資源簡介

(共102張PPT)
第56講　基因工程的基本操作程序
選擇性必修3　生物技術與工程
第九單元　生物技術與工程
1．闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。　
2．實驗：利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。
一、目的基因的篩選與獲取
1．篩選合適的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變____________或獲得____________等的基因。主要是指__________的基因。
(2)篩選目的基因的方法：從相關的已知__________清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
考點1　基因工程的基本操作程序
受體細胞性狀
預期表達產物
編碼蛋白質
結構和功能
2．利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)原理：DNA半保留復制。
(2)條件
①一定的緩沖液、DNA模板、_______、4種脫氧核苷酸和___________________。
②通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。
2種引物
耐高溫的DNA聚合酶
(3)過程
(4)PCR產物的鑒定：常采用______________來鑒定。
瓊脂糖凝膠電泳
50 ℃
72 ℃
1．(人教版選擇性必修3 P78圖3-5)PCR反應體系中需要同時加入兩種引物的原因是_____________________________________________
___________________________________________________________
__________________________________________________________。
提示：DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈，且DNA兩條單鏈的序列不同，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增
二、基因表達載體的構建——基因工程的核心
1．構建基因表達載體的目的
(1)使目的基因在受體細胞中________，并且可以遺傳給下一代。
(2)使目的基因能夠____和發揮作用。
穩定存在
表達
2．基因表達載體的組成
RNA聚合酶
轉錄
3．基因表達載體的構建過程
三、將目的基因導入受體細胞
花粉管通道
T-DNA
染色
體DNA
顯微注射
受精卵
Ca2+
四、目的基因的檢測與鑒定
染色
體DNA
目的基因
mRNA
抗原—抗體
2．(人教版選擇性必修3 P82正文)轉基因抗蟲棉培育過程中，檢測目的基因是否成功表達的常見方法有____________________、__________________________________。
提示：抗原—抗體雜交　采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲
篩選含有重組質粒的受體細胞的方法
1．用“影印法”篩選含有重組質粒的受體細胞
(1)將混合處理后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含自身環化質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落。
[深化拓展]
(2)再利用無菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。
(3)最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。
2．用“藍白斑”篩選含重組質粒的受體細胞
大腸桿菌產生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色的物質，在經人工插入外源基因后，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切斷，無法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能對無色化合物X-gal進行切割，菌落呈白色，即在篩選平板上含有重組質粒的菌落呈白色。
2．DNA復制的引物使DNA聚合酶能夠從引物的5′端開始連接脫氧核苷酸。 (　　)
提示：DNA復制的引物使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。
3．Ti質粒上的T-DNA可與植物受體細胞的染色體DNA整合在一起。 (　　)
×
√
1．目的基因主要指編碼蛋白質的基因。 (　　)
4．檢測目的基因是否表達可用抗原—抗體雜交技術。 (　　)
√
√
1．設計引物是PCR技術成功的關鍵步驟之一。下圖為某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)，請判斷是否合理并說明理由。
(1)第1組：_________________________________________________
__________________________________________________________。
(2)第2組：___________________________________________________________________________________________________________。
提示：(1)不合理，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發生堿基互補配對而失效　(2)不合理，引物Ⅰ′自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效
2．URA3基因位于酵母菌5號染色體上，編碼的酶參與酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人員利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以獲得尿嘧啶營養缺陷型酵母菌。從獲得的轉基因酵母菌中篩選出了多株尿嘧啶營養缺陷型，現需驗證這些菌株是因URA3基因缺失而導致的。選擇實驗材料寫出實驗設計思路。
實驗材料：轉基因酵母菌、完全培養基、尿嘧啶缺陷型培養基、含URA3基因的重組質粒、不含URA3基因的空質粒。
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：將轉基因酵母菌隨機分為兩組，一組導入含有URA3基因的重組載體，一組導入不含URA3基因的空質粒，再將兩組酵母菌接種到尿嘧啶缺陷型培養基，觀察生長的狀況
考向1　PCR技術及應用
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P78圖3-5)PCR 技術不僅可用于基礎研究，還適用于日常的臨床診斷、法醫學調查和農業生物技術研究。采用PCR方法進行研究，其反應程序如圖所示。下列敘述不正確的是(　　)
A．PCR 反應中的每次循環的變性、復性、延伸過程，都涉及氫鍵的形成或斷裂
B．延伸和后延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸
C．PCR應用于臨床病原菌檢測，所用的引物應該能與病原菌的兩條單鏈DNA特異性結合
D．后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分
√
B　[PCR 反應中的每次循環的變性過程DNA分子雙鏈解螺旋，氫鍵斷裂；復性時，引物與模板鏈通過形成氫鍵相結合；延伸過程中，游離的脫氧核苷酸與模板鏈通過形成氫鍵相結合。每次循環的變性、復性、延伸過程都重復以上過程，因此，都涉及氫鍵的形成或斷裂，A正確。PCR技術合成的是DNA分子，因此，延伸和后延伸過程中需要DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸，不需要ATP(四種dNTP即可以提供能量又可以提供原料)，B錯誤。PCR技術中所使用的引物是根據一段已知的病原菌的基因序列合成的，因此，PCR應用于臨床病原菌檢測，所用的引物能與病原菌的兩條單鏈DNA特異性結合，C正確。后延伸過程是為了讓引物延伸完全并讓單鏈產物完全復性形成雙鏈結構，可使目的基因的擴增更加充分，D正確。]
考向2　基因工程的操作程序
2．(2024·廣東佛山期中)水稻根部一般沒有根瘤菌，在種植時常需要施加氮肥。科學家想利用基因工程技術將相關基因導入水稻細胞中，建立水稻“小型化肥廠”，讓水稻直接固氮，減少使用氮肥的成本以及可能造成的環境污染。下列相關敘述正確的是(　　)
A．用PCR儀擴增固氮基因時設置90 ℃以上變性，72 ℃左右復性，50 ℃左右延伸
B．將固氮基因導入水稻細胞可以用農桿菌轉化法
C．可用PCR技術檢測固氮基因在水稻細胞內是否表達
D．若檢測到固氮基因表達產物，即說明轉基因固氮水稻培育成功
√
B　[用PCR儀擴增固氮基因時設置90 ℃以上變性，50 ℃左右復性，72 ℃左右延伸，A錯誤；將目的基因導入植物細胞可以用農桿菌轉化法，B正確；檢測固氮基因在水稻細胞內是否表達應用抗原—抗體雜交的方法，C錯誤；若檢測到固氮基因表達產物不一定能夠固氮，若要檢測轉基因固氮水稻是否培育成功，應將種子種于缺氮的培養液，若無缺乏癥，則可證明轉基因成功，D錯誤。]
3．(2025·云南昆明月考)甘薯是一種重要的糧食作物，對低溫敏感，極不耐霜凍。當溫度低于10 ℃時，甘薯的儲藏性能降低。科研人員欲將黃粉蟲細胞內的抗凍蛋白基因TmAFP導入甘薯細胞中培育抗凍甘薯新品種，主要技術路線如圖1所示，相關限制酶切割位點如圖2所示(箭頭表示切割位點)。
據圖回答問題。
(1)若要利用PCR技術獲取并克隆TmAFP基因，需要設計________種引物，引物的堿基序列不能互補，以免發生____________。PCR反應中________過程所需溫度最低。
(2)圖1中①是指____________________，這一步是培育轉基因抗凍甘薯的核心工作。為了成功得到重組質粒P2，確保TmAFP基因插入載體中的方向正確，最好選用限制酶______________切割質粒P1。
引物自身結合
復性
2
基因表達載體的構建
SmaⅠ、XbaⅠ
(3)采用農桿菌轉化法將TmAFP基因導入甘薯細胞，農桿菌細胞中T- DNA的作用是_________________________________________________________________________________________________________。
(4)圖1中⑤和⑥分別為________________過程，可用_____________技術檢測轉基因甘薯愈傷組織中是否產生抗凍蛋白。
攜帶目的基因進入甘薯細胞，并整合到甘薯細胞的染色體DNA上
脫分化、再分化
抗原—抗體雜交
[解析]　(1)若要利用PCR技術獲取并克隆TmAFP基因，由于PCR技術需要一對引物來啟動和擴增目的基因，因此需要設計2種引物。引物的堿基序列不能互補，以免在PCR反應過程中引物自身結合，形成“引物二聚體”，從而影響目的基因的擴增。在PCR反應中，①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復性：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈，因此復性過程所需溫度最低。(2) 圖1中①是指將目的基因(TmAFP基因)與運載體(質粒P1)結合，形成重組質粒的過程，是基因表達載體的構建，這一步是培育轉基因抗凍甘薯的核心工作。據圖1可知，為了目的基因能表達出蛋白質，目
的基因應插入啟動子和終止子之間，該位置有三種酶(SmaⅠ、XbaⅠ和HindⅢ)識別序列，據圖2可知，SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割產生平末端，XbaⅠ和Spe Ⅰ產生相同的黏性末端，因此根據目的基因兩端的序列，為了成功得到重組質粒P2，確保TmAFP基因插入載體中的方向正確，最好選用限制酶SmaⅠ、XbaⅠ切割質粒P1。(3)采用農桿菌轉化法將TmAFP基因導入甘薯細胞時，農桿菌細胞中的T-DNA能轉移并整合到甘薯細胞的染色體DNA上。因此，T-DNA的作用是作為運輸目的基因(TmAFP基因)的工具，將其導入甘薯細胞并
整合到其基因組中。(4) 圖1中⑤和⑥分別為脫分化和再分化過程。為了檢測轉基因甘薯愈傷組織中是否產生抗凍蛋白，可以采用抗原—抗體雜交技術，該技術利用抗原與抗體之間的特異性結合原理，可以準確地檢測出目標蛋白(即抗凍蛋白)的存在。
1．PCR原理：利用了_____________原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。
2．電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷____的電極移動，這個過程就是電泳。
3．PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的__________等有關。
考點2　DNA片段的擴增及電泳鑒定
DNA的熱變性
相反
大小和構象
4．實驗步驟
(1)DNA片段的擴增
微量移液器
微量離心管
使反應液集中在管的底部
(2)DNA片段的電泳鑒定
①根據待分離DNA片段的大小，用__________配制瓊脂糖溶液，一般配制質量分數為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在______或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的________混勻。
②將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。
電泳緩沖液
沸水浴
核酸染料
③待凝膠溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝膠放入______內。
④將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠_______為宜。
⑤將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)混合，再用__________將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。
⑥接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5 V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。
⑦取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
電泳槽
1 mm
微量移液器
1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
2．緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
3．在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
4．在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P84－85探究·實踐)關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物的實驗，下列敘述正確的是(　　)
A．瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小
B．凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置
C．在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快
D．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來
√
A　[瓊脂糖凝膠的濃度會影響DNA分子在凝膠中的遷移率和分辨率，瓊脂糖凝膠的濃度通常是根據所需分離的DNA片段大小來選擇的。對于較大的DNA片段，比如基因組DNA或質粒DNA，通常選擇較低濃度的瓊脂糖凝膠，因為它們需要更大的孔徑來有效遷移。而對于較小的DNA片段，比如PCR產物或酶切片段，則需要選擇較高濃度的瓊脂糖凝膠，以提供更好的分辨率和分離效果，A正確。凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示電泳的進度，而不是指示DNA分子的具體位置，B錯誤。在瓊脂糖凝膠電泳中，當電場作用時，DNA片段實際上是向正極遷移的，而不是向負極遷移。同時，DNA片段的遷移速率與其大小成反比，即DNA片段越長，遷移速率越慢，C錯誤。瓊脂糖凝膠中的DNA分子需染色后，才可在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。]
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P84－85探究·實踐)基因工程中PCR擴增產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。下列關于PCR 及電泳鑒定的敘述，錯誤的是(　　)
A．PCR通過調節溫度來控制DNA 雙鏈的解聚及模板與引物的結合
B．DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度有關，與DNA分子的大小和構象無關
C．因 DNA分子在凝膠載樣緩沖液中帶有電荷，可用于電泳
D．采用PCR技術對一個DNA進行擴增，若每個DNA分子的每條鏈都作模板，則第n次循環共需要引物2n個
√
B　[PCR通過調節溫度來控制DNA 雙鏈的解聚及模板與引物的結合，如PCR通過90 ℃以上的高溫解旋，50 ℃左右的溫度下模板與引物結合，A正確；在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關，凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來，B錯誤；DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，C正確；PCR技術大量擴增目的基因時，第n－1次生成2n-1個DNA分子，第n次復制形成2n個DNA，所以需要的引物數目為(2n－2n-1)×2＝2n，D正確。]
體驗真題　感悟高考 · 有章可循
1．(2023·浙江6月卷)某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。
下列敘述正確的是(　　)
A．Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達
B．翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子
D．若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區分雜合子和純合子
√
B　[分析圖甲可知，啟動子在左側，Gata3-GFP基因在右側，啟動子啟動轉錄后，可以使GFP基因轉錄，Gata3基因的啟動子能控制GFP基因的表達，A錯誤；因啟動子在左側，轉錄的方向為從左向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；整合GFP基因后，核酸片段變長，2號個體只有大片段，所以是Gata3-GFP基因純合子，4號個體只有小片段，是野生型，C錯誤；用引物1和引物3進行PCR擴增，不能更好地區分雜合子和純合子，D錯誤。]
2．(2024·全國甲卷)某同學采用基因工程技術在大腸桿菌中表達蛋白E。回答下列問題。
(1)該同學利用PCR擴增目的基因。PCR的每次循環包括變性、復性、延伸3個階段，其中DNA雙鏈打開成為單鏈的階段是________，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學鍵是________。
變性
氫鍵
(2)質粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點，限制酶的切割位點如圖所示。構建重組質粒時，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優點體現在_____________________________________________________________(答出兩點即可)；使用酶c單酶切構建重組質粒時宜選用的連接酶是______________。
避免目的基因和質粒的任意連接、防止目的基因和
質粒的自身環化
T4 DNA連接酶
(3)將重組質粒轉入大腸桿菌前，通常先將受體細胞處理成感受態，感受態細胞的特點是________________________________________________；若要驗證轉化的大腸桿菌中含有重組質粒，簡要的實驗思路和預期結果是___________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生
利用DNA分子雜交技術，將大腸桿菌的基因組DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，表明大腸桿菌中含有重組質粒
理狀態
(4)蛋白E基因中的一段DNA編碼序列(與模板鏈互補)是GGGCCCAAGCTGAGATGA，編碼從GGG開始，部分密碼子見表。若第一個核苷酸G缺失，則突變后相應肽鏈的序列是________________________。
氨基酸 賴氨酸 精氨酸 絲氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 終止
密碼子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
甘氨酸－脯氨酸－絲氨酸
[解析]　(1)PCR的每次循環包括變性、復性、延伸3個階段，其中DNA雙鏈打開成為單鏈的階段是變性，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學鍵是氫鍵。(2)構建重組質粒時，與單一酶酶切相比，采用的雙酶切方法，可以形成不同的黏性末端，雙酶切可以避免目的基因和質粒的反向連接、目的基因和質粒的自身環化。酶c單酶切后形成平末端，T4 DNA連接酶連接平末端效率較高，需用T4 DNA連接酶連接。(3)用Ca2+處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，這種細胞稱為感受態細胞。若要驗證轉化的大腸桿菌中含有重組質粒，可利用DNA分子雜交技術，將大腸桿菌
的基因組DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，表明大腸桿菌中含有重組質粒。(4)蛋白E基因中的一段DNA編碼序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，編碼鏈與模板鏈互補，模板鏈與mRNA互補，因此mRNA上的序列為GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一個核苷酸G缺失，則mRNA上的序列變為GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽鏈序列是甘氨酸－脯氨酸－絲氨酸。
3．(2024·重慶卷)大豆是重要的糧油作物，提高大豆產量是我國農業領域的重要任務。我國研究人員發現，基因S在大豆品種DN(種子較大)中的表達量高于品種TL(種子較小)，然后克隆了該基因(兩品種中基因S序列無差異)及其上游的啟動子序列，并開展相關研究。
(1)基因S啟動子的基本組成單位是__________________________。
(2)通過基因工程方法，將DN克隆的“啟動子D＋基因S”序列導入無基因S的優質大豆品種YZ。根據上圖所示信息(不考慮未標明序列)判斷構建重組表達載體時，為保證目標序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同時選用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是___________________________________________________________________________。
脫氧核糖核苷酸(脫氧核苷酸)
EcoR Ⅰ
酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我環化；不能保證目標片段
與載體定向連接
(3)為驗證“啟動子D＋基因S”是否連接在表達載體上，可用限制酶對重組表達載體酶切后進行電泳。電泳時，對照樣品除指示分子大小的標準參照物外，還應有___________________________________________。經驗證的重組表達載體需轉入農桿菌，檢測轉入是否成功的技術是________。
酶切后的空載體片段，啟動子D＋
PCR
基因S片段
(4)用檢測后的農桿菌轉化品種YZ所得再生植株YZ-1的種子變大。同時將從TL克隆的“啟動子T＋基因S”序列成功導入YZ，所得再生植株YZ-2的種子也變大，但小于YZ-1。綜合分析，大豆品種DN較TL種子大的原因是________________________________________
__________________________________________________________。
品種DN的基因S上游啟動子效應比TL強，使得基因S表達量更高，種子更大
[解析]　(1)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，用于啟動DNA的轉錄，是一段DNA片段，其基本組成單位是四種脫氧核糖核苷酸。(2)根據圖示信息可知，“啟動子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的識別序列，若使用限制酶EcoRⅠ，會使目的基因序列被破壞。根據圖中限制酶的識別序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割產生的黏性末端相同，若用這兩種限制酶切割，形成的DNA片段在構建基因表達載體時，容易出現自我環化，以及無法保證目的基因片段與載體片段單向連接，影響目的基因在受體細胞中的表達。(3)DNA電泳可以分離不同大小的DNA片段，用限制酶對重組表達載體酶切后的產物不僅有“啟動子D＋基因S”片段，還有酶切后的空載體片
段，因此電泳時，對照樣品除指示分子大小的標準參照物外，還應有酶切后的空載體片段和“啟動子D＋基因S”片段。在分子水平上檢測目的基因是否轉入成功，可通過PCR等技術檢測受體細胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否轉錄出mRNA。(4)據題分析可知，再生植株YZ-1導入的目的基因為取自品種DN的“啟動子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2導入的目的基因為取自品種TL的“啟動子T＋基因S”序列，結合題干信息“兩品種中基因S序列無差異”可推測：品種DN的基因S上游的啟動子D的效應強于品種TL的啟動子T，啟動子D使基因S表達量更高，因而種子更大。
1．(2024·廣東茂名高三聯考)用PCR檢測某轉基因植株是否導入目的基因時，電泳鑒定時發現擴增出多條條帶，其原因最可能是(　　)
A．引物長度過短　　　　 B．引物之間發生配對
C．體系中Mg2+濃度過低 D．電泳時凝膠濃度過高
課時數智作業(五十六)　基因工程的基本操作程序
題號
1
3
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2
4
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7
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11
√
A　[引物長度過短可能會導致特異性降低，從而結合到非目的基因的區域進行擴增，出現多條條帶，A正確；如果引物之間發生配對，則引物與模板DNA結合比例降低，從而影響PCR反應的效率，B錯誤；體系中Mg2+濃度過低會影響DNA 聚合酶的活性，可能導致擴增效率降低甚至擴增失敗，C錯誤；電泳時凝膠濃度過高主要影響的是DNA條帶的遷移速度，而不是導致出現多條條帶的原因，D錯誤。]
題號
1
3
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2
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11
2．(2024·廣東梅州診斷)轉化是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。下列有關說法錯誤的是(　　)
A．大腸桿菌轉化實驗中可使用Ca2+處理以提高轉化效率
B．目的基因導入受體細胞前必須構建基因表達載體以便穩定存在
C．將DNA溶液滴加在授粉后的花柱切面上，可以使目的基因進入胚囊
D．農桿菌轉化法中需要進行兩次體外拼接和一次導入
題號
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√
D　[可以用Ca2+處理大腸桿菌細胞，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，有利于重組的基因表達載體導入其中，提高轉化效率，A正確。將目的基因導入受體細胞前必須構建基因表達載體，這是基因工程的核心步驟，B正確。花粉管通道法：可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中，也可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊，C正確。農桿菌轉化法總體上有兩次的拼接過程，發生在Ti質粒與目的基因之間(體外拼接)、攜帶目的基因的T-DNA與植物細胞的染色體DNA之間(體內拼接)；兩次的導入過程即基因表達載體導入農桿菌、農桿菌T-DNA導入植物細胞，D錯誤。]
題號
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3．(2024·廣東揭陽調研)利用PCR 獲得目的基因后，用限制酶EcoRⅠ同時處理目的基因與質粒，拼接后可得到重組基因表達載體，其部分DNA片段如下圖所示。下列有關引物的分析正確的是(　　)
題號
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11
A．通過PCR獲取目的基因時，所選的引物可為引物2和引物3
B．檢測目的基因是否插入質粒且方向是否正確時，應選用引物1 和引物4進行PCR
C．若設計的引物與模板不完全配對，可適當提高 PCR 復性的溫度
D．DNA聚合酶能與引物結合，并從引物的5′端連接脫氧核苷酸
√
題號
1
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A　[引物結合在模板鏈的3′端，通過PCR獲取目的基因時，所選的引物可為引物2和引物3，A正確；引物結合在模板鏈的3′端，檢測目的基因是否插入質粒且方向是否正確時，應選用引物2 和引物4進行PCR，B錯誤；若設計的引物與模板不完全配對，可適當降低 PCR 復性的溫度，以便引物與模板鏈結合，C錯誤；DNA聚合酶能與引物結合，并從引物的3′端連接脫氧核苷酸，D錯誤。]
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4．(2024·江蘇鹽城模擬)PCR引物的3′端有結合模板DNA的關鍵堿基，5′端無嚴格限制，可用于添加限制酶切割位點等序列。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．圖中兩條子鏈合成一定都是從5′端向3′端延伸
B．圖示表示復性階段，該過程的溫度與引物的長短有關
C．用圖示引物擴增5次后，可以產生22個目標產物
D．PCR每次循環都消耗引物和原料，在實驗過程中需要及時補充
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√
D　[耐高溫的DNA聚合酶只能從引物的3′端開始延伸DNA子鏈，所以兩條子鏈合成一定都是從5′端向3′端延伸，A正確；圖示表示復性階段，該過程的溫度與引物的長短、堿基組成等有關，B正確；經過5次循環后會產生25＝32個DNA分子，其中只有2個DNA分子含有最初的模板鏈，另僅含有第一次復制產生的單鏈參與形成的DNA分子有8個，因此經過5次復制產生等長的目的基因片段有32－10＝22個，C正確；PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在實驗過程中不需要補充，D錯誤。]
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5．(2024·河北衡水模擬)翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)是在翻譯水平受到抑制的腫瘤相關蛋白，是一個高度保守且和細胞生長、死亡等功能有關的蛋白。現從果蠅基因組DNA中擴增果蠅dTCTP基因，經限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，插入表達質粒pGEX-4T-2上構建基因表達載體，最終表達有活性的dTCTP融合蛋白。關于該基因表達載體的構建，下列敘述錯誤的是(　　)
A．表達質粒pGEX-4T-2需要用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切
B．dTCTP基因是該項研究中的目的基因
C．除了目的基因和標記基因外，該基因表達載體還必須有啟動子和終止子
D．將dTCTP基因插入表達質粒pGEX-4T-2上時，需要用到DNA聚合酶
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√
D　[dTCTP基因經限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，因此需要相同的限制酶切割載體，產生相同的黏性末端，A正確；由題意可知，從果蠅基因組DNA中擴增果蠅dTCTP基因，最終獲得dTCTP融合蛋白，故dTCTP基因是該項研究中的目的基因，B正確；基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等，C正確；利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體切口處，構建基因表達載體，D錯誤。]
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6．(2024·廣東深圳期末)研究者欲將X基因導入大腸桿菌的質粒中保存。該質粒含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因(表達產物可以分解X-gal產生藍色物質，使菌落呈藍色；否則菌落為白色)，其結構如下圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
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A．電泳時，X基因和重組質粒在瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同
B．導入重組質粒前通常需用適宜濃度的Ca2+溶液處理大腸桿菌
C．應在添加了氨芐青霉素和X-gal的培養基上篩選大腸桿菌
D．成功導入X基因的細菌在含X-gal的培養基上的菌落呈藍色
√
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D　[在瓊脂糖凝膠中的遷移速率最終取決于分子的大小，X基因和重組質粒分子大小不同，所以遷移速率不同，A正確；將重組質粒導入大腸桿菌前，一般先用Ca2+處理大腸桿菌，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，B正確；由于重組質粒上含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)和LacZ基因，所以導入并表達成功后的大腸桿菌會對氨芐青霉素有抗性、菌落中出現特定顏色，所以在添加了氨芐青霉素和X-gal的培養基上篩選大腸桿菌，C正確；導入X基因會使LacZ基因被破壞，使其不能產生正常的表達產物，所以在含X-gal的培養基上的菌落呈白色，D錯誤。]
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7．(2024·廣東佛山階段測試)B基因存在于水稻基因組中，僅在體細胞和精子中正常表達，在卵細胞中不轉錄。為研究B基因表達對卵細胞的影響，設計了如下實驗來獲取能夠在卵細胞中表達B基因的轉基因植株。
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注：啟動子*指可在水稻卵細胞中啟動轉錄的啟動子；Luc基因表達的熒光素酶能催化熒光素產生熒光。
下列關于該實驗的敘述，不正確的是(　　)
A．B基因在水稻卵細胞中不轉錄，可能是B基因的啟動子在卵細胞中無法啟動轉錄
B．可從水稻體細胞和精子中提取RNA合成cDNA來獲得B基因中編碼蛋白的序列
C．在鑒定和篩選轉基因植株時，可以檢測加入熒光素的該植株卵細胞中是否發出熒光
D．過程②在培養基中應加入卡那霉素以檢測T-DNA是否整合到水稻細胞染色體DNA上
√
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D　[啟動子是與RNA聚合酶結合并能啟動mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵細胞中不能轉錄，可能是B基因的啟動子在卵細胞中無法啟動轉錄，A正確；目的基因獲取途徑之一就是從cDNA文庫中獲得，故可從水稻體細胞和精子中提取RNA合成cDNA來獲得B基因中編碼蛋白的序列，B正確；由于基因表達載體上有Luc基因，其表達的熒光素酶能催化熒光素產生熒光，所以在鑒定和篩選轉基因植株時，可以檢測加入熒光素的該植株卵細胞中是否發出熒光，C正確；卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，故不能用卡那霉素檢測T-DNA是否整合到水稻細胞染色體DNA上，應用潮霉素，D錯誤。]
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8．(2024·廣東中山期末)在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因表達載體，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如下圖所示。以下相關敘述錯誤的是(　　)
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A．電泳是帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程。本實驗中，帶電分子會向著電荷相反的電極移動
B．該載體最可能是環狀DNA，兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點
C．限制酶R1和R2的酶切位點最短相距約200 bp，最長相距約600 bp
D．需將擴增得到的PCR 產物與內含指示劑的電泳緩沖液混合后加樣
√
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D　[電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程，由于同性相斥、異性相吸，帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動，A正確；由題可知，當僅用一種限制酶切割載體時，這兩種限制酶切割產生的DNA片段等長，且只有1個DNA片段，當使用兩種限制酶同時切割時，產生兩種長度的DNA片段，故該載體最可能是環狀DNA，兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；由題可知，兩種限制酶同時切割時，產生600 bp和200 bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點最短相距約200 bp，最長相距約600 bp，C正確；將擴增得到的PCR產物與內含指示劑的凝膠載樣緩沖液混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入加樣孔，D錯誤。]
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9．(2024·廣東中山期末)雙向啟動子可同時結合兩個RNA 聚合酶來驅動下游基因的表達；研究人員構建了下圖所示的表達載體，以檢測雙向啟動子作用效果。下列分析錯誤的是(　　)
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A．可用農桿菌轉化法將構建好的表達載體導入植物細胞
B．可通過觀察是否出現熒光和藍色物質確認雙向啟動子的作用
C．在培養基中添加壯觀霉素可篩選出成功導入表達載體的微生物受體細胞
D．為連入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了雙向啟動子及LUC基因的質粒
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√
D　[將基因表達載體導入植物細胞常用的方法是農桿菌轉化法，A正確；雙向啟動子如果正常表達，就會合成熒光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分別產生熒光和生成藍色物質，從而確定雙向啟動子的作用，B正確；如果成功導入含有壯觀霉素抗性基因的基因表達載體，受體細胞就具有抗壯觀霉素的能力，在含有壯觀霉素的培養基上能生存，因此可以篩選出成功導入表達載體的微生物受體細胞，C正確；如果用SphⅠ酶切已整合了雙向啟動子及LUC基因的質粒時就會破壞LUC基因，D錯誤。]
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10．(14分)(2024·吉林、黑龍江適應性測試)植物在高于胞內Na＋濃度的環境下，SOS3和SOS2激活位于細胞膜上的轉運蛋白SOS1，SOS1通過SOS信號通路與細胞質內Na＋結合并將其排出細胞外，維持其正常生命活動。回答下列問題：
(1)植物利用SOS信號通路將Na＋排出細胞外，這種運輸方式的特點是__________________________。
(2)通過基因工程在水稻中過量表達SOS1蛋白，以期增強水稻抗鹽能力。
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需要能量、需要載體蛋白
①為獲得編碼SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻總RNA，通過______________獲得模板DNA，再經PCR獲得SOS1基因片段。
②測序表明，SOS1基因編碼序列含有3 444個核苷酸，其中A＋T含量占53%，模板鏈中C含量為26%，那么SOS1基因雙鏈序列中G＋C的含量為______%。
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逆轉錄
47
③構建表達載體時，在下圖所示載體含有的限制酶識別位點插入SOS1基因。序列分析發現SOS1基因內部有XbaⅠ的識別序列，為使載體中SOS1基因和綠色熒光蛋白基因正確表達，應在SOS1基因兩端分別添加________________兩種限制酶的識別序列，將SOS1基因插入載體前，應選用________________兩種限制酶對載體酶切。
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Spe Ⅰ、EcoR Ⅰ
Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ
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(3)重組質粒轉化水稻后，選取可發綠色熒光的植株，鑒定其抗鹽能力是否增強，采取的操作是__________________________________
___________________________________________________________。
(4)若發現水稻中過量表達SOS1基因并不能明顯提高其抗鹽能力，從信號通路角度分析，可能的原因是__________________________
___________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________。
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將轉基因水稻和普通水稻種植于高于胞內Na＋濃度的環境下，觀察兩種水稻的生長狀況
水稻細胞內SOS3和SOS2的含量并未增加，轉運蛋白SOS1的含量增多，但激活的SOS1數量并未明顯增多，SOS1通過SOS信號通路與細胞質內Na＋結合并轉運的量沒有明顯增加
[解析]　(1)由題干信息“在高于胞內Na＋濃度的環境下，SOS1通過SOS信號通路與細胞質內Na＋結合并將其排出細胞外”可知，植物利用SOS信號通路將Na＋排出細胞外是逆濃度梯度的運輸，因此運輸方式為主動運輸，特點是需要載體蛋白，需要能量。(2)①為獲得編碼SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻總RNA，通過逆轉錄獲得模板DNA，再經PCR獲得SOS1基因片段。②SOS1基因編碼序列中A＋T含量占53%，則G＋C含量為47%。③由圖可知，熒光蛋白基因內部存在SpeⅠ和BamHⅠ兩種限制酶識別序列，因此對載體酶切時不能選擇這兩種酶，并且不能選擇限制酶SmaⅠ，否則會導致
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載體中SOS1基因和綠色熒光蛋白基因不能正確表達，故選擇XbaⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶對載體酶切，由于SOS1基因內部有XbaⅠ的識別序列，故不能選擇限制酶XbaⅠ對目的基因酶切，但需要目的基因有與載體相同的黏性末端，故可在SOS1基因兩端分別添加SpeⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶的識別序列。(3)鑒定水稻抗鹽能力是否增強，采取的操作是將轉基因水稻和普通水稻種植于高于胞內Na＋濃度的環境下，觀察兩種水稻的生長狀況。(4)水稻細胞內SOS3和SOS2的含量并未增加，轉運蛋白SOS1的含量增多，但激活的SOS1數量并未明顯增多，SOS1通過SOS信號通路與細胞質內Na＋結合并轉運的量沒有明顯增加。
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11．(14分)(2024·廣東湛江期末)研究人員將抗鹽基因轉入普通煙草培育出了抗鹽煙草。實驗過程中所用的Ti質粒與含抗鹽基因的DNA上相關限制酶的酶切位點分別如圖1、圖2所示。Ti質粒上的T-DNA能被轉移到被侵染的細胞中并被整合到該細胞的染色體DNA上。
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請根據圖示回答有關問題：
(1)利用PCR技術大量擴增抗鹽基因時，在反應體系中要加入含抗鹽基因的DNA片段、4種脫氧核苷酸、________________________________、引物等物質，以提供DNA復制所需的基本條件；PCR反應依次經過______、復性和延伸三步，并重復循環多次。
(2)在構建基因表達載體時，選用的Ti質粒除了以上結構外，還應有____________(填“復制原點”“起始密碼子”或“終止密碼子”)，切割Ti質粒和含抗鹽基因的DNA最好選用__________________(限制酶的名稱)。
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耐高溫的DNA聚合酶(和緩沖溶液)
變性
復制
BamHⅠ和Sau3AⅠ
原點
(3)利用微生物培養技術篩選獲得含抗鹽基因表達載體的農桿菌：將轉入目的基因的農桿菌接種到含某種抗生素的培養基上進行培養，結果如下圖所示，當同時出現______________________這兩組結果時，可確定農桿菌中已含抗鹽基因表達載體；然后用該農桿菌去侵染植物細胞。
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甲、丁(或抗X、不抗Y)
(4)有人認為利用上述方法進行育種有助于降低X抗生素抗性基因轉移到其他植物的風險，理由是該質粒只有_________(結構)整合到受體細胞的染色體DNA上，_________抗性基因不會轉移整合到受體細胞的染色體DNA上。
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T-DNA
X抗生素
[解析]　(1)PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。利用PCR技術大量擴增抗鹽基因時，在反應體系中要加入目的基因(含抗鹽基因的DNA片段)、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、緩沖液(含Mg2+)、引物等物質，以提供DNA復制所需的基本條件；PCR反應依次經過變性、復性、延伸三步，并重復循環多次。(2)在構建基因表達載體時，選用的Ti質粒除了以上結構外，還應有復制原點，保證其能在受體細胞中進行自我復制。選擇限制酶切割質粒和目的基因時，最好選用兩種不
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同的限制酶進行切割，防止目的基因和載體自身環化或反向連接，且目的基因應插入到啟動子和終止子之間，以保證目的基因能正常的轉錄，根據圖中限制酶分布情況，切割Ti質粒和含抗鹽基因的DNA最好選用限制酶BamHⅠ和Sau3AⅠ。(3)切割Ti質粒和含抗鹽基因的DNA選用BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶，構建好的表達載體中Y抗生素抗性基因被破壞，不能正常表達，但X抗生素抗性基因能正常表達，所以含有目的基因的農桿菌能在含有X抗生素的培養基上生長，不能在含有Y抗生素的培養基上生長，對應圖中甲、
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丁這兩組結果，然后可以用該農桿菌去侵染植物細胞。(4)有人認為利用題述方法進行育種有助于降低X抗生素抗性基因轉移到其他植物的風險，理由是Ti質粒只有T-DNA(可轉移的DNA)轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上，而位于T-DNA之外的X抗生素抗性基因不會轉移整合到受體細胞的染色體DNA上。
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(教師用書獨具)
1．(2024·廣東湛江二模)研究發現，若將第52位的脯氨酸(密碼子為CCA)替換成蘇氨酸(密碼子為ACA)，則可增強抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分堿基序列及可供選擇的引物如圖1所示，箭頭下方的數字代表堿基序號。現利用重疊延伸 PCR 技術對抗菌肽基因進行改造以獲得抑菌性更強的抗菌肽，過程如圖2所示，其中Ⅰ為轉錄模板鏈，引物上的“·”代表突變位點。改造過程中 PCR2所使用的引物組合為(　　)
A．引物1和引物4　　　 B．引物2和引物6
C．引物2和引物4 D．引物3和引物5
√
B　[利用重疊延伸PCR技術對 DNA 分子進行定點突變的過程中，通過 PCR2 獲得產物 CD時所用的引物組合為引物c、d。引物d與轉錄模板鏈的3′端結合，因此引物 d 的序列為5′GTCACGTG，引物 2 符合該序列。現要利用重疊延伸PCR 技術對抗菌肽基因進行改造以獲得抑菌性更強的抗菌肽，則需要將第52位的脯氨酸替換成蘇氨酸。根據兩種氨基酸的密碼子可知，需要將 mRNA上的第 154號堿基由C替換為A，則需要將DNA非轉錄模板鏈上對應部分的堿基由C 替換為A。因此引物c的堿基序列為5′CCTGTTAT，引物6符合該序列。]
2．(2024·廣東梅州二模)光敏色素基因在調節作物生長發育中具有重要作用。為探討玉米中光敏色素基因A(含大約256個堿基對)在棉花種質資源創制中的利用價值，研究人員將A基因轉入到棉花中，對棉花受體細胞進行檢測，并通過電泳技術分析結果。該過程所用質粒與含光敏色素基因的DNA上相關限制酶的酶切位點分別如圖甲、乙所示，電泳檢測結果如圖丙。下列相關敘述正確的是(　　)
A．為構建正確連接的表達載體，應選用BamHⅠ和HindⅢ這兩種限制酶
B．PCR擴增目的基因過程中每次循環都要經歷一次升溫和兩次降溫
C．表達載體導入受體細胞后，可用含四環素的選擇培養基進行初步篩選
D．由圖丙電泳結果可知，1、2、3、4號轉基因棉花均培育成功
√
C　[由圖可知：構建基因表達載體時，應選用BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶，若用BamHⅠ，則目的基會因為產生相同的末端而出現自身環化的現象且會將質粒上的兩個標記基因均破壞掉，A錯誤；PCR反應過程中每次循環都要經歷目的各不相同的兩次升溫(第一次使目的基因變性，第二次使目的基因延伸)和一次降溫(使目的基因復性)，B錯誤；在構建基因表達載體的過程中，卡那霉素抗性基因被破壞，而四環素抗性基因在目的基因表達載體中存在，因此在表達載體導入受體細胞后，可用含四環素的選擇培養基進行初步篩選，C正確；光敏色素基因A含大約256個堿基對，由圖丙電泳結果可知，1、2、3、4號均成功導入光敏色素基因A，但轉基因棉花是否培育成功還需要進行生物個體水平上的鑒定，D錯誤。]
謝 謝 ！第56講　基因工程的基本操作程序
　1．闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。　2．實驗：利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。
考點1　基因工程的基本操作程序
一、目的基因的篩選與獲取
1．篩選合適的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變________________或獲得____________等的基因。主要是指________________的基因。
(2)篩選目的基因的方法：從相關的已知______________清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。
2．利用PCR獲取和擴增目的基因
(1)原理：DNA半保留復制。
(2)條件
①一定的緩沖液、DNA模板、____________、4種脫氧核苷酸和____________________。
②通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。
(3)過程
(4)PCR產物的鑒定：常采用______________來鑒定。
1．(人教版選擇性必修3 P78圖3-5)PCR反應體系中需要同時加入兩種引物的原因是_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
二、基因表達載體的構建——基因工程的核心
1．構建基因表達載體的目的
(1)使目的基因在受體細胞中____________，并且可以遺傳給下一代。
(2)使目的基因能夠__________和發揮作用。
2．基因表達載體的組成
3．基因表達載體的構建過程
三、將目的基因導入受體細胞
四、目的基因的檢測與鑒定
2．(人教版選擇性必修3 P82正文)轉基因抗蟲棉培育過程中，檢測目的基因是否成功表達的常見方法有____________________、___________________________。
[深化拓展]
篩選含有重組質粒的受體細胞的方法
1．用“影印法”篩選含有重組質粒的受體細胞
(1)將混合處理后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含自身環化質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落。
(2)再利用無菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。
(3)最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。
2．用“藍白斑”篩選含重組質粒的受體細胞
大腸桿菌產生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色的物質，在經人工插入外源基因后，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切斷，無法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能對無色化合物X-gal進行切割，菌落呈白色，即在篩選平板上含有重組質粒的菌落呈白色。
1．目的基因主要指編碼蛋白質的基因。 (　　)
2．DNA復制的引物使DNA聚合酶能夠從引物的5′端開始連接脫氧核苷酸。 (　　)
3．Ti質粒上的T-DNA可與植物受體細胞的染色體DNA整合在一起。 (　　)
4．檢測目的基因是否表達可用抗原—抗體雜交技術。 (　　)
1．設計引物是PCR技術成功的關鍵步驟之一。下圖為某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)，請判斷是否合理并說明理由。
(1)第1組：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)第2組：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
2．URA3基因位于酵母菌5號染色體上，編碼的酶參與酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人員利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以獲得尿嘧啶營養缺陷型酵母菌。從獲得的轉基因酵母菌中篩選出了多株尿嘧啶營養缺陷型，現需驗證這些菌株是因URA3基因缺失而導致的。選擇實驗材料寫出實驗設計思路。
實驗材料：轉基因酵母菌、完全培養基、尿嘧啶缺陷型培養基、含URA3基因的重組質粒、不含URA3基因的空質粒。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
PCR技術及應用
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P78圖3-5)PCR 技術不僅可用于基礎研究，還適用于日常的臨床診斷、法醫學調查和農業生物技術研究。采用PCR方法進行研究，其反應程序如圖所示。下列敘述不正確的是(　　)
A．PCR 反應中的每次循環的變性、復性、延伸過程，都涉及氫鍵的形成或斷裂
B．延伸和后延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸
C．PCR應用于臨床病原菌檢測，所用的引物應該能與病原菌的兩條單鏈DNA特異性結合
D．后延伸過程可使目的基因的擴增更加充分
基因工程的操作程序
2．(2024·廣東佛山期中)水稻根部一般沒有根瘤菌，在種植時常需要施加氮肥。科學家想利用基因工程技術將相關基因導入水稻細胞中，建立水稻“小型化肥廠”，讓水稻直接固氮，減少使用氮肥的成本以及可能造成的環境污染。下列相關敘述正確的是(　　)
A．用PCR儀擴增固氮基因時設置90 ℃以上變性，72 ℃左右復性，50 ℃左右延伸
B．將固氮基因導入水稻細胞可以用農桿菌轉化法
C．可用PCR技術檢測固氮基因在水稻細胞內是否表達
D．若檢測到固氮基因表達產物，即說明轉基因固氮水稻培育成功
3．(2025·云南昆明月考)甘薯是一種重要的糧食作物，對低溫敏感，極不耐霜凍。當溫度低于10 ℃時，甘薯的儲藏性能降低。科研人員欲將黃粉蟲細胞內的抗凍蛋白基因TmAFP導入甘薯細胞中培育抗凍甘薯新品種，主要技術路線如圖1所示，相關限制酶切割位點如圖2所示(箭頭表示切割位點)。
據圖回答問題。
(1)若要利用PCR技術獲取并克隆TmAFP基因，需要設計________種引物，引物的堿基序列不能互補，以免發生______________。PCR反應中________過程所需溫度最低。
(2)圖1中①是指____________________，這一步是培育轉基因抗凍甘薯的核心工作。為了成功得到重組質粒P2，確保TmAFP基因插入載體中的方向正確，最好選用限制酶______________切割質粒P1。
(3)采用農桿菌轉化法將TmAFP基因導入甘薯細胞，農桿菌細胞中T-DNA的作用是_________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)圖1中⑤和⑥分別為________________過程，可用______________技術檢測轉基因甘薯愈傷組織中是否產生抗凍蛋白。
考點2　DNA片段的擴增及電泳鑒定
1．PCR原理：利用了________________原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。
2．電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷____________的電極移動，這個過程就是電泳。
3．PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的____________等有關。
4．實驗步驟
(1)DNA片段的擴增
(2)DNA片段的電泳鑒定
①根據待分離DNA片段的大小，用______________配制瓊脂糖溶液，一般配制質量分數為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在____________或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的____________混勻。
②將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。
③待凝膠溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝膠放入____________內。
④將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠____________為宜。
⑤將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)混合，再用____________將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。
⑥接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5 V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。
⑦取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
2．緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20 ℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
3．在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
4．在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P84－85探究·實踐)關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物的實驗，下列敘述正確的是(　　)
A．瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小
B．凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置
C．在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快
D．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P84－85探究·實踐)基因工程中PCR擴增產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。下列關于PCR 及電泳鑒定的敘述，錯誤的是(　　)
A．PCR通過調節溫度來控制DNA 雙鏈的解聚及模板與引物的結合
B．DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度有關，與DNA分子的大小和構象無關
C．因 DNA分子在凝膠載樣緩沖液中帶有電荷，可用于電泳
D．采用PCR技術對一個DNA進行擴增，若每個DNA分子的每條鏈都作模板，則第n次循環共需要引物2n個
1．(2023·浙江6月卷)某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。
下列敘述正確的是(　　)
A．Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達
B．翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子
D．若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區分雜合子和純合子
2．(2024·全國甲卷)某同學采用基因工程技術在大腸桿菌中表達蛋白E。回答下列問題。
(1)該同學利用PCR擴增目的基因。PCR的每次循環包括變性、復性、延伸3個階段，其中DNA雙鏈打開成為單鏈的階段是________，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學鍵是________。
(2)質粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點，限制酶的切割位點如圖所示。構建重組質粒時，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優點體現在________________________________________________________(答出兩點即可)；使用酶c單酶切構建重組質粒時宜選用的連接酶是______________。
(3)將重組質粒轉入大腸桿菌前，通常先將受體細胞處理成感受態，感受態細胞的特點是________________________________________________；若要驗證轉化的大腸桿菌中含有重組質粒，簡要的實驗思路和預期結果是_______________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)蛋白E基因中的一段DNA編碼序列(與模板鏈互補)是GGGCCCAAGCTGAGATGA，編碼從GGG開始，部分密碼子見表。若第一個核苷酸G缺失，則突變后相應肽鏈的序列是________________________。
氨基酸 賴氨酸 精氨酸 絲氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 終止
密碼子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
3．(2024·重慶卷)大豆是重要的糧油作物，提高大豆產量是我國農業領域的重要任務。我國研究人員發現，基因S在大豆品種DN(種子較大)中的表達量高于品種TL(種子較小)，然后克隆了該基因(兩品種中基因S序列無差異)及其上游的啟動子序列，并開展相關研究。
(1)基因S啟動子的基本組成單位是__________________________。
(2)通過基因工程方法，將DN克隆的“啟動子D＋基因S”序列導入無基因S的優質大豆品種YZ。根據上圖所示信息(不考慮未標明序列)判斷構建重組表達載體時，為保證目標序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同時選用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)為驗證“啟動子D＋基因S”是否連接在表達載體上，可用限制酶對重組表達載體酶切后進行電泳。電泳時，對照樣品除指示分子大小的標準參照物外，還應有__________________________________________________________________。
經驗證的重組表達載體需轉入農桿菌，檢測轉入是否成功的技術是________。
(4)用檢測后的農桿菌轉化品種YZ所得再生植株YZ-1的種子變大。同時將從
TL克隆的“啟動子T＋基因S”序列成功導入YZ，所得再生植株YZ-2的種子也變大，但小于YZ-1。綜合分析，大豆品種DN較TL種子大的原因是_______
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[夯實必備知識]自主診斷
考點1
一、1．(1)受體細胞性狀　預期表達產物　編碼蛋白質　(2)結構和功能　2．(2)2種引物　耐高溫的DNA聚合酶　(3)50 ℃　72 ℃　(4)瓊脂糖凝膠電泳
二、1．(1)穩定存在　(2)表達　2．RNA聚合酶　轉錄
三、花粉管通道　T-DNA　染色體DNA　顯微注射　受精卵　Ca2+
四、染色體DNA　目的基因　mRNA　抗原—抗體
[落實實驗基礎]自主診斷
考點2
1．DNA的熱變性　2．相反　3．大小和構象
4．(1)微量移液器　微量離心管　使反應液集中在管的底部　(2)電泳緩沖液　沸水浴　核酸染料　電泳槽　1 mm　微量移液器
第56講　基因工程的基本操作程序
考點1
教材隱性知識
1．提示：DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈，且DNA兩條單鏈的序列不同，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增
2．提示：抗原—抗體雜交　采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲
澄清概念
1．√
2．×提示：DNA復制的引物使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。
3．√　4．√
達成學科素養
1．提示：(1)不合理，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發生堿基互補配對而失效　(2)不合理，引物Ⅰ′自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效
2．提示：將轉基因酵母菌隨機分為兩組，一組導入含有URA3基因的重組載體，一組導入不含URA3基因的空質粒，再將兩組酵母菌接種到尿嘧啶缺陷型培養基，觀察生長的狀況
評價遷移應用
1．B　[PCR 反應中的每次循環的變性過程DNA分子雙鏈解螺旋，氫鍵斷裂；復性時，引物與模板鏈通過形成氫鍵相結合；延伸過程中，游離的脫氧核苷酸與模板鏈通過形成氫鍵相結合。每次循環的變性、復性、延伸過程都重復以上過程，因此，都涉及氫鍵的形成或斷裂，A正確。PCR技術合成的是DNA分子，因此，延伸和后延伸過程中需要DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸，不需要ATP(四種dNTP即可以提供能量又可以提供原料)，B錯誤。PCR技術中所使用的引物是根據一段已知的病原菌的基因序列合成的，因此，PCR應用于臨床病原菌檢測，所用的引物能與病原菌的兩條單鏈DNA特異性結合，C正確。后延伸過程是為了讓引物延伸完全并讓單鏈產物完全復性形成雙鏈結構，可使目的基因的擴增更加充分，D正確。]
2．B　[用PCR儀擴增固氮基因時設置90 ℃以上變性，50 ℃左右復性，72 ℃左右延伸，A錯誤；將目的基因導入植物細胞可以用農桿菌轉化法，B正確；檢測固氮基因在水稻細胞內是否表達應用抗原—抗體雜交的方法，C錯誤；若檢測到固氮基因表達產物不一定能夠固氮，若要檢測轉基因固氮水稻是否培育成功，應將種子種于缺氮的培養液，若無缺乏癥，則可證明轉基因成功，D錯誤。]
3．(1)2　引物自身結合　復性　(2)基因表達載體的構建　SmaⅠ、XbaⅠ　(3)攜帶目的基因進入甘薯細胞，并整合到甘薯細胞的染色體DNA上　(4)脫分化、再分化　抗原—抗體雜交
考點2
評價遷移應用
1．A　[瓊脂糖凝膠的濃度會影響DNA分子在凝膠中的遷移率和分辨率，瓊脂糖凝膠的濃度通常是根據所需分離的DNA片段大小來選擇的。對于較大的DNA片段，比如基因組DNA或質粒DNA，通常選擇較低濃度的瓊脂糖凝膠，因為它們需要更大的孔徑來有效遷移。而對于較小的DNA片段，比如PCR產物或酶切片段，則需要選擇較高濃度的瓊脂糖凝膠，以提供更好的分辨率和分離效果，A正確。凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示電泳的進度，而不是指示DNA分子的具體位置，B錯誤。在瓊脂糖凝膠電泳中，當電場作用時，DNA片段實際上是向正極遷移的，而不是向負極遷移。同時，DNA片段的遷移速率與其大小成反比，即DNA片段越長，遷移速率越慢，C錯誤。瓊脂糖凝膠中的DNA分子需染色后，才可在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。]
2．B　[PCR通過調節溫度來控制DNA 雙鏈的解聚及模板與引物的結合，如PCR通過90 ℃以上的高溫解旋，50 ℃左右的溫度下模板與引物結合，A正確；在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關，凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300 nm的紫外燈下被檢測出來，B錯誤；DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，C正確；PCR技術大量擴增目的基因時，第n－1次生成2n-1個DNA分子，第n次復制形成2n個DNA，所以需要的引物數目為(2n－2n-1)×2＝2n，D正確。]
體驗真題
1．B　[分析圖甲可知，啟動子在左側，Gata3 GFP基因在右側，啟動子啟動轉錄后，可以使GFP基因轉錄，Gata3基因的啟動子能控制GFP基因的表達，A錯誤；因啟動子在左側，轉錄的方向為從左向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；整合GFP基因后，核酸片段變長，2號個體只有大片段，所以是Gata3 GFP基因純合子，4號個體只有小片段，是野生型，C錯誤；用引物1和引物3進行PCR擴增，不能更好地區分雜合子和純合子，D錯誤。]
2．(1)變性　氫鍵　(2)避免目的基因和質粒的任意連接、防止目的基因和質粒的自身環化　T4 DNA連接酶　(3)細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態　利用DNA分子雜交技術，將大腸桿菌的基因組DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示出雜交帶，表明大腸桿菌中含有重組質粒　(4)甘氨酸－脯氨酸－絲氨酸
3．(1)脫氧核糖核苷酸(脫氧核苷酸)　(2)EcoRⅠ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我環化；不能保證目標片段與載體定向連接　(3)酶切后的空載體片段，啟動子D＋基因S片段　PCR　(4)品種DN的基因S上游啟動子效應比TL強，使得基因S表達量更高，種子更大
12 / 12課時數智作業(五十六)　基因工程的基本操作程序
1．(2024·廣東茂名高三聯考)用PCR檢測某轉基因植株是否導入目的基因時，電泳鑒定時發現擴增出多條條帶，其原因最可能是(　　)
A．引物長度過短　　　　 B．引物之間發生配對
C．體系中Mg2+濃度過低 D．電泳時凝膠濃度過高
2．(2024·廣東梅州診斷)轉化是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。下列有關說法錯誤的是(　　)
A．大腸桿菌轉化實驗中可使用Ca2+處理以提高轉化效率
B．目的基因導入受體細胞前必須構建基因表達載體以便穩定存在
C．將DNA溶液滴加在授粉后的花柱切面上，可以使目的基因進入胚囊
D．農桿菌轉化法中需要進行兩次體外拼接和一次導入
3．(2024·廣東揭陽調研)利用PCR 獲得目的基因后，用限制酶EcoRⅠ同時處理目的基因與質粒，拼接后可得到重組基因表達載體，其部分DNA片段如下圖所示。下列有關引物的分析正確的是(　　)
A．通過PCR獲取目的基因時，所選的引物可為引物2和引物3
B．檢測目的基因是否插入質粒且方向是否正確時，應選用引物1 和引物4進行PCR
C．若設計的引物與模板不完全配對，可適當提高 PCR 復性的溫度
D．DNA聚合酶能與引物結合，并從引物的5′端連接脫氧核苷酸
4．(2024·江蘇鹽城模擬)PCR引物的3′端有結合模板DNA的關鍵堿基，5′端無嚴格限制，可用于添加限制酶切割位點等序列。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．圖中兩條子鏈合成一定都是從5′端向3′端延伸
B．圖示表示復性階段，該過程的溫度與引物的長短有關
C．用圖示引物擴增5次后，可以產生22個目標產物
D．PCR每次循環都消耗引物和原料，在實驗過程中需要及時補充
5．(2024·河北衡水模擬)翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)是在翻譯水平受到抑制的腫瘤相關蛋白，是一個高度保守且和細胞生長、死亡等功能有關的蛋白。現從果蠅基因組DNA中擴增果蠅dTCTP基因，經限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，插入表達質粒pGEX-4T-2上構建基因表達載體，最終表達有活性的dTCTP融合蛋白。關于該基因表達載體的構建，下列敘述錯誤的是(　　)
A．表達質粒pGEX-4T-2需要用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切
B． dTCTP基因是該項研究中的目的基因
C．除了目的基因和標記基因外，該基因表達載體還必須有啟動子和終止子
D．將dTCTP基因插入表達質粒pGEX-4T-2上時，需要用到DNA聚合酶
6．(2024·廣東深圳期末)研究者欲將X基因導入大腸桿菌的質粒中保存。該質粒含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因(表達產物可以分解X-gal產生藍色物質，使菌落呈藍色；否則菌落為白色)，其結構如下圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
A．電泳時，X基因和重組質粒在瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同
B．導入重組質粒前通常需用適宜濃度的Ca2+溶液處理大腸桿菌
C．應在添加了氨芐青霉素和X-gal的培養基上篩選大腸桿菌
D．成功導入X基因的細菌在含X-gal的培養基上的菌落呈藍色
7．(2024·廣東佛山階段測試)B基因存在于水稻基因組中，僅在體細胞和精子中正常表達，在卵細胞中不轉錄。為研究B基因表達對卵細胞的影響，設計了如下實驗來獲取能夠在卵細胞中表達B基因的轉基因植株。
注：啟動子*指可在水稻卵細胞中啟動轉錄的啟動子；Luc基因表達的熒光素酶能催化熒光素產生熒光。
下列關于該實驗的敘述，不正確的是(　　)
A．B基因在水稻卵細胞中不轉錄，可能是B基因的啟動子在卵細胞中無法啟動轉錄
B．可從水稻體細胞和精子中提取RNA合成cDNA來獲得B基因中編碼蛋白的序列
C．在鑒定和篩選轉基因植株時，可以檢測加入熒光素的該植株卵細胞中是否發出熒光
D．過程②在培養基中應加入卡那霉素以檢測T-DNA是否整合到水稻細胞染色體DNA上
8．(2024·廣東中山期末)在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因表達載體，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如下圖所示。以下相關敘述錯誤的是(　　)
A．電泳是帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程。本實驗中，帶電分子會向著電荷相反的電極移動
B．該載體最可能是環狀DNA，兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點
C．限制酶R1和R2的酶切位點最短相距約200 bp，最長相距約600 bp
D．需將擴增得到的PCR 產物與內含指示劑的電泳緩沖液混合后加樣
9．(2024·廣東中山期末)雙向啟動子可同時結合兩個RNA 聚合酶來驅動下游基因的表達；研究人員構建了下圖所示的表達載體，以檢測雙向啟動子作用效果。下列分析錯誤的是(　　)
A．可用農桿菌轉化法將構建好的表達載體導入植物細胞
B．可通過觀察是否出現熒光和藍色物質確認雙向啟動子的作用
C．在培養基中添加壯觀霉素可篩選出成功導入表達載體的微生物受體細胞
D．為連入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了雙向啟動子及LUC基因的質粒
10．(14分)(2024·吉林、黑龍江適應性測試)植物在高于胞內Na＋濃度的環境下，SOS3和SOS2激活位于細胞膜上的轉運蛋白SOS1，SOS1通過SOS信號通路與細胞質內Na＋結合并將其排出細胞外，維持其正常生命活動。回答下列問題：
(1)植物利用SOS信號通路將Na＋排出細胞外，這種運輸方式的特點是________________________。
(2)通過基因工程在水稻中過量表達SOS1蛋白，以期增強水稻抗鹽能力。
①為獲得編碼SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻總RNA，通過______________獲得模板DNA，再經PCR獲得SOS1基因片段。
②測序表明，SOS1基因編碼序列含有3 444個核苷酸，其中A＋T含量占53%，模板鏈中C含量為26%，那么SOS1基因雙鏈序列中G＋C的含量為______%。
③構建表達載體時，在下圖所示載體含有的限制酶識別位點插入SOS1基因。序列分析發現SOS1基因內部有XbaⅠ的識別序列，為使載體中SOS1基因和綠色熒光蛋白基因正確表達，應在SOS1基因兩端分別添加________________兩種限制酶的識別序列，將SOS1基因插入載體前，應選用________________兩種限制酶對載體酶切。
(3)重組質粒轉化水稻后，選取可發綠色熒光的植株，鑒定其抗鹽能力是否增強，采取的操作是_________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)若發現水稻中過量表達SOS1基因并不能明顯提高其抗鹽能力，從信號通路角度分析，可能的原因是_______________________________________________
____________________________________________________________________。
11．(14分)(2024·廣東湛江期末)研究人員將抗鹽基因轉入普通煙草培育出了抗鹽煙草。實驗過程中所用的Ti質粒與含抗鹽基因的DNA上相關限制酶的酶切位點分別如圖1、圖2所示。Ti質粒上的T-DNA能被轉移到被侵染的細胞中并被整合到該細胞的染色體DNA上。
請根據圖示回答有關問題：
(1)利用PCR技術大量擴增抗鹽基因時，在反應體系中要加入含抗鹽基因的DNA片段、4種脫氧核苷酸、________________________________、引物等物質，以提供DNA復制所需的基本條件；PCR反應依次經過________、復性和延伸三步，并重復循環多次。
(2)在構建基因表達載體時，選用的Ti質粒除了以上結構外，還應有____________(填“復制原點”“起始密碼子”或“終止密碼子”)，切割Ti質粒和含抗鹽基因的DNA最好選用____________________________(限制酶的名稱)。
(3)利用微生物培養技術篩選獲得含抗鹽基因表達載體的農桿菌：將轉入目的基因的農桿菌接種到含某種抗生素的培養基上進行培養，結果如下圖所示，當同時出現______________________這兩組結果時，可確定農桿菌中已含抗鹽基因表達載體；然后用該農桿菌去侵染植物細胞。
(4)有人認為利用上述方法進行育種有助于降低X抗生素抗性基因轉移到其他植物的風險，理由是該質粒只有______________(結構)整合到受體細胞的染色體DNA上，________________抗性基因不會轉移整合到受體細胞的染色體DNA上。
課時數智作業(五十六)
1．A　[引物長度過短可能會導致特異性降低，從而結合到非目的基因的區域進行擴增，出現多條條帶，A正確；如果引物之間發生配對，則引物與模板DNA結合比例降低，從而影響PCR反應的效率，B錯誤；體系中Mg2+濃度過低會影響DNA 聚合酶的活性，可能導致擴增效率降低甚至擴增失敗，C錯誤；電泳時凝膠濃度過高主要影響的是DNA條帶的遷移速度，而不是導致出現多條條帶的原因，D錯誤。]
2．D　[可以用Ca2+處理大腸桿菌細胞，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，有利于重組的基因表達載體導入其中，提高轉化效率，A正確。將目的基因導入受體細胞前必須構建基因表達載體，這是基因工程的核心步驟，B正確。花粉管通道法：可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中，也可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊，C正確。農桿菌轉化法總體上有兩次的拼接過程，發生在Ti質粒與目的基因之間(體外拼接)、攜帶目的基因的T DNA與植物細胞的染色體DNA之間(體內拼接)；兩次的導入過程即基因表達載體導入農桿菌、農桿菌T DNA導入植物細胞，D錯誤。]
3．A　[引物結合在模板鏈的3′端，通過PCR獲取目的基因時，所選的引物可為引物2和引物3，A正確；引物結合在模板鏈的3′端，檢測目的基因是否插入質粒且方向是否正確時，應選用引物2 和引物4進行PCR，B錯誤；若設計的引物與模板不完全配對，可適當降低 PCR 復性的溫度，以便引物與模板鏈結合，C錯誤；DNA聚合酶能與引物結合，并從引物的3′端連接脫氧核苷酸，D錯誤。]
4．D　[耐高溫的DNA聚合酶只能從引物的3′端開始延伸DNA子鏈，所以兩條子鏈合成一定都是從5′端向3′端延伸，A正確；圖示表示復性階段，該過程的溫度與引物的長短、堿基組成等有關，B正確；經過5次循環后會產生25＝32個DNA分子，其中只有2個DNA分子含有最初的模板鏈，另僅含有第一次復制產生的單鏈參與形成的DNA分子有8個，因此經過5次復制產生等長的目的基因片段有32－10＝22個，C正確；PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在實驗過程中不需要補充，D錯誤。]
5．D　[dTCTP基因經限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，因此需要相同的限制酶切割載體，產生相同的黏性末端，A正確；由題意可知，從果蠅基因組DNA中擴增果蠅dTCTP基因，最終獲得dTCTP融合蛋白，故dTCTP基因是該項研究中的目的基因，B正確；基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等，C正確；利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體切口處，構建基因表達載體，D錯誤。]
6．D　[在瓊脂糖凝膠中的遷移速率最終取決于分子的大小，X基因和重組質粒分子大小不同，所以遷移速率不同，A正確；將重組質粒導入大腸桿菌前，一般先用Ca2+處理大腸桿菌，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，B正確；由于重組質粒上含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)和LacZ基因，所以導入并表達成功后的大腸桿菌會對氨芐青霉素有抗性、菌落中出現特定顏色，所以在添加了氨芐青霉素和X gal的培養基上篩選大腸桿菌，C正確；導入X基因會使LacZ基因被破壞，使其不能產生正常的表達產物，所以在含X gal的培養基上的菌落呈白色，D錯誤。]
7．D　[啟動子是與RNA聚合酶結合并能啟動mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵細胞中不能轉錄，可能是B基因的啟動子在卵細胞中無法啟動轉錄，A正確；目的基因獲取途徑之一就是從cDNA文庫中獲得，故可從水稻體細胞和精子中提取RNA合成cDNA來獲得B基因中編碼蛋白的序列，B正確；由于基因表達載體上有Luc基因，其表達的熒光素酶能催化熒光素產生熒光，所以在鑒定和篩選轉基因植株時，可以檢測加入熒光素的該植株卵細胞中是否發出熒光，C正確；卡那霉素抗性基因不在T DNA上，故不能用卡那霉素檢測T DNA是否整合到水稻細胞染色體DNA上，應用潮霉素，D錯誤。]
8．D　[電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程，由于同性相斥、異性相吸，帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動，A正確；由題可知，當僅用一種限制酶切割載體時，這兩種限制酶切割產生的DNA片段等長，且只有1個DNA片段，當使用兩種限制酶同時切割時，產生兩種長度的DNA片段，故該載體最可能是環狀DNA，兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；由題可知，兩種限制酶同時切割時，產生600 bp和200 bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點最短相距約200 bp，最長相距約600 bp，C正確；將擴增得到的PCR產物與內含指示劑的凝膠載樣緩沖液混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入加樣孔，D錯誤。]
9．D　[將基因表達載體導入植物細胞常用的方法是農桿菌轉化法，A正確；雙向啟動子如果正常表達，就會合成熒光素酶和β 葡萄糖苷酶，催化底物分別產生熒光和生成藍色物質，從而確定雙向啟動子的作用，B正確；如果成功導入含有壯觀霉素抗性基因的基因表達載體，受體細胞就具有抗壯觀霉素的能力，在含有壯觀霉素的培養基上能生存，因此可以篩選出成功導入表達載體的微生物受體細胞，C正確；如果用SphⅠ酶切已整合了雙向啟動子及LUC基因的質粒時就會破壞LUC基因，D錯誤。]
10．(每空2分，共14分)(1)需要能量、需要載體蛋白　(2)逆轉錄　47　Spe Ⅰ、EcoR Ⅰ　Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ　(3)將轉基因水稻和普通水稻種植于高于胞內Na＋濃度的環境下，觀察兩種水稻的生長狀況　(4)水稻細胞內SOS3和SOS2的含量并未增加，轉運蛋白SOS1的含量增多，但激活的SOS1數量并未明顯增多，SOS1通過SOS信號通路與細胞質內Na＋結合并轉運的量沒有明顯增加
11．(每空2分，共14分)(1)耐高溫的DNA聚合酶(和緩沖溶液)　變性　(2)復制原點　BamHⅠ和Sau3AⅠ　(3)甲、丁(或抗X、不抗Y)　(4)T DNA　X抗生素
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