'→3'延伸子鏈,題圖中的磷酸基團為5'端,羥基為3'端,由引物3'端延伸子鏈,子鏈和模板鏈反向平行,因此根據引物的延伸方向可知題圖中與引物結合的部位是2、3,B項錯誤,在PCR反應緩沖液中加入Mg2+的作用是激活耐高溫的DNA聚合酶,C項正確;受體細胞一般需先用Ca2+處理,使其處于吸收周圍環境DNA分子的狀態,更利于實現轉化,D項正確。
5.B　解析　植物生物反應器首先需要用基因工程技術將目的基因導入植物細胞,其次需要采用植物細胞工程技術將轉基因植物細胞培育成轉基因植株或轉基因植物組織或轉基因植物懸浮細胞,因此涉及基因工程和細胞工程技術,A項正確;構建葉綠體遺傳轉化體系需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶,不需要DNA聚合酶,B項錯誤;據題意可知,該過程構建的基因表達載體中含有葉綠體特異性啟動子,使得目的基因只能在葉綠體中表達,C項正確;凝膠電泳法是一種分離和分析生物分子的技術,主要用于檢測DNA、RNA或蛋白質分子的大小和純度,C4V3抗原表達成功與否,可以用凝膠電泳法進行分子水平的檢測,D項正確。
6.D　解析　分析題意可知,本實驗的目的是研究V基因在高光條件下對NPQ機制的作用,且需要使V基因沉默,故本實驗中目的基因應選用基因V的反義基因,A項錯誤;目的基因與煙草病毒載體形成重組病毒載體,該目的基因沒有整合到特殊農桿菌的T DNA上,B項錯誤;VIGS技術是將反義V基因轉錄的RNA切割形成小分子RNA,小分子RNA與V基因的mRNA結合,抑制了V基因的翻譯過程,C項錯誤;V基因沉默,發現高強度光照下番茄葉片的損傷明顯增強,推測V基因的表達可能促進了NPQ機制的活化,D項正確。
7.B　解析　分析題意,瘧原蟲pfcrt基因編碼的蛋白,在第76位發生了賴氨酸到蘇氨酸的改變,從而獲得了對氯喹的抗性。根據酶切位點可知,在具有氯喹抗性的基因組沒有ApoⅠ酶切位點,而敏感性基因組中具有該酶切位點,因此對6份血樣處理后進行PCR,產物用限制酶ApoⅠ消化,酶解產物的電泳出現兩條帶則為敏感型,只有一條帶的為抗性,所以1~6號血樣中,來自氯喹抗性患者的是2號和4號,B項正確,A、C、D三項錯誤。
8.C　解析　題圖所示限制酶XbaⅠ切點不在識別序列的中心軸線處,故用限制酶XbaⅠ分別切割質粒和抗寒基因產生黏性末端,A項錯誤;題圖所示過程②篩選時出現了菌落,使用的是固體培養基,B項錯誤;題圖所示實驗中過程③需要接種、搖床培養,可判斷該步驟使用液體培養基培養,主要目的是使轉基因大腸桿菌快速增殖,獲得更多的重組質粒,C項正確;花粉管通道轉化法不需要經過植物組織培養,但是此方法并不一定將目的基因導入受體細胞,有失敗的可能,故獲得的種子不一定為轉基因種子,D項錯誤。
9.B　解析　DNA連接酶連接的是兩個DNA片段,A項錯誤;限制酶只能切割DNA分子,煙草花葉病毒的核酸是RNA,不能切割,B項正確;用不同的限制酶處理含目的基因的DNA片段和質粒,也可能形成相同的黏性末端,進而形成重組質粒,C項錯誤;限制酶主要從原核生物中分離純化而來,因為原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾,所以不能剪切自身的DNA,D項錯誤。
10.C　解析　將目的基因導入黃花蒿愈傷組織細胞常用的方法是農桿菌轉化法,A項正確;題圖中P為啟動子,位于基因的首端,作用是RNA聚合酶識別和結合的部位,驅動轉錄,B項正確;題圖中還缺少的結構是標記基因,標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因,從而將含目的基因的細胞篩選出來,C項錯誤;要檢測目的基因是否導入冠癭組織細胞的染色體DNA上,可采用PCR技術,D項正確。
11.C　解析　利用雙脫氧測序法時,PCR反應體系中加入的模板是待測的單鏈DNA,故只需加入一種引物,A項錯誤;電泳時,產物的片段越大,遷移速率越慢,B項錯誤;分析電泳結果,以對照個體的一條鏈為模板復制的子鏈序列為5'—CTACCCGTGAT—3',模板鏈序列為5'—ATCACGGGTAG—3',同理患者的子鏈序列為5'—CTACCTGTGAT—3',模板鏈序列為5'—ATCACAGGTAG—3',對比可知,患者該段序列中某位點的堿基G突變為A,C項正確,D項錯誤。
12.C　解析　啟動子是一段有特殊結構的DNA片段,能被RNA聚合酶識別并結合,驅動基因的持續轉錄,A項正確;需要利用題述兩種限制酶對sGFP片段和質粒進行剪切,題圖中質粒大片段的左端的限制酶是HindⅢ,根據HindⅢ識別的堿基序列可知,題圖中b鏈上黏性末端的堿基序列(5'→3')為AGCT,B項正確;若①是利用PCR擴增出含有限制酶酶切位點的sGFP,則5輪后消耗引物數為25×2-2=62(個),C項錯誤;③過程用含潮霉素的培養基篩選農桿菌,得到多個菌落的質粒DNA中可能不含sGFP,因為導入的原始質粒也可以具有抗性,D項正確。
13.答案　(1)使蛋白質水解　使蛋白質等溶解在酒精中,DNA不溶于酒精而析出　(2)PCR　人工合成　(3)RNA聚合酶識別并結合的部位　使目的基因在植物細胞中高效表達(保證目的基因的高水平表達)　(4)潮霉素B抗性　(5)F3　R2　(6)D
解析　(1)細胞中含有DNA、蛋白質等物質,在提取DNA時,加入蛋白酶可以使蛋白質水解,提高粗提取的DNA的純度。DNA不溶于酒精,但某些蛋白質溶于酒精,利用這一原理,可以初步分離DNA與蛋白質。(2)由題圖可知,從蘇云金桿菌中利用PCR分離和擴增Bt基因,通過酶切獲得1 363~1 848基因序列,通過人工合成的方法合成1~1 362基因序列。(3)啟動子是RNA聚合酶識別并結合的部位,驅動目的基因轉錄。將兩個p35s啟動子串聯于目的基因上游,使其形成雙啟動子,可使目的基因在植物細胞中高效表達。(4)由題圖可知,在重組的穿梭質粒上只有HygBR(潮霉素B抗性基因)位于T DNA上,其可以隨T DNA轉移至棉花愈傷組織,并插入棉花細胞的染色體DNA上,故可以用含有潮霉素B的培養基初步篩選成功轉化的棉花愈傷組織。(5)目的基因由人工合成的1~1 362基因序列和1 363~1 848天然序列拼接而成,擴增目的基因時所選引物需與擴增片段兩端結合,且延伸方向相反,因此選用引物F3和R2。(6)蛋白質工程是通過改造或合成基因,來改造現有蛋白質或制造一種新的蛋白質,由題干可知,將人工合成的1~1 362基因序列連接通過酶切獲得的1 363~1 848天然序列,實現對原有的抗蟲基因的改造,以獲得改造的抗蟲蛋白,屬于蛋白質工程,D項符合題意。
14.答案　(1)ATGATTTAACGAGAGTTGAA
(2)瓊脂糖凝膠電泳　460
(3)限制酶和DNA連接酶(或限制性內切核酸酶和DNA連接酶)　不需要　受體細胞是受精卵,受精卵能直接發育成新個體
(4)反向　翻譯
解析　(1)引物的延伸方向為5'→3',故題圖所給引物1設計區堿基序列所在的DNA鏈為非模板鏈,故引物1的堿基序列與非模板鏈的堿基序列相同;而引物2要以引物2設計區堿基序列所在的DNA鏈為模板,故引物2的堿基序列應與所給序列堿基互補配對,該實驗中需設計的引物2為5'-ATGATTTAACGAGAGTTGAA-3'。(2)常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物。引物1設計區堿基序列為71位到90位,引物2設計區堿基序列為511位到530位,故若酶切產物只能觀察到460 bp的DNA條帶,則表明第226位堿基是T,該位點所在序列不能被正常剪切,該水稻為T品種。(3)構建基因表達載體的過程中用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶。花粉管通道法是我國獨創的一種將目的基因導入受體細胞的方法。其過程是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液,利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道,將外源DNA導入受精卵細胞,并進一步地被整合到受體細胞的基因組中,隨著受精卵的發育而成為帶轉基因的新個體。因此不需要進行植物組織培養。(4)若利用基因工程改造品種G,獲得胚乳直鏈淀粉含量低的新品種水稻,需要破壞Wx基因或者抑制Wx基因表達。將Wx基因“反向”接入質粒,導入品種G的受體細胞,可以從翻譯水平抑制Wx基因表達。(共50張PPT)
基因工程的基本工具和基本操作程序
課時微練(四十二)
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一、選擇題：本題共12小題，在每小題給出的四個選項中，只有一項是符合題目要求的
1.(2025·廣州模擬)下列有關基因工程中載體的說法，正確的是
( )
A.在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒都是天然質粒
B.所有的質粒都可以作為基因工程中的載體
C.質粒是一種獨立于細菌染色體外的鏈狀DNA分子
D.作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因
在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的，A項錯誤；具有一個至多個限制酶切割位點、具有標記基因的質粒才可以作為基因工程中的載體，B項錯誤；質粒是一種獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外的環狀DNA分子，C項錯誤；作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因，D項正確。
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2.(2025·南通統考)如圖所示三個DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制酶的識別序列與切割位點。下列有關敘述錯誤的是( )


A.三種限制酶切割產生的末端的長度大小相同
B.這三種限制酶切割后形成的都是黏性末端
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此連接
D.圖中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，會增加兩個游離的磷酸基團
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根據題圖并結合三種限制酶的切割位點可知，這三種限制酶切割后形成的都是黏性末端，且長度大小相同，A、B兩項正確；用BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段會形成相同的黏性末端，故BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端能按照堿基互補配對彼此連
接，C項錯誤；題圖中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，會斷裂兩個磷酸二酯鍵，從而增加兩個游離的磷酸基團，D項正確。
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3.(2023·湖北卷，T4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是( )
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A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否
D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養基中能形成菌落
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用HindⅢ酶切后，目的基因可能會出現正向插入和反向插入兩種情況,而轉錄的方向是不變的，故目的基因轉錄的產物可能不同，A項正確；用PvuⅠ酶切后，TetR未被破壞，無論該質粒是否含有目的基因，都能在含Tet的培養基中存活，B項正確；插入目的基因的重組質粒比空質粒大，故重組質粒與空質粒電泳后條帶的位置不同，故可以用電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否，C項正確；用SphⅠ酶切后，插入目的基因的質粒上的TetR被破壞，受體菌不能在含Tet的培養基上存活，D項錯誤。
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4.蛛絲蛋白是一種特殊的纖維蛋白，有著超強的抗張強度，被稱為
“生物鋼”。某科研小組欲利用轉基因大腸桿菌生產蛛絲蛋白。如圖為蛛絲蛋白基因對應的DNA片段結構示意圖，其中1~4表示PCR過程中DNA上引物可能結合的位置。下列有關敘述錯誤的是( )
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A.若從該DNA片段中直接獲取蛛絲蛋白基因，限制酶會破壞4個磷酸二酯鍵
B.若用PCR技術獲取目的基因，則圖中的1、4分別是2種引物結合的位置
C.在PCR反應緩沖液中加入Mg2+的作用是激活耐高溫的DNA聚合酶
D.受體細胞一般需先用Ca2+處理，更利于實現轉化
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若從該DNA片段中直接獲取蛛絲蛋白基因，DNA每條鏈上會破壞2個磷酸二酯鍵，共會破壞4個磷酸二酯鍵，A項正確；由于DNA聚合酶只能從5'→3'延伸子鏈，題圖中的磷酸基團為5'端，羥基為3'端，由引物3'端延伸子鏈，子鏈和模板鏈反向平行，因此根據引物的延伸方向可知題圖中與引物結合的部位是2、3，B項錯誤,在PCR反應緩沖液中加入Mg2+的作用是激活耐高溫的DNA聚合酶，C項正確；受體細胞一般需先用Ca2+處理，使其處于吸收周圍環境DNA分子的狀態，更利于實現轉化，D項正確。
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5.(2025·重慶調研)葉綠體遺傳轉化體系是近年發展起來的一種新的植物生物反應器。研究人員以HIV病毒包膜蛋白上的V3環和C4結構域序列的基因作為目的基因，與葉綠體特異性啟動子、終止子等序列整合后，構建成基因表達載體，轉入葉綠體成功表達出C4V3抗原。下列說法不正確的是( )
A.植物生物反應器主要依賴基因工程和細胞工程等現代生物學技術
B.構建葉綠體遺傳轉化體系需要的工具酶有限制酶、DNA聚合酶
C.按上述方式構建的基因表達載體使得目的基因只能在葉綠體中表達
D.C4V3抗原表達成功與否，可以用凝膠電泳法進行分子水平的檢測
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植物生物反應器首先需要用基因工程技術將目的基因導入植物細胞，其次需要采用植物細胞工程技術將轉基因植物細胞培育成轉基因植株或轉基因植物組織或轉基因植物懸浮細胞，因此涉及基因工程和細胞工程技術，A項正確；構建葉綠體遺傳轉化體系需要的工具酶有限制酶、DNA連接酶，不需要DNA聚合酶，B項錯誤；據題意可知，該過程構建的基因表達載體中含有葉綠體特異
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性啟動子，使得目的基因只能在葉綠體中表達，C項正確；凝膠電泳法是一種分離和分析生物分子的技術，主要用于檢測DNA、RNA或蛋白質分子的大小和純度，C4V3抗原表達成功與否，可以用凝膠電泳法進行分子水平的檢測，D項正確。
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6.研究人員發現高強度光照下，番茄會通過NPQ(一種光保護機制)散失過多熱能，避免高強度光照造成損傷。為研究V基因對NPQ的作用機制，科研人員利用病毒誘導基因沉默技術(VIGS技術)特異性地使V基因沉默，發現高強度光照下番茄葉片的損傷明顯增強。技術原理如圖所示。下列敘述正確的是( )
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A.本實驗中的目的基因應選用V基因，該基因可通過PCR技術獲得
B.該過程中目的基因整合到特殊農桿菌的T-DNA上
C.該過程中VIGS技術通過降解V基因的mRNA進而抑制V基因的表達
D.V基因的表達可能促進了NPQ機制的活化
分析題意可知，本實驗的目的是研究V基因在高光條件下對NPQ機制的作用，且需要使V基因沉默，故本實驗中目的基因應選用基因
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V的反義基因，A項錯誤；目的基因與煙草病毒載體形成重組病毒載體,該目的基因沒有整合到特殊農桿菌的T-DNA上，B項錯誤；VIGS技術是將反義V基因轉錄的RNA切割形成小分子RNA，小分子RNA與V基因的mRNA結合，抑制了V基因的翻譯過程，C項錯誤；V基因沉默，發現高強度光照下番茄葉片的損傷明顯增強，推測V基因的表達可能促進了NPQ機制的活化，D項正確。
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7.(2025·湖北模擬)瘧疾是一種嚴重危害人類健康的紅細胞寄生蟲病,可用氯喹治療。瘧原蟲pfcrt基因編碼的蛋白，在第76位發生了賴氨酸到蘇氨酸的改變，從而獲得了對氯喹的抗性。現有6份血樣，處理后進行PCR擴增pfcrt基因。產物用限制酶ApoⅠ消化，酶解產物的電泳結果如圖所示。1~6號血樣中，來自氯喹抗性患者的是( )
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[注]　泳道號對應血樣號。
A.1號和6號　　　 B.2號和4號
C.3號和5號　　　 D.1號、2號、4號和6號
分析題意，瘧原蟲pfcrt基因編碼的蛋白，在第76位發生了賴氨酸到蘇氨酸的改變,從而獲得了對氯喹的抗性。根據酶切位點可知，在具有氯喹抗性的基因組沒有ApoⅠ酶切位點，而敏感性基因組中具有該酶切位點，因此對6份血樣處理后進行PCR，產物用限制酶ApoⅠ消化，酶解產物的電泳出現兩條帶則為敏感型，只有一條帶的為抗性，所以1~6號血樣中，來自氯喹抗性患者的是2號和4號，B項正確，A、C、D三項錯誤。
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8.(2025·湖北模擬)研究人員利用農桿菌介導法和花粉管通道法培育出轉抗寒基因PgLCBF1的月季石榴，主要過程示意圖如圖。下列說法正確的是( )
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A.用限制酶XbaⅠ分別切割質粒和抗寒基因產生平末端，便于目的基因插入到質粒
B.過程②篩選時，使用的液體培養基需加入新霉素、碳源、氮源和水等物質
C.實驗中過程③主要目的是使轉基因大腸桿菌快速增殖，獲得更多的重組質粒
D.花粉管通道轉化法不需要經過植物組織培養，并且獲得的種子一定為轉基因種子
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題圖所示限制酶XbaⅠ切點不在識別序列的中心軸線處，故用限制酶XbaⅠ分別切割質粒和抗寒基因產生黏性末端，A項錯誤；題圖所示過程②篩選時出現了菌落,使用的是固體培養基，B項錯誤；題圖所示實驗中過程③需要接種、搖床培養，可判斷該步驟使用液體培養基培養，主要目的是使轉基因大腸桿菌快速增殖，獲得更多的重組質粒，C項正確；花粉管通道轉化法不需要經過植物組織培養，但是此方法并不一定將目的基因導入受體細胞，有失敗的可能，故獲得的種子不一定為轉基因種子，D項錯誤。
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9.(2025·淮安質檢)限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，下列說法正確的是( )
A.DNA連接酶能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵
B.限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸
C.只有用相同限制酶處理含目的基因的DNA片段和質粒，才能形成重組質粒
D.限制酶主要從原核生物中分離純化而來，能剪切自身的DNA
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DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，A項錯誤；限制酶只能切割DNA分子，煙草花葉病毒的核酸是RNA，不能切割，B項正確；用不同的限制酶處理含目的基因的DNA片段和質粒，也可能形成相同的黏性末端，進而形成重組質粒，C項錯誤；限制酶主要從原核生物中分離純化而來，因為原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾，所以不能剪切自身的DNA，D項錯誤。
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10.青蒿素是有效的抗瘧疾藥物，但野生黃花蒿中青蒿素的產量較低。為緩解青蒿素供應不足的狀況，科學家將基因tms和tmr導入黃花蒿的愈傷組織，獲得了黃花蒿的冠癭組織，改造過程用到的部分結構如圖所示。下列敘述錯誤的是( )
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A.將目的基因導入黃花蒿愈傷組織細胞常用的方法是農桿菌轉化法
B.圖中P位于基因的首端，作用是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動轉錄
C.圖中還缺少的結構是標記基因，標記基因的作用是表達出目的基因產物
D.欲檢測目的基因是否導入冠癭組織細胞的染色體DNA上可采用PCR技術
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將目的基因導入黃花蒿愈傷組織細胞常用的方法是農桿菌轉化法，A項正確；題圖中P為啟動子，位于基因的首端，作用是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動轉錄，B項正確；題圖中還缺少的結構是標記基因，標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含目的基因的細胞篩選出來，C項錯誤；要檢測目的基因是否導入冠癭組織細胞的染色體DNA上，可采用PCR技術，D項正確。
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11.(2024·湖南卷，T15改編)最早的雙脫氧測序
法是在PCR反應體系中，分別再加入一種少量
的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP
或ddTTP)，子鏈延伸時，雙脫氧核苷三磷酸也
遵循堿基互補配對原則，以加入ddATP的體系
為例：若配對的為ddATP，延伸終止；若配對
的為脫氧腺苷三磷酸(dATP)，繼續延伸；PCR
產物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及對照個體的一段序列，結果如圖所示。下列敘述正確的是( )
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A.上述PCR反應體系中需加入兩種引物
B.電泳時產物的片段越小，遷移速率越慢
C.5'—CTACCCGTGAT—3'為對照個體的一段序列
D.患者該段序列中某位點的堿基C突變為G
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利用雙脫氧測序法時，PCR反應體系中加入的模板是待測的單鏈DNA，故只需加入一種引物，A項錯誤；電泳時，產物的片段越大，遷移速率越慢，B項錯誤；分析電泳結果，以對照個體的一條鏈為模板復制的子鏈序列為5'—CTACCCGTGAT—3'，模板鏈序列為5'—ATCACGGGTAG—3'，同理患者的子鏈序列為5'—CTACCTGTGAT—3'，模板鏈序列為5'—ATCACAGGTAG—3'，對比可知，患者該段序列中某位點的堿基G突變為A，C項正確，D項錯誤。
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12.大麗輪枝菌(一種絲狀真菌)是引起棉花黃萎病的主要病原菌。為觀察大麗輪枝菌對棉花根的侵染路徑，研究人員用綠色熒光蛋白基因(sGFP)轉染大麗輪枝菌，培育出表達綠色熒光蛋白的轉基因菌株，主要過程如圖。下列相關敘述錯誤的是( )
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A.圖中啟動子能被RNA聚合酶識別并結合，驅動sGFP基因的持續轉錄
B.被相關限制酶處理后，圖中b鏈上黏性末端的堿基序列(5'→3')為AGCT
C.若①是利用PCR擴增出含有限制酶酶切位點的sGFP，則5輪后消耗引物數為32個
D.③過程用含潮霉素的培養基篩選農桿菌，得到多個菌落的質粒DNA中可能不含sGFP
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啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，能被RNA聚合酶識別并結合，驅動基因的持續轉錄，A項正確；需要利用題述兩種限制酶對sGFP片段和質粒進行剪切，題圖中質粒大片段的左端的限制酶是HindⅢ，根據HindⅢ識別的堿基序列可知，題圖中b鏈上黏性末端的堿基序列(5'→3')為AGCT，B項正確；若①是利用PCR擴增出含有限制酶酶切位點的sGFP，則5輪后消耗引物數為25×2-2=62
(個)，C項錯誤；③過程用含潮霉素的培養基篩選農桿菌，得到多個菌落的質粒DNA中可能不含sGFP，因為導入的原始質粒也可以具有抗性，D項正確。
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二、非選擇題
13.(2024·黑吉遼卷，T25)將天然Ti質粒改造成含有Vir基因的輔助質粒(輔助T-DNA轉移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭質粒，共同轉入農桿菌，可提高轉化效率。細菌和棉花對密碼子偏好不同，為提高翻譯效率，增強棉花抗病蟲害能力，進行如下操作。回答下列問題:
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[注]　F1~F3，R1~R3表示引物；T-DNA-LB表示左邊界;
T-DNA-RB表示右邊界；Ori表示復制原點；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)從蘇云金桿菌提取DNA時，需加入蛋白酶，其作用是_________________。提取過程中加入體積分數為95%的預冷酒精，其目的是_______________________________________________。
(2)本操作中獲取目的基因的方法是_________和_____________。
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使蛋白質水解
使蛋白質等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出
PCR
人工合成
(3)穿梭質粒中p35s為啟動子，其作用是_________________________
_______，驅動目的基因轉錄；插入兩個p35s啟動子，其目的可能是_________________________________________________________。
(4)根據圖中穿梭質粒上的KanR和HygBR兩個標記基因的位置，用_____________基因對應的抗生素初步篩選轉化的棉花愈傷組織。
(5)為檢測棉花植株是否導入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進行PCR，應選用的引物是_______和_______。
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RNA聚合酶識別并結合的部位
使目的基因在植物細胞中高效表達(保證目的基因的高水平表達)
潮霉素B抗性
F3
R2
(6)本研究采用的部分生物技術屬于蛋白質工程，理由是______(填選項字母)。
A.通過含有雙質粒的農桿菌轉化棉花細胞
B.將蘇云金桿菌Bt基因導入棉花細胞中表達
C.將1~1 362基因序列改變為棉花細胞偏好密碼子的基因序列
D.用1~1 362合成基因序列和1 363~1 848天然基因序列獲得改造的抗蟲蛋白
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D
(1)細胞中含有DNA、蛋白質等物質，在提取DNA時，加入蛋白酶可以使蛋白質水解，提高粗提取的DNA的純度。DNA不溶于酒精,但某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質。(2)由題圖可知，從蘇云金桿菌中利用PCR分離和擴增Bt基因，通過酶切獲得1 363~1 848基因序列，通過人工合成的方法合成1~1 362基因序列。(3)啟動子是RNA聚合酶識別并結合的部位，驅動目的基因轉錄。將兩個p35s啟動子串聯于目的基因上游，使
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其形成雙啟動子，可使目的基因在植物細胞中高效表達。(4)由題圖可知，在重組的穿梭質粒上只有HygBR(潮霉素B抗性基因)位于T-DNA上，其可以隨T-DNA轉移至棉花愈傷組織，并插入棉花細胞的染色體DNA上，故可以用含有潮霉素B的培養基初步篩選成功轉化的棉花愈傷組織。(5)目的基因由人工合成的1~1 362基因序列和1 363~1 848天然序列拼接而成，擴增目的基因時所選引物需與擴增片段兩端結合，且延伸方向相反，因此選用引物F3和R2。
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(6)蛋白質工程是通過改造或合成基因，來改造現有蛋白質或制造一種新的蛋白質，由題干可知，將人工合成的1~1 362基因序列連接通過酶切獲得的1 363~1 848天然序列，實現對原有的抗蟲基因的改造，以獲得改造的抗蟲蛋白，屬于蛋白質工程，D項符合題意。
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14.(科學探究)(2025·邯鄲模擬)稻米胚乳直鏈淀粉含量高會導致食用品質差。研究發現，水稻蠟質基因(Wx)編碼直鏈淀粉合成酶。Wx基因模板鏈第226位堿基為G，此時胚乳中直鏈淀粉含量最高(表現為非糯性)，記為品種G；若該位點突變成T，胚乳中直鏈淀粉的合成水平會降低(表現為糯性)，記為品種T。已知品種G和品種T雜交，后代均表現為非糯性，如圖表示品種G和品種T中Wx基因的部分堿基序列，請回答下列問題:
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(1)研究人員以待測水稻葉片總DNA為材料進行PCR擴增，若引物1的核苷酸序列為5'—GCTTCACTTCTCTGCTTGTG—3'，則引物2的核苷酸序列為5'—________________________________—3'。
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ATGATTTAACGAGAGTTGAA
(2)研究人員對PCR擴增產物經AccⅠ酶(已知AccⅠ酶的識別位點為
，兩引物之間無另外的AccⅠ酶的識別位點)切割后進行__________________可以檢測出該待測水稻屬于哪種品種。若檢測結果只觀察到長度為_______bp的DNA條帶，則表明該水稻為品種T。
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瓊脂糖凝膠電泳
460
(3)將品種T的Wx基因與載體結合構建基因表達載體的過程中用到的工具酶有_________________________________________________。若利用我國科學家獨創的目的基因導入方法獲得轉基因水稻，此種方法___________(填“需要”或“不需要”)進行植物組織培養，原因是_____________________________________________。
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限制酶和DNA連接酶(或限制性內切核酸酶和DNA連接酶)
不需要
受體細胞是受精卵，受精卵能直接發育成新個體
(4)若利用基因工程改造品種G，獲得胚乳直鏈淀粉含量低的新品種水稻，可以將Wx基因_________(填“正向”或“反向”)接入質粒，導入品種G的受體細胞進而獲得轉基因水稻，從________水平抑制Wx基因表達。
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反向
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(1)引物的延伸方向為5'→3'，故題圖所給引物1設計區堿基序列所在的DNA鏈為非模板鏈，故引物1的堿基序列與非模板鏈的堿基序列相同；而引物2要以引物2設計區堿基序列所在的DNA鏈為模板，故引物2的堿基序列應與所給序列堿基互補配對，該實驗中需設計的引物2為5'-ATGATTTAACGAGAGTTGAA-3'。(2)常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物。引物1設計區堿基序列為71位到90位，引物2設計區堿基序列為511位到530位，故若酶切產物只能
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觀察到460 bp的DNA條帶，則表明第226位堿基是T，該位點所在序列不能被正常剪切，該水稻為T品種。(3)構建基因表達載體的過程中用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶。花粉管通道法是我國獨創的一種將目的基因導入受體細胞的方法。其過程是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發育而成為帶轉
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基因的新個體。因此不需要進行植物組織培養。(4)若利用基因工程改造品種G，獲得胚乳直鏈淀粉含量低的新品種水稻，需要破壞Wx基因或者抑制Wx基因表達。將Wx基因“反向”接入質粒，導入品種G的受體細胞，可以從翻譯水平抑制Wx基因表達。
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