資源簡介

(共27張PPT)
第三章
基因工程
第2節
基因工程的基本操作程序
學生實踐展示
從實踐中學
從實踐中學
1997年，我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節支社會經濟效益450億元。
你知道轉基因抗蟲棉的機制是什么嗎？培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？
從社會中來
▲ 普通棉桃（左）和轉基因抗蟲棉桃（右）
抗蟲機制：
轉基因抗蟲棉的抗蟲機制及培育過程
Bt 抗蟲蛋白賦予棉花抗蟲能力
蘇云金桿菌
Bt 抗蟲蛋白
破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲
培育過程：
蘇云金桿菌
Bt 抗蟲蛋白基因
提取
與載體拼接
導入
棉花細胞
抗蟲棉
表達
Bt基因的篩選與獲取
Bt基因表達載體的構建
將Bt基因導入受體細胞
Bt基因的檢測與鑒定
第一步：Bt基因的篩選與獲取
Bt 抗蟲蛋白基因（Bt基因）
1. 目的基因：
是編碼Bt抗蟲蛋白質的基因
也可以是具有調控Bt基因的因子
第一步：Bt基因的篩選與獲取
2. 篩選Bt基因：
可以從蘇云金桿菌中篩選Bt基因。
還可以利用序列數據庫（如GenBank）、序列對比工具（如BLAST）等，找到Bt基因。
問題：篩選出來的目的基因如何獲取呢？
第一步：Bt基因的篩選與獲取
3. 獲取Bt基因的方法：
（1）人工合成Bt基因
在明確Bt基因堿基序列的基礎上，利用 DNA 合成儀自動化合成所需的 DNA片段。
▲ DNA 合成儀
注：僅適用于較短的DNA。
將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，結合質粒導入受體菌群體中儲存，這個受體菌群就是該生物的基因文庫。
第一步：Bt基因的篩選與獲取
（2）從基因文庫中獲取
蘇云金桿菌
基因組 DNA
DNA片段
限制酶
酶切
與載體重組
導入
mRNA
逆轉錄
cDNA
與載體重組
導入
基因組
文庫
cDNA
文庫
基因文庫
提取
提取
第一步：Bt基因的篩選與獲取
（3）利用 PCR 特異性地快速擴增Bt基因
① 概念：
PCR是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）的縮寫。它是一項在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。
② 原理：
DNA半保留復制
③ 優點：
可以短時間內大量擴增目的基因
凱利·穆里斯
（1944.12-2019.8.7）
④ 條件：
第一步：Bt基因的篩選與獲取
體內 DNA 復制參與的組分 在 DNA 復制中的作用 PCR 中參與的組分
打開 DNA 雙鏈
提供 DNA 復制的模板
合成子鏈的原料
催化合成 DNA 子鏈
維持 pH 穩定
激活 DNA 聚合酶
使 DNA 聚合酶能夠從引物的3' 端開始連接脫氧核苷酸
解旋酶
DNA 母鏈
4種脫氧核苷酸（實為dNTP）
DNA 聚合酶
緩沖物質
Mg2+
引物（短的單鏈 RNA）
無需解旋酶，用高溫代替
DNA 母鏈
4種脫氧核苷酸（實為dNTP）
耐高溫的 DNA 聚合酶
緩沖液
Mg2+
引物（2種，短的單鏈 DNA）
解旋
RNA引物
岡崎片段
▲ 體內DNA 復制過程（部分）
3'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
第一步：Bt基因的篩選與獲取
相關信息——引物
引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。DNA雙鏈解旋之后DNA聚合酶無法直接聚合游離的脫氧核苷酸，必須由引物提供 3' 端之后才能開始連接脫氧核苷酸。由于DNA雙鏈是反向平行的，所以 PCR 需要 2 種引物。
引物的作用：使DNA聚合酶能從引物的 3' 開始連接脫氧核苷酸，啟動DNA的復制。
注：PCR中的引物為短單鏈 DNA，通常含20~30個核苷酸。
第一步：Bt基因的篩選與獲取
DNA片段
第一步：Bt基因的篩選與獲取
⑤ 過程：
變性
復性
延伸
思考·討論
PCR 擴增的是完整的模板 DNA 分子嗎？
由此可知在擴增目的基因時，引物是根據什么來設計的？
不是
擴增的是兩種引物之間所對應的特定DNA片段；
引物是根據目的基因兩端的（或兩條鏈3'部分）核苷酸序列來設計的。
第一步：Bt基因的篩選與獲取
引物設計要求：
a. 引物自身不能環化（即引物自身內部不能形成局部雙鏈）
b. 兩種引物之間不能互補配對
c. 引物長度不宜過短或過長，防止出現引物與模板的非特異性結合
d. 引物的 GC 含量不宜太高（通常建議在40%-60%之間），且兩種引物之間GC含量（或比例）要相當，以免出現復性溫度不統一
1．某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA的量
B．延長熱變性的時間
C．延長延伸的時間
D．提高復性的溫度
習題鞏固
D
2．為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中（如圖）。為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR擴增時，應選擇的引物組合是（ ）
A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④
習題鞏固
B
獲取了足夠量的 Bt 基因后，能不能直接將它導入受體細胞呢？
不能。游離的 DNA 進入受體細胞，一般會直接被分解，即使可以轉錄翻譯成蛋白質，游離的 DNA 片段也無法隨著細胞分裂而進行復制，導致子代細胞中不再含有目的基因。
第二步：基因表達載體的構建
1. 目的：
讓目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代；
使目的基因能夠在受體細胞中表達和發揮作用。
基因表達載體的構建是基因工程的核心工作。
第二步：基因表達載體的構建
2. 組成：
基因表達載體
標記基因
復制原點
終止子
啟動子
插入目的基因
位于基因的上游；
RNA 聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出 mRNA
DNA 復制的起始位點
人們所需要的基因
位于基因的下游；
終止轉錄
便于重組 DNA 分子的篩選（將含有目的基因的受體細胞篩選出來）
非編
碼區
非編
碼區
原核生物基因
啟動子
終止子
編碼區
非編
碼區
非編
碼區
真核生物基因
啟動子
終止子
編碼區
外顯子
內含子
【拓展延伸】
真、原核生物基因的結構及轉錄和加工過程
轉 錄
前體mRNA
加 工
成熟mRNA
轉 錄
mRNA
注意：啟動子和終止子都是DNA序列，而起始密碼子和終止密碼子則位于mRNA上，分別是翻譯的起點和終點。
【拓展延伸】
啟動子的類型（根據轉錄模式分）
① 組成型啟動子
這類啟動子一般來自管家基因，可連續不斷地啟動基因的表達。
② 組織特異性啟動子
其調控作用使基因往往只在某些特定器官或組織中表達，且表現出發育調節的特性。
③ 誘導型啟動子
當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達。
分析基因表達載體構建的方法
（1）構建基因表達載體時，能否用 Sma Ⅰ 限制酶切割質粒？為什么？
不能；因為 SmaⅠ 切割會破壞質粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是質粒上的標記基因，若被破壞，無法進一步篩選重組 DNA 分子）。
質粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
圖1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
圖2
分析基因表達載體構建的方法
（2）若只用 EcoR Ⅰ 限制酶切質粒和外源 DNA，則構建基因表達載體時會出現哪些結果？
質粒自身環化
正向連接
反向連接
目的基因多拷貝與質粒連接
質粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
圖1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
圖2
分析基因表達載體構建的方法
（3）為避免出現上述情況可以選擇什么限制酶對質粒和外源 DNA 進行切割？
使用 BamHⅠ和 Hind Ⅲ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA。
質粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
圖1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
圖2
優點：①避免質粒自身環化；②有利于載體與目的基因正向連接，避免反向連接。
雙酶切法
分析基因表達載體構建的方法
問題：若目的基因兩端無合適的限制酶切割位點怎么辦？
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
3'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
3'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
3'
引入限制酶識別序列
課堂小結

展開更多......

收起↑