資源簡介

(共85張PPT)
第55講　重組DNA技術的基本工具
選擇性必修3　生物技術與工程
第九單元　生物技術與工程
1．闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。　
2．實驗：DNA的粗提取與鑒定。
一、基因工程的概念
考點1　重組DNA技術的基本工具
DNA分子
轉基因
遺傳特性
生物類型
基因重組
二、基因工程的誕生和發展
1．肺炎鏈球菌轉化實驗不僅證明了遺傳物質是DNA，還證明了DNA可在同種生物不同個體之間____。
2．DNA雙螺旋結構的提出和__________的證明。
3．中心法則的確立。
4．________的破譯。
轉移
半保留復制
遺傳密碼
5．基因轉移載體的發現。_____________________________的發現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創造了條件。
6．_____體外重組的實現。
7．重組DNA表達實驗的成功。
8．DNA測序和合成技術的發明。
9．_____技術的發明。
10．__________技術可以實現對特定基因的定點插入、敲除或替換。
限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶
DNA
PCR
基因組編輯
三、重組DNA技術的基本工具
1．限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)
原核生物
特定核苷酸序列
磷酸二酯鍵
黏性末端
1．(人教版選擇性必修3 P71旁欄思考)存在于原核生物中的限制酶的作用是_____________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原體的危害
2．(人教版選擇性必修3 P71正文)用兩種不同的限制酶切割目的基因的優點是___________________________________________________
__________________________________________________________。
提示：防止質粒和目的基因的自我環化及質粒和目的基因的反向連接
2．DNA連接酶
磷酸二酯鍵
大腸桿菌
黏性末端和平末端
3．載體
噬菌體
一個至多個
自我復制
受體DNA
標記
3．(人教版選擇性必修3 P72旁欄思考)DNA連接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要區別在于_________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
__________________________________________________________。
提示：DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是將單個的脫氧核苷酸連接到脫氧核苷酸鏈上
4．(人教版選擇性必修3 P73正文)實踐中常用某些病毒載體作為基因工程工具，除具備普通“質粒載體”的條件外，還應具有的條件是___________________________________________________________。
提示：對靶細胞具有較高的轉化效率；不能增殖，對細胞無害
限制酶的選擇要求
1．位置要求：限制酶的酶切位點不能位于啟動子、終止子、復制原點、標記基因當中，所選酶切位點應位于啟動子和終止子之間，若載體有多個標記基因，并非都不能破壞，要至少保留一個，用于重組DNA的鑒定和篩選。另外，目的基因上如果有該酶的酶切位點，不能選擇。
[深化拓展]
2．酶切要求
(1)單酶切：為使目的基因與載體形成的DNA片段末端能夠連接，通常使用同一種限制酶將兩者切割(如下圖，選用XhoⅠ)，但單酶切會出現目的基因與質粒的自身環化和隨意連接，還可造成目的基因的多拷貝插入。
(2)雙酶切：雙酶切可以確保目的基因的正確插入，要求兩個酶切位點位于目的基因的兩側，如下圖可選擇PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位點個數和相對位置，如：不能選擇XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切。另外，不同的限制酶所產生的末端相同，兩端也可連接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后產生的末端相同，可選擇XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切質粒。
3．數量要求：如果所選限制酶的切割位點不止一個，如選擇SmaⅠ進行酶切，則切割重組后會丟失復制原點，那么載體進入受體細胞后不能自主復制，所選限制酶在載體上最好只有一個酶切位點。
4．特殊要求：例如根據Ti質粒的T-DNA片段選擇限制酶，假設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ，則甲、乙、丁質粒均不宜選取，丙質粒宜選取。
1．基因工程的原理是基因重組，此變異是不定向的。 (　　)
提示：此變異是定向的。
2．DNA連接酶“縫合”目的基因與載體之間的氫鍵。 (　　)
提示：DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。
×
×
3．限制性內切核酸酶EcoRⅠ識別并切割 雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對)約為4 000。 (　　)
4．大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。 (　　)
5．作載體的質粒都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。 (　　)
√
√
√
我國科學家將藍細菌ictB蛋白(能高效轉運和濃縮CO2)的基因(ictB基因)與水稻葉綠體基因組中PSbA基因的啟動子(葉片特異性表達)連接成重組DNA，然后將重組DNA與Ti質粒構建成表達載體，再導入水稻葉肉細胞的葉綠體中，最終成功獲得了轉ictB基因水稻，提高了水稻的產量。在ictB基因表達載體的構建中，含PSbA啟動子和ictB基因的重組DNA分子和Ti質粒的酶切位點如圖所示。
(1)為使重組DNA分子能定向插入Ti質粒的相應區段中，可在重組DNA分子兩端添加限制酶識別序列，據圖可知，M端、N端添加的限制酶識別序列分別是________。
提示：BglⅠ、EcoRⅤ
(2)經過酶切的重組DNA分子和 Ti質粒進行連接時，選用________________(填“E．coli DNA連接酶”或“T4 DNA連接酶”)連接效率較高。
提示：T4 DNA連接酶
(3)在ictB基因表達載體的構建中不宜選用Ti質粒作為載體，原因是
___________________________________________________________。
提示：質粒大，難以進行插入外源基因的構建，以及酶切位點受限
考向1　基因工程工具酶的應用
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P73思考·討論)某小組通過PCR(假設引物長度為8個堿基短于實際長度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切(下圖)，再用所得片段成功構建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是(　　)
A．其中一個引物序列為5′-TGCGCAGT-3′
B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步驟①的酶對載體進行酶切，至少獲得了2個片段
D．酶切片段和載體連接時，可使用E．coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶
√
B　[由于引物只能引導子鏈從5′到3′，根據堿基互補配對原則，其中一個引物序列為5′-TGCGCAGT-3′，A正確；根據三種酶的酶切位點，左側的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右邊的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B錯誤；用步驟①的酶對載體進行酶切，使用了NheⅠ和CfoⅠ進行切割，根據他們的識別位點以及原本DNA的序列，切割之后至少獲得了2個片段，C正確；E．coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶可以連接DNA片段的黏性末端，D正確。]
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P75拓展應用T2)含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)的質粒、含有目的基因的DNA片段及相關限制酶酶切位點如圖所示。在構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中的實踐中，某同學選用EcoRⅠ和MfeⅠ分別對質粒和含目的基因的DNA片段進行雙酶切。下列對這種操作的優點的敘述，正確的是(　　)
A．可以避免質粒或者目的基因自身環化
B．可以避免目的基因與質粒反向連接
C．可以避免一個質粒中連續接入多個目的基因
D．可以避免受體菌的EcoRⅠ和MfeⅠ將重組質粒中的目的基因切割下來
√
D　[兩種限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免質粒或者目的基因自身環化，也不能避免目的基因與質粒反向連接，A、B錯誤；兩種限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免一個質粒中連續接入多個目的基因，C錯誤；若質粒EcoRⅠ酶切位點處與目的基因MfeⅠ酶切處連接，質粒MfeⅠ酶切位點處與目的基因EcoRⅠ酶切位點處連接，則正好將目的基因正向連接，這樣的重組質粒，既無EcoRⅠ識別位點，又無MfeⅠ識別位點，相當于將基因“焊死”在質粒上，故可以避免受體菌的EcoRⅠ和MfeⅠ將重組質粒中的目的基因切割下來，D正確。]
考向2　基因工程載體的應用
3．(鏈接人教版選擇性必修3 P72圖3-4、正文)如圖為外源DNA、大腸桿菌及質粒載體的結構模式圖，據圖回答下列問題：
(1)a代表的物質和質粒的化學本質相同，都是________________(寫中文名稱)，________________________________________，構成人類的胰島素基因和質粒的基本骨架。
(2)將人的胰島素基因導入質粒構建基因表達載體時，所需的酶是______________________________；基因表達載體應具有的基本條件有________________________________________________(答2點)。
脫氧核糖核酸
磷酸和脫氧核糖交替連接，排列在外側
限制性內切核酸酶和DNA連接酶
能自我復制、具有標記基因、具有啟動子和終止子等
(3)氨芐青霉素抗性基因在質粒DNA上被稱為____________，其作用是_________________________________________________________。
(4)將剪切后的人胰島素基因和剪切后的質粒混合進行連接反應，得到重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌時，大腸桿菌應先用________處理，使其能吸收周圍的DNA。
標記基因
用于鑒定目的基因(或重組質粒)是否導入受體細胞
Ca2+
[解析]　(1)a表示大腸桿菌擬核中的大型環狀DNA，質粒是大腸桿菌細胞中的小型環狀DNA，二者都是脫氧核糖核酸。人類的胰島素基因和質粒都是DNA，磷酸和脫氧核糖交替連接，排列在外側，構成DNA的基本骨架。(2)構建基因表達載體時，需要將目的基因和質粒進行切割，需要用到限制性內切核酸酶，同時需要將二者進行連接，需要用到DNA連接酶；基因表達載體應具備的基本條件有能自我復制、具有標記基因、具有啟動子和終止子等。(3)氨芐青霉素抗性基因是質粒DNA上的標記基因，用于鑒定目的基因(或重組質粒)是否導入受體細胞。(4)將目的基因導入大腸桿菌時，大腸桿菌應先用Ca2+處理，使得大腸桿菌細胞處于感受態，便于周圍DNA進入細胞。
一、實驗原理
考點2　DNA的粗提取與鑒定
酒精
2 mol/L
藍色
二、實驗步驟
白色絲狀物
二苯胺
1．本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)。可選用雞血細胞作材料。
2．加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
3．二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。
4．提取植物細胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
5．在DNA進一步提純時，選用冷卻的體積分數為95%的酒精溶液的作用是溶解雜質和析出DNA。
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P75圖示信息)現用新鮮的加入抗凝劑的雞血來進行DNA的粗提取和鑒定實驗，其過程如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)
A．在實驗材料的選擇上，雞血細胞比菜花細胞更容易吸水漲破
B．圖①和圖③中均用到了攪拌，但攪拌的力度和速度均不同
C．圖③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精的原理粗提取DNA
D．圖④甲試管中加入的是清水和二苯胺試劑，沸水浴后不會出現顏色變化
√
D　[動物細胞沒有細胞壁，因此雞血細胞相對于菜花細胞更容易吸水漲破，A正確；圖①攪拌的目的是加速吸水后的細胞破碎，因此力度和速度較大，圖③攪拌的目的是使析出的DNA纏繞在玻璃棒上，攪拌時力度小、速度緩，B正確；DNA不溶于酒精，細胞中的某些蛋白質可以溶于酒精，利用這一原理可以將蛋白質和DNA進一步分離，C正確；圖④甲試管中加入的是2 mol/L NaCl溶液和二苯胺試劑，沸水浴后不會出現顏色變化，D錯誤。]
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P74－75探究·實踐)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是(　　)
A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質
B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等
C．沉淀：可反復多次以提高DNA的純度
D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現藍色
√
D　[裂解是加蒸餾水讓細胞吸水漲破，釋放出DNA等物質，A正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質等與DNA分離，B正確；DNA不溶于酒精，而某些蛋白質溶于酒精，可以反復多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA純度，C正確；將DNA溶于2 mol/L的NaCl溶液，加入二苯胺試劑，混合均勻后，沸水中加熱五分鐘，待冷卻后，能呈現藍色，D錯誤。]
體驗真題　感悟高考 · 有章可循
√
1．(2024·湖南卷)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發現DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是(　　)
A．限制酶失活，更換新的限制酶
B．酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等
C．質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，需更換正常質粒DNA
D．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
B　[限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，A正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，此時應有部分DNA被酶切，B錯誤；質粒DNA突變會導致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應更換為正常質粒，C正確；質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。]
2．(2023·全國新課標卷)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質粒進行切割、連接，以構建基因表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。
下列基因表達載體構建方案合理且效率最高的是(　　)
A．質粒和目的基因都用酶3切割，用E．coli DNA連接酶連接
B．質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA連接酶連接
C．質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA連接酶連接
D．質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coli DNA連接酶連接
√
C　[酶3切割后得到的是平末端，E．coli DNA連接酶連接平末端的效率要遠遠低于T4 DNA連接酶，應該用T4 DNA連接酶連接，A不符合題意；質粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質粒上的連接方向，此基因表達載體的構建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質粒和目的基因，會破壞質粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續的篩選，D不符合題意。]
3．(2024·安徽卷)下列關于“DNA 粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　　)
A．實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低
B．利用DNA和蛋白質在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA
C．DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物
D．將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應，可檢測溶液中是否含有蛋白質雜質
√
D　[研磨液有利于DNA的溶解，換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低，A正確；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，可初步分離DNA，B正確；DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl濃度的變化而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對DNA進行粗提取，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺試劑會被染成藍色，二苯胺試劑用于鑒定DNA，無法檢測蛋白質，D錯誤。]
1．(2024·廣東實驗中學期中)在基因工程的操作中，需要三種工具，分別是“分子手術刀”“分子縫合針”和“分子運輸車”，下列關于這三種工具的敘述，不正確的是(　　)
A．“分子手術刀”指的是限制性內切核酸酶，可以斷開 DNA 的磷酸二酯鍵
B．“分子縫合針”指的是 DNA 聚合酶，可以催化生成斷裂的磷酸二酯鍵
C．“分子運輸車”指的是載體，常用的載體有質粒、動植物病毒和噬菌體等
D．“分子手術刀”主要來自原核生物，它一般不會切割該生物自己的 DNA
課時數智作業(五十五)　重組DNA技術的基本工具
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
√
B　[“分子手術刀”是限制性內切核酸酶(限制酶)，能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點切割使磷酸二酯鍵斷裂，A正確；“分子縫合針”是DNA連接酶，能將具有相同末端的DNA片段連接起來，B錯誤；基因工程中的“分子運輸車”即載體，有質粒、動植物病毒、噬菌體等，其中質粒是基因工程中最常用的載體，C正確；“分子手術刀”主要來自原核生物，它一般不會切割該生物自己的DNA，可能是該生物不含有該序列或者含有該序列，但被修飾了的，D正確。]
題號
1
3
5
2
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6
8
7
2．(2024·廣東肇慶期中)限制酶MunⅠ和限制酶 EcoRⅠ的識別序列及其切割位點分別為—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如圖表示某一目的基因片段與質粒拼接形成重組質粒的過程，下列敘述錯誤的是(　　)
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
A．用限制酶 EcoRⅠ切割目的基因，同時用限制酶 MunⅠ切割質粒
B．構建重組質粒時，會形成不止一種脫氧核苷酸序列(考慮DNA片段兩兩連接)
C．將重組質粒同時用以上2種限制酶切割則會再形成1種長度的 DNA 片段
D．標記基因一般是抗生素基因或熒光標記基因，便于目的基因的篩選
√
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
D　[由題圖可知，目的基因兩側都是限制酶EcoRⅠ的切割位點，因此應選用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子，質粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位點，但EcoRⅠ的切割位點位于標記基因中，用其切割會破壞標記基因，因此為保證重組質粒表達載體的準確構建，應選用限制酶MunⅠ切割質粒，A正確；構建重組質粒時，考慮DNA片段兩兩連接，會形成不止一種脫氧核苷酸序列，B正確；限制酶MunⅠ切割質粒后與目的基因連接形成重組質粒，連接處形成—CAATTC—和—GAATTG—的新序列，都不能被 2 種限制酶識別、切割，但EcoRⅠ能識別標記基因的相應序列并切割， 使環狀重組質粒斷裂形成1種長度的DNA片段，C正確；標記基因一般是抗生素抗性基因或熒光標記基因，便于目的基因的篩選，D錯誤。
題號
1
3
5
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4
6
8
7
3．(2024·四川成都列五中學月考)研究人員欲將某動物體內基因X導入大腸桿菌的質粒中保存，質粒含有抗性基因與酶切位點，目的基因兩端酶切位點如下圖所示，下列敘述錯誤的是(　　)
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
A．使用Hind Ⅲ和XbaⅠ進行酶切能避免基因X與質粒反向連接
B．目的基因X與質粒連接可使用E．coli DNA連接酶
C．Ca2+處理大腸桿菌能降低細胞膜通透性，有利于重組質粒導入受體細胞
D．含有基因X的大腸桿菌能在氨芐青霉素選擇培養基中生長
√
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
C　[分析題圖可知，使用Hind Ⅲ和XbaⅠ進行酶切會產生不同的黏性末端，故能避免基因X與質粒反向連接，A正確；目的基因X與質粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切會產生黏性末端，E．coli DNA連接酶可連接黏性末端，故目的基因X與質粒連接可使用E．coli DNA 連接酶，B正確；用Ca2+處理大腸桿菌，能提高細胞膜的通透性，使細胞處于一種能夠吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，有利于重組質粒導入受體細胞，C錯誤；分析題圖可知，重組質粒上含有氨芐青霉素抗性基因，故含有基因X的大腸桿菌能在氨芐青霉素選擇培養基中生長，D正確。]
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
4．(2024·廣東佛山期中)“DNA的粗提取與鑒定”的實驗步驟是：研磨→去雜質→析出→鑒定；某研究小組欲探究不同的去雜質方法對實驗結果的影響，實驗結果如表所示。下列敘述錯誤的是(　　)
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
去雜質方式 沉淀質量(g) DNA濃度 (ng/μL) OD260/OD280 二苯胺
鑒定
離心 0.068 81.5 1.53 藍色
4 ℃冰 箱靜置 0.1028 336.4 1.41
注：OD260與OD280的比值可檢查DNA純度。純DNA的OD260/OD280為1.8，當存在蛋白質污染時，這一比值會明顯降低。
A．豬肝和菜花均可作為提取DNA的材料
B．對研磨液進行離心是為了加速DNA的沉淀
C．離心法可以獲得更高純度的DNA
D．離心或沉淀后應取上清液進一步提取DNA
√
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
B　[DNA的粗提取與鑒定的實驗中，應選擇富含DNA的材料，豬肝和菜花均可作為提取DNA的材料，A正確；離心研磨液的目的是加速沉淀，離心能夠加速細胞膜、細胞器、一些較大雜質的沉淀，離心法可以獲得更高純度的DNA，B錯誤，C正確；離心或沉淀后應取上清液進一步提取DNA，D正確。]
c
題號
1
3
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2
4
6
8
7
5．(2024·湖北武漢期末)某植物的野生型和突變型植株雜交，F1均為野生型，F1自交所得F2中絕大部分植株與野生型相似(包括野生型、介于野生型與突變型之間的“過渡類型”)，以＋表示，少部分植株與突變型相似，以P表示。研究發現，兩表型相關基因的堿基序列一致，長度均為2.4 kb，將此片段用限制酶PstⅠ完全酶切結果如下圖。下列敘述錯誤的是(　　)
題號
1
3
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4
6
8
7
A．據題意推測，限制酶PstⅠ可能對甲基化敏感
B．2.2 kb和0.9 kb條帶是“過渡類型”的酶切產物
C．圖2中P的①②位點可能均發生了甲基化
D．該植株的表觀遺傳現象是可以穩定遺傳的
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
√
D　[據題意可知，突變型與野生型基因長度相同，突變型基因序列不能被限制酶PstⅠ酶切，由此推測，限制酶PstⅠ可能對甲基化敏感，A正確；據題圖可知，野生型基因序列酶切產物是1.5 kb和0.7 kb，因此2.2 kb和0.9 kb條帶是“過渡類型”的酶切產物，B正確；突變型基因序列不能夠被限制酶PstⅠ酶切，圖2中P的①②位點可能均發生了甲基化，C正確；根據題意無法判斷該植株的表觀遺傳現象是否可以穩定遺傳的，D錯誤。]
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
6．(2023·湖北卷)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(　　)
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否
D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養基中能形成菌落
√
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
D　[若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉錄的產物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，重組質粒和質粒中都有四環素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質粒的大小與質粒不同，能夠鑒定重組質粒構建成功與否，C正確；SphⅠ的酶切位點位于四環素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，會破壞四環素抗性基因，重組質粒中只含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養基中能形成菌落，在含Tet的培養基中不能形成菌落，D錯誤。]
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
7．(2024·廣東佛山三模)圖1表示基因工程中用到的質粒，其中PstⅠ是目的基因插入位點，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環素抗性基因。圖2表示篩選出導入重組質粒的受體菌的方法(四環素和氨芐青霉素在高溫下不穩定易失效)。下列說法正確的是(　　)
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
A．構建重組DNA分子用到的工具酶有限制酶和質粒
B．圖2所用培養基應加入抗生素并調好pH后再滅菌處理
C．圖2中利用絨布接種的方法為稀釋涂布平板法
D．原板上的甲、乙菌落中，甲菌落是成功導入重組質粒的受體菌
√
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
D　[構建重組DNA分子用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶，質粒為載體，A錯誤；由于四環素和氨芐青霉素在高溫下不穩定易失效，因此應在滅菌后再加入抗生素，B錯誤；圖2中利用絨布接種的方法為影印法，不改變菌落的位置，C錯誤；原板上的甲、乙菌落中，甲菌落在含四環素的培養基上能生存，在含氨芐青霉素的培養基上不能生存，說明甲菌落中質粒的氨芐青霉素抗性基因被破壞，說明其是成功導入重組質粒的受體菌，D正確。]
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
8．(14分)(2024·廣東湛江期末)限制酶是基因工程的基本工具之一。同尾酶指來源各異，識別的靶序列也不相同，但產生相同的黏性末端的限制酶，在基因工程中應用較為廣泛。幾種常見的限制酶的切割位點如表所示。回答下列問題：
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
限制酶 BamH Ⅰ Sal Ⅰ Bgl Ⅱ XhoⅠ
識別序列及切割位點
(1)表中兩組同尾酶分別是__________________和________________。表中限制酶切割出的為黏性末端，若限制酶切割出的為平末端，則用_______________(填“E．coli DNA連接酶”“T4 DNA連接酶”或“E．coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶”)效率更高。
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
BamHⅠ、BglⅡ
SalⅠ、XhoⅠ
T4 DNA連接酶
(2)某限制酶的識別序列及切割位點為↓GATC，某DNA分子上有4個該限制酶的識別位點，用該限制酶切割該DNA分子，會生成4個片段。若用BamHⅠ切割該DNA分子會生成2個片段，則該DNA分子為________(填“環”或“鏈”)狀結構。若用2種酶同時處理該DNA分子，則會生成______個片段。
(3)限制酶的切割位點是____________(填化學鍵名稱)。在基因工程中，與使用一種限制酶相比，同時使用2種同尾酶進行切割的優點有_________________________________(寫出1個)。
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
環
4
磷酸二酯鍵
一定程度上防止重組質粒再次被切割
[解析]　(1)表中兩組同尾酶分別是BamHⅠ與BglⅡ，SalⅠ與XhoⅠ。由表分析，BamHⅠ和BglⅡ或SalⅠ和XhoⅠ可以切割出相同的黏性末端。平末端可以用T4 DNA連接酶連接效率更高。(2)該限制酶的識別序列及切割位點為↓GATC，該DNA分子上有4個該限制酶的識別位點。用該限制酶切割該DNA分子，生成4個片段，若用BamHⅠ切割該DNA分子會生成2個片段，說明該DNA分子為環狀結構；若用兩種酶同時處理該DNA分子，則會生成4個片段。(3)在基因工程中，與使用一種限制酶相比，若同時使用2種同尾酶進行切割，則切割后的DNA片段連接后，原來的酶切位點將不存在，不能被原來的限制酶所識別，從而一定程度上防止重組質粒再次被切割。
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
(教師用書獨具)
1．(2024·廣東珠海期末)科學家把兔子的血紅蛋白基因導入大腸桿菌細胞中，在大腸桿菌細胞中合成了兔子的血紅蛋白。下列關于該技術的理論依據，不正確的是(　　)
A．兔子與大腸桿菌共用一套遺傳密碼
B．兔子的血紅蛋白基因能控制蛋白質的合成
C．兔子與大腸桿菌都遵循相同的堿基互補配對原則
D．兔子與大腸桿菌有共同的原始祖先
√
D　[根據題干信息“把兔子的血紅蛋白基因導入大腸桿菌中，在大腸桿菌細胞中合成了兔子的血紅蛋白”可知，說明兔子和大腸桿菌共用一套密碼子，兔子的血紅蛋白基因能控制蛋白質的合成，A、B正確；兔子與大腸桿菌都具有細胞結構，細胞內含有DNA和RNA，都以DNA作為遺傳物質，故二者都遵循相同的堿基互補配對原則，C正確；把兔子血紅蛋白基因導入大腸桿菌細胞中進行表達利用了重組DNA技術，生物之間是否有共同的原始祖先與重組DNA技術之間沒有必然關系，D錯誤。]
2．(2024·廣東實驗中學期中)現有一長度為3 000堿基對(bp)的線性 DNA 分子，用限制酶酶切后進行凝膠電泳，使產物分開。用酶 H 單獨酶切、用酶 B 單獨酶切、用酶 H 和酶 B 同時酶切，結果如圖(灰色條帶表示產物，不同分子量的 DNA 片段位于不同條帶)。下列相關敘述正確的是
(　　)
A．酶B和酶H沒有相同的識別位點和切割位點
B．酶H有2個識別位點和切割位點
C．酶B有3個識別位點和切割位點
D．酶B和酶H同時酶切時，得到3個DNA片段
√
A　[由題分析可知，酶H單獨酶切出現2 000 kb和1 000 kb 2個片段，說明DNA分子上有一個酶切位點，酶B單獨酶切出現2 000 kb、600 kb、400 kb 3個片段，說明DNA分子上有2個酶切位點，而用酶 B 和酶 H 同時酶切時，得到 4 個 DNA 片段，分別是1個1 400 kb片段、2個600 kb片段、1個400 kb片段，說明有3個識別位點和切割位點，因此酶B和酶H沒有相同的識別位點和切割位點，A正確，B、C、D錯誤。]
3．(2024·遼寧部分學校模擬)為了提高構建基因表達載體的效率，通常會運用兩種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA片段，圖1、圖2表示含有目的基因的DNA片段和質粒上限制酶的識別位點，表中為各種限制酶的識別序列和切割位點。同尾酶是指它們切割不同的DNA片段但產生相同的黏性末端的一類限制酶。下列敘述錯誤的是(　　)
限制酶種類 BamHⅠ BclⅠ HindⅢ EcoRⅠ
識別序列及 切割位點 ↓　　　 GGATCC ↓　 　 TGATCA ↓　 　 AAGCTT ↓　 　
GAATTC
A．對于含有目的基因的DNA 片段最好用BamHⅠ和Hind Ⅲ進行切割以獲取目的基因
B．BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，二者的切割位點不同
C．圖中啟動子的作用是作為DNA 聚合酶識別和結合部位
D．將該重組質粒導入動物細胞常用顯微注射法
√
C　[由圖1可知，目的基因的內部有BclⅠ和EcoRⅠ這兩種限制酶的切割位點，對于含有目的基因的DNA 片段最好用BamHⅠ和HindⅢ進行切割以獲取目的基因，A正確；由表格可知，BamHⅠ和BclⅠ切割形成的黏性末端相同，BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，二者的切割位點不同，BamHⅠ識別的序列為-GGATCC-，切割位點在GG之間，BclⅠ識別序列為TGATCA-，切割位點在TG之間，B正確；啟動子的作用是作為RNA 聚合酶識別和結合部位，是轉錄的起點，C錯誤；將重組質粒導入動物細胞常用的方法為顯微注射法，D正確。]
4．(2024·甘肅白銀階段練習)下列有關“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是(　　)
A．選用菜花、大蒜等植物材料提取DNA時，應該先用蛋白酶溶解細胞壁
B．在不同濃度的NaCl溶液中反復溶解析出DNA，能夠提高DNA的純度
C．新鮮的豬血是良好的DNA提取材料，經過蒸餾水處理后其中的血細胞破裂
D．用冷卻的酒精溶液可溶解蛋白質并析出DNA，DNA與二苯胺試劑經沸水浴后呈紫色
√
B　[選用菜花、大蒜等植物材料提取DNA時，應該先用洗滌劑溶解細胞膜，A錯誤；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，因此在不同濃度的NaCl溶液中反復溶解析出DNA，能夠去除雜質，提高DNA的純度，B正確；DNA主要分布在細胞核中，新鮮的豬血中的成熟紅細胞無細胞核和其他的細胞器，因此新鮮的豬血不能作為提取DNA的材料，C錯誤；用冷卻的酒精溶液可溶解蛋白質并析出DNA，再用2 mol/L的NaCl溶液將DNA溶解后，加入二苯胺試劑經沸水浴冷卻后呈藍色，D錯誤。]
謝 謝 ！第55講　重組DNA技術的基本工具
　1．闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。　2．實驗：DNA的粗提取與鑒定。
考點1　重組DNA技術的基本工具
一、基因工程的概念
二、基因工程的誕生和發展
1．肺炎鏈球菌轉化實驗不僅證明了遺傳物質是DNA，還證明了DNA可在同種生物不同個體之間____________。
2．DNA雙螺旋結構的提出和____________的證明。
3．中心法則的確立。
4．____________的破譯。
5．基因轉移載體的發現。____________________________________的發現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創造了條件。
6．__________體外重組的實現。
7．重組DNA表達實驗的成功。
8．DNA測序和合成技術的發明。
9．__________技術的發明。
10．____________技術可以實現對特定基因的定點插入、敲除或替換。
三、重組DNA技術的基本工具
1．限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)
1．(人教版選擇性必修3 P71旁欄思考)存在于原核生物中的限制酶的作用是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
2．(人教版選擇性必修3 P71正文)用兩種不同的限制酶切割目的基因的優點是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
2．DNA連接酶
3．載體
3．(人教版選擇性必修3 P72旁欄思考)DNA連接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要區別在于_____________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
4．(人教版選擇性必修3 P73正文)實踐中常用某些病毒載體作為基因工程工具，除具備普通“質粒載體”的條件外，還應具有的條件是_____________________
____________________________________________________________________。
[深化拓展]
限制酶的選擇要求
1．位置要求：限制酶的酶切位點不能位于啟動子、終止子、復制原點、標記基因當中，所選酶切位點應位于啟動子和終止子之間，若載體有多個標記基因，并非都不能破壞，要至少保留一個，用于重組DNA的鑒定和篩選。另外，目的基因上如果有該酶的酶切位點，不能選擇。
2．酶切要求
(1)單酶切：為使目的基因與載體形成的DNA片段末端能夠連接，通常使用同一種限制酶將兩者切割(如下圖，選用XhoⅠ)，但單酶切會出現目的基因與質粒的自身環化和隨意連接，還可造成目的基因的多拷貝插入。
(2)雙酶切：雙酶切可以確保目的基因的正確插入，要求兩個酶切位點位于目的基因的兩側，如下圖可選擇PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位點個數和相對位置，如：不能選擇XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切。另外，不同的限制酶所產生的末端相同，兩端也可連接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后產生的末端相同，可選擇XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切質粒。
3．數量要求：如果所選限制酶的切割位點不止一個，如選擇SmaⅠ進行酶切，則切割重組后會丟失復制原點，那么載體進入受體細胞后不能自主復制，所選限制酶在載體上最好只有一個酶切位點。
4．特殊要求：例如根據Ti質粒的T-DNA片段選擇限制酶，假設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ，則甲、乙、丁質粒均不宜選取，丙質粒宜選取。
1．基因工程的原理是基因重組，此變異是不定向的。 (　　)
2．DNA連接酶“縫合”目的基因與載體之間的氫鍵。 (　　)
3．限制性內切核酸酶EcoRⅠ識別并切割雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對)約為
4 000。 (　　)
4．大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。 (　　)
5．作載體的質粒都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。 (　　)
我國科學家將藍細菌ictB蛋白(能高效轉運和濃縮CO2)的基因(ictB基因)與水稻葉綠體基因組中PSbA基因的啟動子(葉片特異性表達)連接成重組DNA，然后將重組DNA與Ti質粒構建成表達載體，再導入水稻葉肉細胞的葉綠體中，最終成功獲得了轉ictB基因水稻，提高了水稻的產量。在ictB基因表達載體的構建中，含PSbA啟動子和ictB基因的重組DNA分子和Ti質粒的酶切位點如圖所示。
(1)為使重組DNA分子能定向插入Ti質粒的相應區段中，可在重組DNA分子兩端添加限制酶識別序列，據圖可知，M端、N端添加的限制酶識別序列分別是　　　　　　　　。
(2)經過酶切的重組DNA分子和 Ti質粒進行連接時，選用　　　　　　　　(填“E.coli DNA連接酶”或“T4 DNA連接酶”)連接效率較高。
(3)在ictB基因表達載體的構建中不宜選用Ti質粒作為載體，原因是　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
基因工程工具酶的應用
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P73思考·討論)某小組通過PCR(假設引物長度為8個堿基短于實際長度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切(下圖)，再用所得片段成功構建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是(　　)
A．其中一個引物序列為5′-TGCGCAGT-3′
B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步驟①的酶對載體進行酶切，至少獲得了2個片段
D．酶切片段和載體連接時，可使用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P75拓展應用T2)含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)的質粒、含有目的基因的DNA片段及相關限制酶酶切位點如圖所示。在構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中的實踐中，某同學選用EcoRⅠ和MfeⅠ分別對質粒和含目的基因的DNA片段進行雙酶切。下列對這種操作的優點的敘述，正確的是(　　)
A．可以避免質粒或者目的基因自身環化
B．可以避免目的基因與質粒反向連接
C．可以避免一個質粒中連續接入多個目的基因
D．可以避免受體菌的EcoRⅠ和MfeⅠ將重組質粒中的目的基因切割下來
基因工程載體的應用
3．(鏈接人教版選擇性必修3 P72圖3-4、正文)如圖為外源DNA、大腸桿菌及質粒載體的結構模式圖，據圖回答下列問題：
(1)a代表的物質和質粒的化學本質相同，都是________________(寫中文名稱)，________________________________________，構成人類的胰島素基因和質粒的基本骨架。
(2)將人的胰島素基因導入質粒構建基因表達載體時，所需的酶是____________________________________；基因表達載體應具有的基本條件有______________________________(答2點)。
(3)氨芐青霉素抗性基因在質粒DNA上被稱為____________，其作用是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)將剪切后的人胰島素基因和剪切后的質粒混合進行連接反應，得到重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌時，大腸桿菌應先用________處理，使其能吸收周圍的DNA。
考點2　DNA的粗提取與鑒定
一、實驗原理
二、實驗步驟
1．本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)。可選用雞血細胞作材料。
2．加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。
3．二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。
4．提取植物細胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
5．在DNA進一步提純時，選用冷卻的體積分數為95%的酒精溶液的作用是溶解雜質和析出DNA。
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P75圖示信息)現用新鮮的加入抗凝劑的雞血來進行DNA的粗提取和鑒定實驗，其過程如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)
A．在實驗材料的選擇上，雞血細胞比菜花細胞更容易吸水漲破
B．圖①和圖③中均用到了攪拌，但攪拌的力度和速度均不同
C．圖③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精的原理粗提取DNA
D．圖④甲試管中加入的是清水和二苯胺試劑，沸水浴后不會出現顏色變化
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P74－75探究·實踐)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是(　　)
A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質
B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等
C．沉淀：可反復多次以提高DNA的純度
D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現藍色
1．(2024·湖南卷)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發現DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是(　　)
A．限制酶失活，更換新的限制酶
B．酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等
C．質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，需更換正常質粒DNA
D．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶
2．(2023·全國新課標卷)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質粒進行切割、連接，以構建基因表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。
　
下列基因表達載體構建方案合理且效率最高的是(　　)
A．質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA連接酶連接
B．質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA連接酶連接
C．質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA連接酶連接
D．質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA連接酶連接
3．(2024·安徽卷)下列關于“DNA 粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是(　　)
A．實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低
B．利用DNA和蛋白質在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA
C．DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物
D．將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應，可檢測溶液中是否含有蛋白質雜質
[夯實必備知識]自主診斷
考點1
一、DNA分子　轉基因　遺傳特性　生物類型　基因重組
二、1．轉移　2．半保留復制　4．遺傳密碼　5．限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶　6．DNA　9．PCR　10．基因組編輯
三、1．原核生物　特定核苷酸序列　磷酸二酯鍵　黏性末端　2．磷酸二酯鍵　大腸桿菌　黏性末端和平末端　3．噬菌體　一個至多個　自我復制　受體DNA　標記
[落實實驗基礎]自主診斷
考點2
一、酒精　2 mol/L　藍色
二、白色絲狀物　二苯胺
第55講　重組DNA技術的基本工具
考點1
教材隱性知識
1．提示：切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原體的危害
2．提示：防止質粒和目的基因的自我環化及質粒和目的基因的反向連接
3．提示：DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是將單個的脫氧核苷酸連接到脫氧核苷酸鏈上
4．提示：對靶細胞具有較高的轉化效率；不能增殖，對細胞無害
澄清概念
1．×提示：此變異是定向的。
2．×提示：DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。
3．√　4．√　5．√
達成學科素養
提示：(1)BglⅠ、EcoRⅤ
(2)T4 DNA連接酶
(3)質粒大，難以進行插入外源基因的構建，以及酶切位點受限
評價遷移應用
1．B　[由于引物只能引導子鏈從5′到3′，根據堿基互補配對原則，其中一個引物序列為5′ TGCGCAGT 3′，A正確；根據三種酶的酶切位點，左側的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右邊的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B錯誤；用步驟①的酶對載體進行酶切，使用了NheⅠ和CfoⅠ進行切割，根據他們的識別位點以及原本DNA的序列，切割之后至少獲得了2個片段，C正確；E．coli DNA連接酶和T4 DNA連接酶可以連接DNA片段的黏性末端，D正確。]
2．D　[兩種限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免質粒或者目的基因自身環化，也不能避免目的基因與質粒反向連接，A、B錯誤；兩種限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免一個質粒中連續接入多個目的基因，C錯誤；若質粒EcoRⅠ酶切位點處與目的基因MfeⅠ酶切處連接，質粒MfeⅠ酶切位點處與目的基因EcoRⅠ酶切位點處連接，則正好將目的基因正向連接，這樣的重組質粒，既無EcoRⅠ識別位點，又無MfeⅠ識別位點，相當于將基因“焊死”在質粒上，故可以避免受體菌的EcoRⅠ和MfeⅠ將重組質粒中的目的基因切割下來，D正確。]
3．(1)脫氧核糖核酸　磷酸和脫氧核糖交替連接，排列在外側　(2)限制性內切核酸酶和DNA連接酶　能自我復制、具有標記基因、具有啟動子和終止子等　(3)標記基因　用于鑒定目的基因(或重組質粒)是否導入受體細胞　(4)Ca2+
考點2
評價遷移應用
1．D　[動物細胞沒有細胞壁，因此雞血細胞相對于菜花細胞更容易吸水漲破，A正確；圖①攪拌的目的是加速吸水后的細胞破碎，因此力度和速度較大，圖③攪拌的目的是使析出的DNA纏繞在玻璃棒上，攪拌時力度小、速度緩，B正確；DNA不溶于酒精，細胞中的某些蛋白質可以溶于酒精，利用這一原理可以將蛋白質和DNA進一步分離，C正確；圖④甲試管中加入的是2 mol/L NaCl溶液和二苯胺試劑，沸水浴后不會出現顏色變化，D錯誤。]
2．D　[裂解是加蒸餾水讓細胞吸水漲破，釋放出DNA等物質，A正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質等與DNA分離，B正確；DNA不溶于酒精，而某些蛋白質溶于酒精，可以反復多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA純度，C正確；將DNA溶于2 mol/L的NaCl溶液，加入二苯胺試劑，混合均勻后，沸水中加熱五分鐘，待冷卻后，能呈現藍色，D錯誤。]
體驗真題
1．B　[限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，A正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，此時應有部分DNA被酶切，B錯誤；質粒DNA突變會導致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應更換為正常質粒，C正確；質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。]
2．C　[酶3切割后得到的是平末端，E．coli DNA連接酶連接平末端的效率要遠遠低于T4 DNA連接酶，應該用T4 DNA連接酶連接，A不符合題意；質粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質粒上的連接方向，此基因表達載體的構建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質粒和目的基因，會破壞質粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續的篩選，D不符合題意。]
3．D　[研磨液有利于DNA的溶解，換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低，A正確；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，可初步分離DNA，B正確；DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl濃度的變化而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對DNA進行粗提取，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺試劑會被染成藍色，二苯胺試劑用于鑒定DNA，無法檢測蛋白質，D錯誤。]
10 / 10課時數智作業(五十五)　重組DNA技術的基本工具
1．(2024·廣東實驗中學期中)在基因工程的操作中，需要三種工具，分別是“分子手術刀”“分子縫合針”和“分子運輸車”，下列關于這三種工具的敘述，不正確的是(　　)
A．“分子手術刀”指的是限制性內切核酸酶，可以斷開 DNA 的磷酸二酯鍵
B．“分子縫合針”指的是 DNA 聚合酶，可以催化生成斷裂的磷酸二酯鍵
C．“分子運輸車”指的是載體，常用的載體有質粒、動植物病毒和噬菌體等
D．“分子手術刀”主要來自原核生物，它一般不會切割該生物自己的 DNA
2．(2024·廣東肇慶期中)限制酶MunⅠ和限制酶 EcoRⅠ的識別序列及其切割位點分別為—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如圖表示某一目的基因片段與質粒拼接形成重組質粒的過程，下列敘述錯誤的是(　　)
A．用限制酶 EcoRⅠ切割目的基因，同時用限制酶 MunⅠ切割質粒
B．構建重組質粒時，會形成不止一種脫氧核苷酸序列(考慮DNA片段兩兩連接)
C．將重組質粒同時用以上2種限制酶切割則會再形成1種長度的 DNA 片段
D．標記基因一般是抗生素基因或熒光標記基因，便于目的基因的篩選
3．(2024·四川成都列五中學月考)研究人員欲將某動物體內基因X導入大腸桿菌的質粒中保存，質粒含有抗性基因與酶切位點，目的基因兩端酶切位點如下圖所示，下列敘述錯誤的是(　　)
A．使用Hind Ⅲ和XbaⅠ進行酶切能避免基因X與質粒反向連接
B．目的基因X與質粒連接可使用E.coli DNA連接酶
C．Ca2+處理大腸桿菌能降低細胞膜通透性，有利于重組質粒導入受體細胞
D．含有基因X的大腸桿菌能在氨芐青霉素選擇培養基中生長
4．(2024·廣東佛山期中)“DNA的粗提取與鑒定”的實驗步驟是：研磨→去雜質→析出→鑒定；某研究小組欲探究不同的去雜質方法對實驗結果的影響，實驗結果如表所示。下列敘述錯誤的是(　　)
去雜質 方式 沉淀質 量(g) DNA濃度 (ng/μL) OD260/OD280 二苯胺 鑒定
離心 0.068 81.5 1.53 藍色
4 ℃冰 箱靜置 0.1028 336.4 1.41
注：OD260與OD280的比值可檢查DNA純度。純DNA的OD260/OD280為1.8，當存在蛋白質污染時，這一比值會明顯降低。
A．豬肝和菜花均可作為提取DNA的材料
B．對研磨液進行離心是為了加速DNA的沉淀
C．離心法可以獲得更高純度的DNA
D．離心或沉淀后應取上清液進一步提取DNA
5．(2024·湖北武漢期末)某植物的野生型和突變型植株雜交，F1均為野生型，F1自交所得F2中絕大部分植株與野生型相似(包括野生型、介于野生型與突變型之間的“過渡類型”)，以＋表示，少部分植株與突變型相似，以P表示。研究發現，兩表型相關基因的堿基序列一致，長度均為2.4 kb，將此片段用限制酶PstⅠ完全酶切結果如下圖。下列敘述錯誤的是(　　)
A．據題意推測，限制酶PstⅠ可能對甲基化敏感
B．2.2 kb和0.9 kb條帶是“過渡類型”的酶切產物
C．圖2中P的①②位點可能均發生了甲基化
D．該植株的表觀遺傳現象是可以穩定遺傳的
6．(2023·湖北卷)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(　　)
A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否
D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養基中能形成菌落
7．(2024·廣東佛山三模)圖1表示基因工程中用到的質粒，其中PstⅠ是目的基因插入位點，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，TetR表示四環素抗性基因。圖2表示篩選出導入重組質粒的受體菌的方法(四環素和氨芐青霉素在高溫下不穩定易失效)。下列說法正確的是(　　)
A．構建重組DNA分子用到的工具酶有限制酶和質粒
B．圖2所用培養基應加入抗生素并調好pH后再滅菌處理
C．圖2中利用絨布接種的方法為稀釋涂布平板法
D．原板上的甲、乙菌落中，甲菌落是成功導入重組質粒的受體菌
8．(14分)(2024·廣東湛江期末)限制酶是基因工程的基本工具之一。同尾酶指來源各異，識別的靶序列也不相同，但產生相同的黏性末端的限制酶，在基因工程中應用較為廣泛。幾種常見的限制酶的切割位點如表所示。回答下列問題：
限制酶 BamHⅠ SalⅠ BglⅡ XhoⅠ
識別 序列 及切 割位 點
(1)表中兩組同尾酶分別是__________________和__________________。表中限制酶切割出的為黏性末端，若限制酶切割出的為平末端，則用________________(填“E.coli DNA連接酶”“T4 DNA連接酶”或“E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶”)效率更高。
(2)某限制酶的識別序列及切割位點為↓GATC，某DNA分子上有4個該限制酶的識別位點，用該限制酶切割該DNA分子，會生成4個片段。若用BamHⅠ切割該DNA分子會生成2個片段，則該DNA分子為________(填“環”或“鏈”)狀結構。若用2種酶同時處理該DNA分子，則會生成______個片段。
(3)限制酶的切割位點是____________(填化學鍵名稱)。在基因工程中，與使用一種限制酶相比，同時使用2種同尾酶進行切割的優點有________________________________(寫出1個)。
課時數智作業(五十五)
1．B　[“分子手術刀”是限制性內切核酸酶(限制酶)，能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點切割使磷酸二酯鍵斷裂，A正確；“分子縫合針”是DNA連接酶，能將具有相同末端的DNA片段連接起來，B錯誤；基因工程中的“分子運輸車”即載體，有質粒、動植物病毒、噬菌體等，其中質粒是基因工程中最常用的載體，C正確；“分子手術刀”主要來自原核生物，它一般不會切割該生物自己的DNA，可能是該生物不含有該序列或者含有該序列，但被修飾了的，D正確。]
2．D　[由題圖可知，目的基因兩側都是限制酶EcoRⅠ的切割位點，因此應選用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子，質粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位點，但EcoRⅠ的切割位點位于標記基因中，用其切割會破壞標記基因，因此為保證重組質粒表達載體的準確構建，應選用限制酶MunⅠ切割質粒，A正確；構建重組質粒時，考慮DNA片段兩兩連接，會形成不止一種脫氧核苷酸序列，B正確；限制酶MunⅠ切割質粒后與目的基因連接形成重組質粒，連接處形成—CAATTC—和—GAATTG—的新序列，都不能被 2 種限制酶識別、切割，但EcoRⅠ能識別標記基因的相應序列并切割， 使環狀重組質粒斷裂形成1種長度的DNA片段，C正確；標記基因一般是抗生素抗性基因或熒光標記基因，便于目的基因的篩選，D錯誤。]
3．C　[分析題圖可知，使用Hind Ⅲ和XbaⅠ進行酶切會產生不同的黏性末端，故能避免基因X與質粒反向連接，A正確；目的基因X與質粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切會產生黏性末端，E．coli DNA連接酶可連接黏性末端，故目的基因X與質粒連接可使用E．coli DNA 連接酶，B正確；用Ca2+處理大腸桿菌，能提高細胞膜的通透性，使細胞處于一種能夠吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，有利于重組質粒導入受體細胞，C錯誤；分析題圖可知，重組質粒上含有氨芐青霉素抗性基因，故含有基因X的大腸桿菌能在氨芐青霉素選擇培養基中生長，D正確。]
4．B　[DNA的粗提取與鑒定的實驗中，應選擇富含DNA的材料，豬肝和菜花均可作為提取DNA的材料，A正確；離心研磨液的目的是加速沉淀，離心能夠加速細胞膜、細胞器、一些較大雜質的沉淀，離心法可以獲得更高純度的DNA，B錯誤，C正確；離心或沉淀后應取上清液進一步提取DNA，D正確。]
5．D　[據題意可知，突變型與野生型基因長度相同，突變型基因序列不能被限制酶PstⅠ酶切，由此推測，限制酶PstⅠ可能對甲基化敏感，A正確；據題圖可知，野生型基因序列酶切產物是1.5 kb和0.7 kb，因此2.2 kb和0.9 kb條帶是“過渡類型”的酶切產物，B正確；突變型基因序列不能夠被限制酶PstⅠ酶切，圖2中P的①②位點可能均發生了甲基化，C正確；根據題意無法判斷該植株的表觀遺傳現象是否可以穩定遺傳的，D錯誤。]
6．D　[若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉錄的產物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，重組質粒和質粒中都有四環素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質粒的大小與質粒不同，能夠鑒定重組質粒構建成功與否，C正確；SphⅠ的酶切位點位于四環素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，會破壞四環素抗性基因，重組質粒中只含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養基中能形成菌落，在含Tet的培養基中不能形成菌落，D錯誤。]
7．D　[構建重組DNA分子用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶，質粒為載體，A錯誤；由于四環素和氨芐青霉素在高溫下不穩定易失效，因此應在滅菌后再加入抗生素，B錯誤；圖2中利用絨布接種的方法為影印法，不改變菌落的位置，C錯誤；原板上的甲、乙菌落中，甲菌落在含四環素的培養基上能生存，在含氨芐青霉素的培養基上不能生存，說明甲菌落中質粒的氨芐青霉素抗性基因被破壞，說明其是成功導入重組質粒的受體菌，D正確。]
8．(每空2分，共14分)(1)BamHⅠ、BglⅡ　SalⅠ、XhoⅠ　T4 DNA連接酶　(2)環　4　(3)磷酸二酯鍵　一定程度上防止重組質粒再次被切割
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