資源簡介

(共112張PPT)
第51講　微生物的培養技術及應用
選擇性必修3　生物技術與工程
第九單元　生物技術與工程
1．闡明在發酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養物的前提。　
2．闡明無菌技術是在操作過程中，保持無菌物品與無菌區域不被微生物污染的技術。　
3．舉例說明通過調整培養基的配方可有目的地培養某種微生物。　
4．概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實驗室中進行微生物分離和純化的常用方法。　
5．概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法是測定微生物數量的常用方法。
一、培養基的配制
1．概念：人們按照微生物對________的不同需求，配制出供其________的營養基質。
2．種類
(1)按物理性質分—
考點1　微生物的基本培養技術
營養物質
生長繁殖
(2)按用途分—
3．營養組成
(1)營養組成：水、無機鹽、碳源、____。
(2)需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及O2的需求。
微生物 對培養基的需求
乳酸桿菌 添加______
霉菌 一般將培養基調至__性
細菌 一般將培養基調至__________性
厭氧微生物 提供____的條件
氮源
維生素
酸
中性或弱堿
無氧
(3)幾種微生物的營養和能量來源
微生物 碳源 氮源 能源
藍細菌 ___ NH4＋、NO3－等 光能
硝化 細菌 ___ NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖類等有機物 __ 有機物
酵母菌 糖類、蛋白質等有機物 蛋白質等 有機物
CO2
CO2
N2
1．(人教版選擇性必修3 P10旁欄思考)培養基中加入氮源的作用是___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：培養基中的氮元素是微生物合成蛋白質、核酸等物質所必需的
二、無菌技術
1．概念：在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。
2．關鍵：____________。
3．目的：______________________。
防止雜菌污染
獲得純凈的微生物培養物
4．消毒與滅菌的比較
比較項目 條件 結果 常用方法 應用范圍
消毒 較為溫和的__________或生物等方法 殺死物體表面或內部一部分微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高溫的液體
化學藥物消毒法 操作空間、操作者的衣物和手等
紫外線消毒法　 接種室、接種箱或超凈工作臺
物理、化學
比較項目 條件 結果 常用方法 應用范圍
滅菌 強烈的理化方法 殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子 濕熱滅菌法 培養基、容器等
干熱滅菌法　 玻璃器皿、金屬用具等
灼燒滅菌法　 接種工具等
5．其他操作
(1)做好消毒和滅菌工作后，要注意避免已經滅菌處理的材料用具與__________接觸。
(2)為了避免周圍環境中微生物的污染，接下來的許多操作都應在超凈工作臺上并在__________附近進行。
周圍的物品
酒精燈火焰
2．(人教版選擇性必修3 P10相關信息)利用某些微生物可以凈化污水、污泥，原因是_______________________________________________
___________________________________________________________。
提示：有的微生物能夠寄生于多種細菌體內，使細菌裂解；微生物可分解污水、污泥中的有機物
6．酵母菌的純培養
高壓蒸汽滅菌
干熱滅菌
平板劃線法
倒置
未接種
28
3．(人教版選擇性必修3 P12探究·實踐)倒平板操作中，平板冷凝后，要將平板倒置，其主要原因是________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：防止冷凝后形成的水珠滴落在培養基上，防止培養基水分過快蒸發
1．培養乳酸桿菌時，需要在培養基中添加維生素。 (　　)
2．某同學想從泡菜汁中篩選耐高鹽乳酸菌，進行了如下實驗：取泡菜汁樣品，劃線接種于一定NaCl濃度梯度的培養基，經培養得到了單菌落。培養基pH需偏堿性。 (　　)
提示：乳酸菌經過無氧呼吸產生乳酸，故其生活的環境是酸性，培養基pH需偏酸性。
×
√
3．為防止蛋白質變性，不能用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌。 (　　)
提示：一般用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌。
4．玻璃器皿、金屬用具等可采用干熱滅菌法。 (　　)
×
√
微生物的分離和培養是現代生物工程應用中的重要環節。如圖甲、乙是大腸桿菌分離和培養過程中部分操作和實驗結果示意圖。
(1)培養大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養基是否被污染，對于固體培養基應采用的檢測方法是什么？
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：將未接種的培養基在適宜的條件下培養一段時間，觀察培養基上是否有菌落產生
(2)指出圖甲所示的操作中較明顯的一處錯誤是什么？在第二次劃線前灼燒接種環，目的是什么？
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：最后一次(第四次)劃線與第一次劃線區域重疊。殺死上次劃線后接種環上可能殘余的菌種，保證下一次劃線時的菌種直接來源于上一次劃線的末端
(3)圖乙是平板劃線法接種操作示意圖，正確的操作順序是__________________________(用字母和箭頭表示)；找出圖乙中一處錯誤的操作：__________(用字母表示)。
提示：A→B→G→F→E→C→D→H　C
考向1　培養基的配制及無菌技術
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P9－10正文)下表為某培養基的配方，下列有關敘述正確的是(　　)
成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4 伊紅 美藍 蒸餾水
含量 10 g 10 g 2 g 0.4 g 0.065 g 1 000 mL
A．從物理性質看該培養基屬于液體培養基，從用途看該培養基屬于選擇培養基
B．培養基中屬于碳源的物質主要是葡萄糖，屬于氮源的物質是蛋白胨
C．該培養基所培養微生物的同化作用類型是自養型
D．該培養基調節合適的pH后就可以用于接種菌種
√
B　[從物理性質看該培養基不含凝固劑，屬于液體培養基，從用途看該培養基含有指示劑，屬于鑒別培養基，A錯誤；培養基中屬于碳源的物質主要是葡萄糖，蛋白胨來源于動物原料，含有有機氮等營養物質，故屬于氮源的物質是蛋白胨，B正確；該培養基含有葡萄糖等有機碳源，培養的微生物屬于異養型，C錯誤；該培養基調節合適的pH后還需要進行滅菌，滅菌結束倒平板完成后，才能用于接種菌種，D錯誤。]
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P11資料卡)獲得純凈微生物培養物的關鍵是防止外來雜菌入侵。下列關于無菌操作的敘述，錯誤的是(　　)
A．超凈工作臺在使用前進行紫外線照射以殺死物體表面或空氣中的微生物
B．無菌技術還應包括避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸
C．牛奶可使用巴氏消毒法，其優點是能夠殺死全部微生物，保留牛奶風味
D．灼燒滅菌的對象可以是金屬用具和玻璃器皿，在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒
√
C　[接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前，可用紫外線照射30 min，以殺死物體表面或空氣中的微生物，A正確；無菌技術應圍繞著如何避免雜菌的污染展開，還應包括避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸，B正確；牛奶可使用巴氏消毒法，其優點是能夠殺死牛奶中的絕大多數微生物，并且基本不會破壞牛奶的營養成分，C錯誤；灼燒滅菌的對象可以是金屬用具和玻璃器皿，在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，D正確。]
考向2　微生物的純培養
3．(鏈接人教版選擇性必修3 P12探究·實踐)微生物平板劃線和培養的具體操作如圖所示，下列操作正確的是(　　)
A．①②⑤⑥　　　　　 B．③④⑥⑦
C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
√
D　[由圖可知，②中拔出棉塞后應握住棉塞上部；⑥中劃線時不能將培養皿的皿蓋完全拿開，應只打開一條縫隙；⑦中劃線時第5次的劃線不能與第1次的劃線相連；⑧中平板應倒置培養。①③④⑤正確，故選D。]
題后悟道　平板劃線操作中幾次灼燒接種環的目的
項目 第一次劃線前灼燒 每次劃線前灼燒 劃線結束后灼燒
目的 避免接種環上可能存在的微生物污染培養物 殺死上一次劃線結束后接種環上殘留的菌種，使每次劃線的菌種均來自上一次劃線的末端 殺死接種環上殘留的菌種，避免菌種污染環境和感染操作者
4．(鏈接人教版選擇性必修3 P12探究·實踐)為純化菌種，在鑒別培養基上劃線接種尿素分解菌，培養結果如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．倒平板后要間歇晃動培養皿，以保證培養基表面平整
B．培養皿中Ⅰ區的細菌數量較多，一般從Ⅱ區挑取單菌落
C．該實驗結果存在單菌落，因此可達到菌種純化的目的
D．培養基的pH可調至近酸性，其中尿素為唯一的氮源物質
√
C　[倒平板后無須間歇晃動培養皿，A錯誤；培養皿中Ⅰ、Ⅱ區的細菌數量較多，一般從Ⅲ區挑取單菌落，B錯誤；該實驗Ⅲ區有單菌落，挑取培養后可達到菌種純化的目的，C正確；細菌培養基的pH應調至中性或弱堿性，其中尿素為唯一的氮源物質，可用于篩選尿素分解菌，D錯誤。]
一、選擇培養基
考點2　微生物的選擇培養和計數
抑制或阻止
NH3
尿素
二、微生物的選擇培養
1．土壤取樣
鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。
2．等比稀釋
將10 g土樣加入盛有____ mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1 mL上清液加入盛有9 mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
90
3．涂布平板
0.1
酒精
冷卻
4．培養觀察
(1)待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入______ ℃的恒溫培養箱中培養1～2 d。
(2)在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的______。
30～37
單菌落
1．(人教版選擇性必修3 P18探究·實踐)統計菌落種類和數目時要每隔24 h觀察統計一次，直到各類菌落數目穩定。若培養時間不足或培養時間太長，分別會導致的結果是________________________、
___________________________________________________________。
提示：遺漏菌落的種類和數目　菌落粘連影響計數、培養基表面干燥脫水、微生物衰敗，菌落特征不易觀察
三、微生物的數量測定
1．稀釋涂布平板法
(1)計數原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的______，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
(2)計數標準：為了保證結果準確，一般選擇菌落數為_______的平板進行計數。
菌落數
30～300
(3)計數方法：通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，以保證獲得菌落數為_______、適于計數的平板。在__________下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出______。
(4)當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，統計結果一般用______表示。
30～300
同一稀釋度
平均值
菌落數
2．顯微鏡直接計數法
(1)計數原理：利用特定的__________或____________，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。
(2)統計結果：一般是____數和____數的總和。
(3)優點：是一種常用的、快速直觀的測定微生物數量的方法。
細菌計數板
血細胞計數板
活菌
死菌
2．(人教版選擇性必修3 P18相關信息)血細胞計數板常用于____________的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數；細菌計數板常用于____________的細菌等的計數。
提示：相對較大　相對較小
四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
脲酶
尿素
中性
菌落數目穩定時
1．選擇培養基四種常見制備方法或實例
(1)加入某些特定的物質(前提是培養基具備全部營養成分)
[深化拓展]
(2)改變培養基的營養成分
(3)利用培養基“特定化學成分”分離
(4)通過某些“特殊環境”分離
2．兩種純化細菌的方法的比較
項目 平板劃線法 稀釋涂布平板法
純化原理 通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面 將菌液進行一系列的梯度稀釋，稀釋度足夠高時，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞
主要步驟 平板劃線操作 系列稀釋操作和涂布平板操作
接種工具 接種環 涂布器
平板示意圖
能否用于計數 不能計數 可以計數，但操作復雜，需涂布多個平板
共同點 都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征
1．選擇培養基可以鑒定某種微生物的種類。 (　　)
提示：選擇培養基可以篩選分離出某種微生物。
2．血細胞計數板既可用于酵母菌的數量測定，也可用于細菌的數量測定。 (　　)
提示：血細胞計數板適用于真菌的計數，細菌計數板用于細菌的數量測定等。
×
×
3．若從植物根際土壤中篩選分解淀粉的固氮細菌，培養基的主要營養物質包括水和無機鹽、淀粉。 (　　)
4．某同學進行分離高產脲酶菌的實驗設計時，認為可分解酚紅指示劑使其褪色的菌株是產脲酶菌。 (　　)
提示：產脲酶菌不能分解酚紅指示劑。
×
√
5．為探究校內植物園土壤中的細菌種類，某興趣小組采集園內土壤樣本并開展相關實驗。土壤溶液稀釋倍數越低，越容易得到單菌落。 (　　)
提示：土壤溶液稀釋倍數足夠高時，才能將聚集的細菌分散開，有助于在培養基表面形成單菌落。
×
為了分離和純化高效分解石油的細菌，科研人員利用被石油污染過的土壤進行下圖A所示的實驗。
(1)步驟③與步驟②中培養基成分的最大區別是__________________
__________________________________________________________。
提示：③的培養基中石油是唯一碳源
(2)同學甲進行步驟④的操作，其中一個平板經培養后的菌落分布如圖B所示，推測同學甲用此方法接種時出現圖B結果可能的操作失誤是______________________。
提示：接種時涂布不均勻
(3)在進行實驗時，甲同學從對應106倍稀釋的培養基中篩選出大約200個菌落，但是其他同學在同樣稀釋度下只篩選出大約90個菌落，若甲同學的結果有問題，則可能的原因是什么？(答出一項即可)
___________________________________________________________。
提示：培養基被雜菌污染
(4)步驟⑤后取樣測定石油含量的目的是___________________________________________________________________________________。
提示：篩選出分解石油能力最好的細菌
考向1　微生物的選擇培養
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P16思考·討論)某科研小組欲從土壤中篩選能分解除草劑A(組成元素為C、H、O、N，在水中溶解度低，含除草劑A的固體培養基不透明)的細菌用于生產，實驗流程如下圖所示。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．從經常使用除草劑A的土壤取樣比從其他土壤取樣更容易篩選到除草劑A分解菌
B．培養基1為固體培養基，此操作的主要目的是增加除草劑A分解菌的數量
C．培養基2為選擇培養基，其中以除草劑A作為唯一氮源便于分離除草劑A分解菌
D．挑選菌落時，透明圈直徑與菌落直徑比值越大，表明細菌分解除草劑A的能力越強
√
B　[要想獲得目的菌，應在富含該菌種的自然環境中篩選，故從經常使用除草劑A的土壤取樣比從其他土壤取樣更容易篩選到除草劑A分解菌，A正確；為擴大培養，實驗中培養基1為液體培養基，其目的是增加目的菌(除草劑A分解菌)的數量，起到篩選作用，B錯誤；根據題干信息可知，某科研小組從土壤中篩選出能夠將除草劑A分解的菌株，則應以除草劑A作為唯一氮源，在該培養基上只有目的菌能夠生存，其他雜菌因為缺少氮源不能生存，C正確；挑選菌落時，透明圈直徑與菌落直徑比值越大，表明細菌分解除草劑A的能力越強，D正確。]
考向2　微生物的分離和計數
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P17圖1-7)尿素是一種重要的農業肥料，尿素分解菌可合成脲酶，利用以尿素為唯一氮源的選擇培養基可從土壤中分離尿素分解菌并進行計數，科研人員取0.1 g土壤分別稀釋103～107倍，將0.1 mL不同稀釋倍數的土壤稀釋液接種在固體培養基上，在相同的培養條件下得到如下數據。下列敘述正確的是(　　)
稀釋倍數 103 104 105 106 107
菌落 數/個 1號平板 478 367 270 26 5
2號平板 496 354 268 20 8
3號平板 509 332 272 29 3
A．利用稀釋涂布平板法可將稀釋液中的菌體完全分離，一個菌落對應一個菌體
B．該實驗中稀釋倍數為105的平板菌落數在30～300內，最適合用來統計活菌數
C．以尿素為唯一氮源的培養基上長出的菌均為尿素分解菌
D．若在顯微鏡下利用細菌計數板直接計數，則統計結果一般比實際活菌數少
√
B　[利用稀釋涂布平板法不可將稀釋液中的菌體完全分離，可能會出現兩個或多個菌體連在一起的現象，A錯誤；為保證結果準確，一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數，該實驗中稀釋倍數為105的平板菌落數在30～300內，最適合用來統計活菌數，B正確；以尿素為唯一氮源的培養基上長出的不都是尿素分解菌，還有可能是自生固氮菌，C錯誤；若在顯微鏡下利用細菌計數板直接計數，不能區分活菌和死菌，則統計結果一般比實際活菌數多，D錯誤。]
3．(鏈接人教版選擇性必修3 P20拓展應用T2)剛果紅是一種染料，可以與纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發生這種反應。從落葉較多的腐質土取10 g土壤，用無菌水稀釋106倍后，取0.1 mL涂布到三個平板中(培養基配方：纖維素鈉鹽5～10 g、酵母膏1 g、土豆汁100 mL、KH2PO4 0.25 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL)培養，菌落數目穩定后加入剛果紅染色，洗去浮色后對纖維素分解菌進行分離與計數，三個平板菌落數無顯著差異，平均值為200個，出現透明圈的菌落數平均值為30。下列敘述正確的是(　　)
A．上述實驗中使用的培養基為選擇培養基
B．該培養基pH需要調為中性或者弱酸性
C．涂布的0.1 mL培養液中活菌數可能高于200個
D．10 g土樣中纖維素分解菌的數目約為3.0×108個
√
C　[要從土壤中將纖維素分解菌分離出來，應該將它們接種在以纖維素為唯一碳源的選擇培養基上，根據題述實驗中培養基的成分可知，該培養基不屬于選擇培養基，應該屬于鑒別培養基，A錯誤；該培養基pH需要調為中性或者弱堿性，用以培養細菌，B錯誤；涂布的0.1 mL培養液中活菌數可能高于200個，因為記數的菌落中可能含有由聚集在一起的兩個或兩個以上的細胞長成的菌落，C正確；三個平板菌落的平均值為200個，其中出現透明圈的菌落數平均值為30，即有30個纖維素分解菌，則10 g土樣中纖維素分解菌的數目約為30÷0.1×106×10＝3.0×109個，D錯誤。]
體驗真題　感悟高考 · 有章可循
1．(2024·海南卷)某小組為檢測1株粗糙脈孢霉突變株的氨基酸缺陷類型，在相同培養溫度和時間的條件下進行實驗，結果見表。下列有關敘述錯誤的是(　　)
組別 培養條件 實驗結果
① 基礎培養基 無法生長
② 基礎培養基＋甲、乙、丙3種氨基酸 正常生長
③ 基礎培養基＋甲、乙2種氨基酸 無法生長
A．組別①是②③④⑤的對照組
B．培養溫度和時間屬于無關變量
C．①②結果表明，甲、乙、丙3種氨基酸中有該突變株正常生長所必需的氨基酸
D．①～⑤結果表明，該突變株為氨基酸甲缺陷型
組別 培養條件 實驗結果
④ 基礎培養基＋甲、丙2種氨基酸 正常生長
⑤ 基礎培養基＋乙、丙2種氨基酸 正常生長
√
D　[由表可知：除了組別①之外，其他組別的基礎培養基中都添加了氨基酸，因此組別①是②③④⑤的對照組，A正確；由題意、表中信息可知：實驗的自變量為添加的氨基酸種類，各組別的培養溫度和時間均相同，說明培養溫度和時間均屬于無關變量，B正確；由①②結果可知：粗糙脈孢霉突變株在基礎培養基中無法生長，但在添加了甲、乙、丙3種氨基酸的基礎培養基中能正常生長，這表明甲、乙、丙3種氨基酸中有該突變株正常生長所必需的氨基酸，C正確；與組別①相比，在基礎培養基中，添加的氨基酸中含有丙氨基酸，則粗糙脈孢霉突變株都能正常生長，但在只添加甲、乙2種氨基酸的基礎培養基中無法生長，說明該突變株為氨基酸丙缺陷型，D錯誤。]
2．(2024·浙江6月卷)脲酶催化尿素水解，產生的氨可作為細菌的氮源。脲酶被去除鎳后失去活性。下列敘述錯誤的是(　　)
A．鎳是組成脲酶的重要元素
B．鎳能提高尿素水解反應的活化能
C．產脲酶細菌可在以NH4Cl為唯一氮源的培養基生長繁殖
D．以尿素為唯一氮源的培養基可用于篩選產脲酶細菌
√
B　[根據題意可知，脲酶被去除鎳后失去活性，說明鎳是組成脲酶的重要元素，A正確；脲酶催化尿素水解的機理為降低化學反應所需的活化能，B錯誤；產脲酶細菌可利用NH4Cl里的氮源進行代謝活動，因此產脲酶細菌可在以NH4Cl為唯一氮源的培養基上生長繁殖，C正確；產脲酶細菌能利用脲酶催化尿素分解產生NH3，NH3可作為細菌生長的氮源，不能產脲酶的細菌則無法分解尿素獲得氮源，因此以尿素為唯一氮源的培養基可用于篩選產脲酶細菌，D正確。]
3．(2024·全國甲卷)合理使用消毒液有助于減少傳染病的傳播。某同學比較了3款消毒液A、B、C殺滅細菌的效果，結果如圖所示。回答下列問題：
(1)該同學采用顯微鏡直接計數法和菌落計數法分別測定同一樣品的細菌數量，發現測得的細菌數量前者大于后者，其原因是________
___________________________________________________________
__________________________________________________________。
(2)該同學從100 mL細菌原液中取1 mL加入無菌水中得到10 mL稀釋菌液，再從稀釋菌液中取200 μL涂布平板，菌落計數的結果為100，據此推算細菌原液中細菌濃度為________個/mL。
前者微生物分散的活菌和死菌一起計數，后者存在多個活菌形成一個菌落的情況且只計數活菌
5 000
(3)菌落計數過程中，涂布器應先在酒精燈上灼燒，冷卻后再涂布。灼燒的目的是_______________________________________________
__________________，冷卻的目的是________________________。
(4)據圖可知殺菌效果最好的消毒液是___，判斷依據是______________________________________________________________________
(答出兩點即可)。
殺死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染
防止溫度過高殺死菌種
A
A消毒液活
細菌數減少量最多，且殺菌時間較短，效率最高
(5)鑒別培養基可用于反映消毒液殺滅大腸桿菌的效果。大腸桿菌在伊紅美藍培養基上生長的菌落呈__________色。
(紫)黑
[解析]　(1)顯微鏡直接計數法把死菌和活菌一起計數。菌落計數法計數只計活菌數，還可能存在多個活菌形成一個菌落的情況，故前者的數量多于后者。(2)從100 mL細菌原液中取1 mL加入無菌水中得到10 mL稀釋菌液，即稀釋了10倍，1 mL細菌原液中細菌濃度＝菌落數÷菌液體積×稀釋倍數＝100÷0.2×10＝5 000個/mL。(3)菌落計數過程中，涂布器應先在酒精燈上灼燒，冷卻后再涂布。灼燒的目的是殺死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷卻的目的是防止溫度過高殺死菌種。(4)A消毒液活細菌數減少量最多，且殺菌時間較短，效率最高，因此A消毒液殺菌效果最好。(5)大腸桿菌在伊紅美藍培養基上生長的菌落呈(紫)黑色。
1．(2024·廣東名校聯盟模擬)固氮微生物可將空氣中的氮氣(N2)還原為氨，并轉化為細胞中的含氮物質，是土壤中氮素的主要來源。表格是一個用于分離培養固氮微生物的培養基配方，其中甘露醇的分子式為C6H14O6，下列敘述中錯誤的是(　　)
課時數智作業(五十一)　微生物的培養技術及應用
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．甘露醇在培養基中的作用是調節滲透壓
B．固氮微生物合成的氨屬于初生代謝物
C．對該培養基先調節pH再進行濕熱滅菌
D．該培養基為選擇培養基，不含凝固劑
√
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
9
物質 名稱 C6H14O6 K2HPO4 MgSO4·7H2O NaCl CaSO4·2H2O CaCO3 H2O
含量 20 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.1 g 5 g 1000 mL
A　[甘露醇主要為該培養基提供碳源，A錯誤；固氮微生物合成的氨是固氮微生物生長所必需的，屬于初生代謝物，B正確；為了防止調節pH過程中的雜菌污染，一般先調pH再進行濕熱滅菌，C正確；分析培養基成分可知，培養基中沒有氮源，不能夠固氮的微生物在該培養基上不能生長，因此該培養基為選擇培養基，沒有加入瓊脂，不含凝固劑，D正確。]
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
9
2．(2024·廣東深圳一模)在“酵母菌純培養”的實驗課中，學生進行平板劃線的實踐操作。下列敘述錯誤的是(　　)
A．開始接種前和劃線完畢后都要將接種環進行灼燒
B．棉塞拔出后和塞上前裝有培養液的試管口都要通過火焰
C．在酒精燈火焰附近用接種環蘸取一環菌液
D．將皿蓋完全打開后用接種環在培養基表面連續劃線
√
題號
1
3
5
2
4
6
8
7
9
D　[接種前將接種環放在酒精燈火焰上灼燒滅菌，并需要在酒精燈火焰旁冷卻才能接種，劃線完畢后要將接種環進行灼燒，以防止雜菌污染，A正確；棉塞拔出后和塞上前裝有培養液的試管口都要通過火焰，B正確；酒精燈火焰旁存在無菌區域，在酒精燈火焰附近用接種環蘸取一環菌液，C正確；劃線操作時，為了防止雜菌污染，培養皿蓋不能完全打開，只能打開一條縫隙，操作時需要在酒精燈火焰旁進行，酒精燈火焰旁存在無菌區域，D錯誤。]
題號
1
3
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9
3．(2024·廣東茂名一模)某研究小組為比較藥物 AZA 和 CZA 對肺炎克雷伯菌的抑菌效果，用含有藥物的濾紙片進行抑菌實驗，結果如圖，下列敘述錯誤的是(　　)
A．培養皿和培養基都要經過滅菌處理
B．倒平板操作應在酒精燈火焰旁進行
C．本實驗是運用平板劃線法進行接種的
D．AZA抑制肺炎克雷伯菌的效果更好
√
題號
1
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C　[培養皿和培養基都要經過滅菌處理才能使用，A正確；倒平板時為了避免雜菌污染，故應在酒精燈火焰旁進行，B正確；分析題圖可知本實驗是運用稀釋涂布平板法進行接種操作的，C錯誤；從圖中可以看出，AZA的抑菌圈更大，說明對肺炎克雷伯菌的抑菌效果更好，D正確。]
題號
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4．(2024·廣東佛山期中)生長圖形法是一種測定微生物營養需求的簡便方法。為探究某嗜熱菌所需生長因子的種類，研究人員將該菌的懸浮液與不含任何生長因子、但含有其他必需營養物質的培養基混合后倒平板，然后在平板上劃分數區，再將甲、乙、丙三種生長因子分別添加到不同區域，培養結果如圖所示。根據圖示結果分析，該嗜熱菌生長需要的生長因子是(　　)
題號
1
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A．甲和丙　　　　　 B．乙和丙
C．甲和乙 D．甲、乙和丙
題號
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√
B　[圖中菌落生活在乙、丙區域之間，說明該嗜熱菌生長需要乙和丙，A、C、D錯誤，B正確。]
5．(2024·江蘇揚州模擬)橄欖油的主要成分是甘油三酯。研究者利用“橄欖油平板透明圈法”篩選獲得兩株產脂肪酶的菌株X 和Y, 檢測結果如表。下列相關敘述錯誤的是(　　)
題號
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9
酶活性(U·mL-1) 透明圈
空白 －
菌株X 6.9
菌株Y 7.7
A．培養基中的橄欖油可為微生物生長提供碳源
B．以上兩株菌株均可將脂肪酶分泌至細胞外
C．兩菌株中，Y所產脂肪酶活性高，應首選為理想菌株
D．改變溫度或pH，菌株X的透明圈可能會小于菌株Y的透明圈
√
題號
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C　[橄欖油的主要成分是甘油三酯，培養基中的橄欖油可以提供微生物生長所需要的碳源，A正確；兩株菌株均可將脂肪酶分泌至細胞外，對培養基中的橄欖油進行分解，B正確；圖中透明圈大小不僅與酶活性的大小成正比，也和產酶量相關，兩菌株中，Y所產脂肪酶活性高，但X的透明圈更大，說明其酶產量更多，故Y不應首選為理想菌株，還應進行多次篩選，C錯誤；溫度或pH會改變酶的活性，若改變溫度或pH，菌株X的透明圈可能會小于菌株Y的透明圈，D正確。]
題號
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6．(2024·江蘇泰州一模)某種物質A(一種含有C、H、N的有機物)難以降解，會對環境造成污染，只有某些細菌能降解A。研究人員按照如圖所示流程從淤泥中分離得到能高效降解A的細菌菌株。圖中③將M中的菌液稀釋一定倍數后，取0.1 mL涂布到平板上，初步估測搖瓶M中1 mL菌液中細菌數為2.4×108個。相關敘述正確的是
(　　)
題號
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9
A．實驗時，淤泥及盛有培養基的搖瓶通常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌
B．乙中需要加瓊脂和物質A等，實驗需設平行重復實驗，無須另外設置空白對照
C．③接種方法為稀釋涂布平板法，涂布時用涂布器蘸取菌液均勻涂布于平板上
D．若乙平板上菌落數平均為240個，則接種的菌液的稀釋倍數為105
√
題號
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D　[實驗時，要從淤泥中分離得到能高效降解A的細菌菌株，則①為淤泥取樣進行稀釋，可以取淤泥加無菌水制成菌懸液，淤泥中有菌種，因此不能進行滅菌處理，A錯誤；乙為固體培養基，需要加瓊脂和物質A等，為了提高準確度，實驗需設平行重復實驗，且需要另外設置空白對照，檢測培養基配制是否合格，B錯誤；③接種方法為稀釋涂布平板法，接種工具是涂布器，但是不能用涂布器蘸取菌液，應該將菌液用微量移液管加入培養基中，用涂布器進行均勻涂抹，C錯誤；若乙平板上長出的菌落數平均為240個，假設稀釋倍數為a，根據搖瓶M中1 mL菌液中細菌數為2.4×108個，在每個平板上涂布0.1 mL稀釋后的菌液，則有240×a÷0.1＝2.4×108，則稀釋倍數a＝105，D正確。]
題號
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7．(2024·湖北武漢模擬)野生型大腸桿菌菌株能在基本培養基上生長，氨基酸營養缺陷型菌株由于發生基因突變而無法合成某種氨基酸只能在完全培養基上生長，下圖為純化某氨基酸營養缺陷型突變株的部分流程圖，數字代表培養基，A、B、C表示操作步驟。下列有關說法正確的是(　　)
題號
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A．①②為完全培養基，③④為基本培養基
B．A操作的目的是提高突變菌株的濃度
C．B操作可用涂布器蘸取菌液均勻地涂布在②表面
D．經C過程影印及培養后，可從④培養基中挑取E菌落進行純化培養
√
題號
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9
B　[由圖可知，①②④為完全培養基，③為基本培養基，A錯誤；紫外線可用于誘導突變，提高突變的頻率，A操作的目的是提高突變菌株的濃度，B正確；B操作是先將菌液滴加到培養基的表面，再用涂布器均勻地涂布在②表面，C錯誤；D菌落在基本培養基中無法生長，而在完全培養基上能夠生長，這說明D菌落是氨基酸營養缺陷型菌株，故經C過程影印及培養后，可從④培養基中挑取D菌落進行純化培養，D錯誤。]
題號
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9
8．(2024·廣東梅州一模)某興趣小組為研究“使用公筷對餐后菜品細菌數量的影響”，將每道菜分為3 盤，一盤取樣冷藏，一盤使用公筷，一盤不用公筷，實驗過程如下圖。下列相關操作或敘述正確的是(　　)
題號
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9
A．將細菌接種在固體培養基 X上可采用平板劃線法
B．根據菌落的特征可以準確判斷細菌的種類
C．配制的培養基需經濕熱滅菌后調整pH，冷卻后倒平板
D．固體培養基 X 對菜品中的細菌沒有選擇性
√
題號
1
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D　[據題意可知，在固體培養基X上接種后還需進行計數，故只能用稀釋涂布平板法接種而不能用平板劃線法，A錯誤；在一定的培養條件下，不同種微生物表現出各自穩定的菌落特征，根據菌落的形狀、大小、顏色等特征，可以初步區分出不同種微生物，但不能準確判斷，B錯誤；配制的培養基需調整pH后經濕熱滅菌，冷卻后倒平板，C錯誤；固體培養基沒有做任何處理，所以對菜品中的細菌沒有選擇性，D正確。]
題號
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9．(11分)(2024·廣東廣州期末)為探究鏈霉素對大腸桿菌抗性的作用，某科研小組設計實驗，先將對鏈霉素敏感的大腸桿菌原始菌種涂布在1號培養基上，培養出菌落后，將滅菌絨布在1號上印模，絨布沾上菌落并進行轉印，使絨布上的菌落按照原位接種到2號和3號培養基上。待3號上長出菌落后，在2號上找到對應的菌落，然后接種到不含鏈霉素的4號培養液中，培養后再涂布到5號培養基上，并重復以上步驟。請根據實驗回答下列問題。
題號
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注：影印法指用無菌絨布輕蓋在已長好菌落的原培養基上，然后不轉動任何角度，“復印”至新的培養基上進行接種。
題號
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(1)實驗中影印培養的目的是__________________________________
__________________________。比較2、3培養基與6、7培養基可以得出：與原始菌種相比，4號培養液中______________________________________。
題號
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9
在不含鏈霉素的培養基的眾多菌落中，
選出含有抗鏈霉素菌的菌落
抗鏈霉素的大腸桿菌所占比
例增大(1分)
(2)如果將4號培養液稀釋104倍后取0.1 mL涂布到5號培養基上，重復三次統計菌落數目分別為131、132、136個，則4號培養液中大腸桿菌的密度約為___________________。理論上，使用此方法比使用血細胞計數板直接計數的結果__________(填“大”“小”或“相 等”)，原因是_________________________________________________________________________________________________________。
題號
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1.33×107個/mL
小(1分)
血細胞計數板計數會把死菌也計入；當多個菌連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落
(3)4號培養液中不含鏈霉素，一段時間后，4號培養液中大腸桿菌的數量減少了，原因是_________________________________________。
(4)通過本實驗結果，可以得出結論：__________________________
__________________________________________________________。
題號
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營養物質大大減少，有害物質不斷積累(1分)
鏈霉素在大腸桿菌抗鏈霉素
抗性的形成中起到選擇作用
[解析]　(1)將對鏈霉素敏感的大腸桿菌原始菌種涂布在1號培養基上，培養出菌落后，將滅菌絨布在1號上印模，絨布沾上菌落并進行轉印，使絨布上的菌落按照原位接種到2號和3號培養基上。待3號上長出菌落后，在2號上找到對應的菌落，然后接種到不含鏈霉素的4號培養液中，培養后再涂布到5號培養基上，并重復以上步驟，實驗中影印培養的目的是在不含鏈霉素的培養基的眾多菌落中，選出含有抗鏈霉素菌的菌落，3號與2號、7號與6號培養基中的菌落數的比值，是抗性菌落占全部菌落的比例，觀察實驗結果可知，與原始菌種相比，4號培養液中，抗鏈霉素的大腸桿菌所占比例增大。
題號
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(2)重復三次統計菌落數目分別為131、132、136個，則4號培養液中大腸桿菌的密度約為(131＋132＋136)÷3÷0.1×104＝1.33×107個/mL，血細胞計數板計數會把死菌也計入，用稀釋涂布平板法計數，當多個菌連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，理論上，使用此方法比使用血細胞計數板直接計數的結果小。(3)培養大腸桿菌需要營養物質，大腸桿菌也會產生代謝廢物，4號培養液中不含鏈霉素，一段時間后，4號培養液中大腸桿菌的數量減少的原因是營養物質大大減少，有害物質不斷積累。(4)影印培養的目的是在不含鏈霉素的培養基的眾多菌落中，選出含有抗鏈霉素菌的菌落，通過本實驗結果，可以得出結論：鏈霉素在大腸桿菌抗鏈霉素抗性的形成中起到選擇作用。
題號
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(教師用書獨具)
1．(2024·湖南株洲一模)L-天冬酰胺酶由細菌和真菌合成，可分解天冬酰胺釋放出氨，然后與奈斯勒試劑反應呈棕色。為篩選獲得L-天冬酰胺酶高產菌株，設計了如下固體培養基。固體培養基的主要成分有牛肉膏、蛋白胨、水、NaCl、瓊脂、奈斯勒試劑。實驗結果如下圖。下列敘述錯誤的是(　　)
A．根據實驗結果可知，接種時采用的是稀釋涂布平板法
B．應選擇菌落C作為高產L-天冬酰胺酶菌株進行大量培養
C．該培養基從功能來看屬于選擇培養基，其中充當氮源的成分是牛肉膏
D．無菌技術還可以避免操作者被有害微生物感染，實驗結束后的培養基不能直接丟棄
√
C　[從接種結果來看，菌落分布較為均勻，應該采用的是稀釋涂布平板法，A正確；菌落B和菌落C周圍棕色圈的直徑相同，但C的菌落直徑更小，因此菌落C的單個細胞產生的L-天冬酰胺酶更多，應選擇菌落C作為高產L-天冬酰胺酶菌株進行大量培養，B正確；培養基中有奈斯勒試劑，若微生物能產生L-天冬酰胺酶則菌落周圍會出現棕色圈，因此該培養基從功能來看屬于鑒別培養基，其中充當氮源的成分是牛肉膏和蛋白胨，C錯誤；實驗結束后為避免環境污染，培養基在丟棄前要進行滅菌處理，D正確。]
2．(2024·湖北黃岡模擬)測定水樣是否符合飲用水的衛生標準，常用濾膜法測定大腸桿菌的總數。大腸桿菌在含有伊紅—亞甲藍的固體培養基上長出的菌落呈紫黑色。濾膜法測定大腸桿菌數目的流程如下：用濾膜過濾待測水樣或其稀釋液→水樣或稀釋液中的細菌留在濾膜上→將濾膜轉移到伊紅—亞甲藍瓊脂平板上培養→統計濾膜上菌落數目。下圖為將待測水樣稀釋10倍后取100 mL稀釋液時的測定結果。下列相關敘述正確的是(　　)
A．伊紅—亞甲藍瓊脂培養基屬于選擇培養基
B．圖中1 L待測水樣中含大腸桿菌約1 700個
C．為減小誤差，應對所有實驗組平板進行計數并取平均值
D．為防止雜菌污染，過濾裝置和培養基使用前需干熱滅菌
√
B　[伊紅—亞甲藍瓊脂培養基屬于鑒別培養基，A錯誤；圖中濾膜上菌落數目為17個，該圖為將待測水樣稀釋10倍后取100 mL稀釋液時的測定結果，因此1 L待測水樣中含大腸桿菌約17÷0.1×10＝1 700個，B正確；為減小誤差，一般需對實驗組菌落數為30～300的平板進行計數并取平均值，C錯誤；培養基應濕熱滅菌，常采用高壓蒸汽滅菌法，D錯誤。]
謝 謝 ！第51講　微生物的培養技術及應用
　1．闡明在發酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養物的前提。　2．闡明無菌技術是在操作過程中，保持無菌物品與無菌區域不被微生物污染的技術。　3．舉例說明通過調整培養基的配方可有目的地培養某種微生物。　4．概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實驗室中進行微生物分離和純化的常用方法。　5．概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法是測定微生物數量的常用方法。
考點1　微生物的基本培養技術
一、培養基的配制
1．概念：人們按照微生物對____________的不同需求，配制出供其____________的營養基質。
2．種類
3．營養組成
(1)營養組成：水、無機鹽、碳源、__________。
(2)需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及O2的需求。
微生物 對培養基的需求
乳酸桿菌 添加____________
霉菌 一般將培養基調至________性
細菌 一般將培養基調至______________性
厭氧微生物 提供________的條件
(3)幾種微生物的營養和能量來源
微生物 碳源 氮源 能源
藍細菌 ________ NH＋4、 NO－3等 光能
硝化 細菌 ________ NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖類等有機物 ________ 有機物
酵母菌 糖類、蛋白質等有機物 蛋白質等 有機物
1．(人教版選擇性必修3 P10旁欄思考)培養基中加入氮源的作用是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
二、無菌技術
1．概念：在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。
2．關鍵：________________。
3．目的：________________________。
4．消毒與滅菌的比較
比較項目 條件 結果 常用方法 應用范圍
消毒 較為溫 和的__ ______ 或生物 等方法 殺死物 體表面 或內部 一部分 微生物 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高溫的液體
化學藥物 消毒法　 操作空間、操作者的衣物和手等
紫外線 消毒法 接種室、接種箱或超凈工作臺
滅菌 強烈的 理化 方法 殺死物 體內外 所有的 微生物， 包括芽 孢和 孢子 濕熱滅 菌法　 培養基、容器等
干熱滅 菌法　 玻璃器皿、金屬用具等
灼燒滅 菌法　 接種工具等
5．其他操作
(1)做好消毒和滅菌工作后，要注意避免已經滅菌處理的材料用具與______________接觸。
(2)為了避免周圍環境中微生物的污染，接下來的許多操作都應在超凈工作臺上并在____________附近進行。
2．(人教版選擇性必修3 P10相關信息)利用某些微生物可以凈化污水、污泥，原因是_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
6．酵母菌的純培養
3．(人教版選擇性必修3 P12探究·實踐)倒平板操作中，平板冷凝后，要將平板倒置，其主要原因是___________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
1．培養乳酸桿菌時，需要在培養基中添加維生素。 (　　)
2．某同學想從泡菜汁中篩選耐高鹽乳酸菌，進行了如下實驗：取泡菜汁樣品，劃線接種于一定NaCl濃度梯度的培養基，經培養得到了單菌落。培養基pH需偏堿性。 (　　)
3．為防止蛋白質變性，不能用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌。 (　　)
4．玻璃器皿、金屬用具等可采用干熱滅菌法。 (　　)
微生物的分離和培養是現代生物工程應用中的重要環節。如圖甲、乙是大腸桿菌分離和培養過程中部分操作和實驗結果示意圖。
(1)培養大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養基是否被污染，對于固體培養基應采用的檢測方法是什么？
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)指出圖甲所示的操作中較明顯的一處錯誤是什么？在第二次劃線前灼燒接種環，目的是什么？
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)圖乙是平板劃線法接種操作示意圖，正確的操作順序是　　　　　　　　　　 (用字母和箭頭表示)；找出圖乙中一處錯誤的操作：　　　　　(用字母表示)。
培養基的配制及無菌技術
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P9－10正文)下表為某培養基的配方，下列有關敘述正確的是(　　)
成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4 伊紅 美藍 蒸餾水
含量 10 g 10 g 2 g 0.4 g 0.065 g 1 000 mL
A．從物理性質看該培養基屬于液體培養基，從用途看該培養基屬于選擇培養基
B．培養基中屬于碳源的物質主要是葡萄糖，屬于氮源的物質是蛋白胨
C．該培養基所培養微生物的同化作用類型是自養型
D．該培養基調節合適的pH后就可以用于接種菌種
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P11資料卡)獲得純凈微生物培養物的關鍵是防止外來雜菌入侵。下列關于無菌操作的敘述，錯誤的是(　　)
A．超凈工作臺在使用前進行紫外線照射以殺死物體表面或空氣中的微生物
B．無菌技術還應包括避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸
C．牛奶可使用巴氏消毒法，其優點是能夠殺死全部微生物，保留牛奶風味
D．灼燒滅菌的對象可以是金屬用具和玻璃器皿，在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒
微生物的純培養
3．(鏈接人教版選擇性必修3 P12探究·實踐)微生物平板劃線和培養的具體操作如圖所示，下列操作正確的是(　　)
A．①②⑤⑥　　　　　 B．③④⑥⑦
C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
　　平板劃線操作中幾次灼燒接種環的目的
項目 第一次劃 線前灼燒 每次劃線 前灼燒 劃線結束 后灼燒
目的 避免接種環上可能存在的微生物污染培養物 殺死上一次劃線結束后接種環上殘留的菌種，使每次劃線的菌種均來自上一次劃線的末端 殺死接種環上殘留的菌種，避免菌種污染環境和感染操作者
4．(鏈接人教版選擇性必修3 P12探究·實踐)為純化菌種，在鑒別培養基上劃線接種尿素分解菌，培養結果如圖所示。下列敘述正確的是(　　)
A．倒平板后要間歇晃動培養皿，以保證培養基表面平整
B．培養皿中Ⅰ區的細菌數量較多，一般從Ⅱ區挑取單菌落
C．該實驗結果存在單菌落，因此可達到菌種純化的目的
D．培養基的pH可調至近酸性，其中尿素為唯一的氮源物質
考點2　微生物的選擇培養和計數
一、選擇培養基
二、微生物的選擇培養
1．土壤取樣
鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。
2．等比稀釋
將10 g土樣加入盛有________ mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1 mL上清液加入盛有9 mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
3．涂布平板
4．培養觀察
(1)待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入____________ ℃的恒溫培養箱中培養1～2 d。
(2)在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的____________。
1．(人教版選擇性必修3 P18探究·實踐)統計菌落種類和數目時要每隔24 h觀察統計一次，直到各類菌落數目穩定。若培養時間不足或培養時間太長，分別會導致的結果是________________________、_____________________________
____________________________________________________________________。
三、微生物的數量測定
1．稀釋涂布平板法
(1)計數原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的__________，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
(2)計數標準：為了保證結果準確，一般選擇菌落數為____________的平板進行計數。
(3)計數方法：通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，以保證獲得菌落數為____________、適于計數的平板。在______________下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出____________。
(4)當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，統計結果一般用____________表示。
2．顯微鏡直接計數法
(1)計數原理：利用特定的____________或______________，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。
(2)統計結果：一般是__________數和______________數的總和。
(3)優點：是一種常用的、快速直觀的測定微生物數量的方法。
2．(人教版選擇性必修3 P18相關信息)血細胞計數板常用于____________的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數；細菌計數板常用于____________的細菌等的計數。
四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
[深化拓展]
1．選擇培養基四種常見制備方法或實例
(1)加入某些特定的物質(前提是培養基具備全部營養成分)
(2)改變培養基的營養成分
(3)利用培養基“特定化學成分”分離
(4)通過某些“特殊環境”分離
2．兩種純化細菌的方法的比較
項目 平板劃線法 稀釋涂布平板法
純化原理 通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面 將菌液進行一系列的梯度稀釋，稀釋度足夠高時，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞
主要步驟 平板劃線操作 系列稀釋操作和涂布平板操作
接種工具 接種環 涂布器
平板示 意圖
能否用 于計數 不能計數 可以計數，但操作復雜，需涂布多個平板
共同點 都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征
1．選擇培養基可以鑒定某種微生物的種類。 (　　)
2．血細胞計數板既可用于酵母菌的數量測定，也可用于細菌的數量測定。 (　　)
3．若從植物根際土壤中篩選分解淀粉的固氮細菌，培養基的主要營養物質包括水和無機鹽、淀粉。 (　　)
4．某同學進行分離高產脲酶菌的實驗設計時，認為可分解酚紅指示劑使其褪色的菌株是產脲酶菌。 (　　)
5．為探究校內植物園土壤中的細菌種類，某興趣小組采集園內土壤樣本并開展相關實驗。土壤溶液稀釋倍數越低，越容易得到單菌落。 (　　)
為了分離和純化高效分解石油的細菌，科研人員利用被石油污染過的土壤進行下圖A所示的實驗。
(1)步驟③與步驟②中培養基成分的最大區別是　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)同學甲進行步驟④的操作，其中一個平板經培養后的菌落分布如圖B所示，推測同學甲用此方法接種時出現圖B結果可能的操作失誤是　　　　　　　　　　　。
(3)在進行實驗時，甲同學從對應106倍稀釋的培養基中篩選出大約200個菌落，但是其他同學在同樣稀釋度下只篩選出大約90個菌落，若甲同學的結果有問題，則可能的原因是什么？(答出一項即可)
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)步驟⑤后取樣測定石油含量的目的是　　　　　　　　　　　　　　　。
微生物的選擇培養
1．(鏈接人教版選擇性必修3 P16思考·討論)某科研小組欲從土壤中篩選能分解除草劑A(組成元素為C、H、O、N，在水中溶解度低，含除草劑A的固體培養基不透明)的細菌用于生產，實驗流程如下圖所示。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．從經常使用除草劑A的土壤取樣比從其他土壤取樣更容易篩選到除草劑A分解菌
B．培養基1為固體培養基，此操作的主要目的是增加除草劑A分解菌的數量
C．培養基2為選擇培養基，其中以除草劑A作為唯一氮源便于分離除草劑A分解菌
D．挑選菌落時，透明圈直徑與菌落直徑比值越大，表明細菌分解除草劑A的能力越強
微生物的分離和計數
2．(鏈接人教版選擇性必修3 P17圖1-7)尿素是一種重要的農業肥料，尿素分解菌可合成脲酶，利用以尿素為唯一氮源的選擇培養基可從土壤中分離尿素分解菌并進行計數，科研人員取0.1 g土壤分別稀釋103～107倍，將0.1 mL不同稀釋倍數的土壤稀釋液接種在固體培養基上，在相同的培養條件下得到如下數據。下列敘述正確的是(　　)
稀釋倍數 103 104 105 106 107
菌落數/個 1號平板 478 367 270 26 5
2號平板 496 354 268 20 8
3號平板 509 332 272 29 3
A．利用稀釋涂布平板法可將稀釋液中的菌體完全分離，一個菌落對應一個菌體
B．該實驗中稀釋倍數為105的平板菌落數在30～300內，最適合用來統計活菌數
C．以尿素為唯一氮源的培養基上長出的菌均為尿素分解菌
D．若在顯微鏡下利用細菌計數板直接計數，則統計結果一般比實際活菌數少
3．(鏈接人教版選擇性必修3 P20拓展應用T2)剛果紅是一種染料，可以與纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發生這種反應。從落葉較多的腐質土取10 g土壤，用無菌水稀釋106倍后，取0.1 mL涂布到三個平板中(培養基配方：纖維素鈉鹽5～10 g、酵母膏1 g、土豆汁100 mL、KH2PO40.25 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL)培養，菌落數目穩定后加入剛果紅染色，洗去浮色后對纖維素分解菌進行分離與計數，三個平板菌落數無顯著差異，平均值為200個，出現透明圈的菌落數平均值為30。下列敘述正確的是(　　)
A．上述實驗中使用的培養基為選擇培養基
B．該培養基pH需要調為中性或者弱酸性
C．涂布的0.1 mL培養液中活菌數可能高于200個
D．10 g土樣中纖維素分解菌的數目約為3.0×108個
1．(2024·海南卷)某小組為檢測1株粗糙脈孢霉突變株的氨基酸缺陷類型，在相同培養溫度和時間的條件下進行實驗，結果見表。下列有關敘述錯誤的是(　　)
組別 培養條件 實驗結果
① 基礎培養基 無法生長
② 基礎培養基＋甲、乙、丙3種氨基酸 正常生長
③ 基礎培養基＋甲、乙2種氨基酸 無法生長
④ 基礎培養基＋甲、丙2種氨基酸 正常生長
⑤ 基礎培養基＋乙、丙2種氨基酸 正常生長
A．組別①是②③④⑤的對照組
B．培養溫度和時間屬于無關變量
C．①②結果表明，甲、乙、丙3種氨基酸中有該突變株正常生長所必需的氨基酸
D．①～⑤結果表明，該突變株為氨基酸甲缺陷型
2．(2024·浙江6月卷)脲酶催化尿素水解，產生的氨可作為細菌的氮源。脲酶被去除鎳后失去活性。下列敘述錯誤的是(　　)
A．鎳是組成脲酶的重要元素
B．鎳能提高尿素水解反應的活化能
C．產脲酶細菌可在以NH4Cl為唯一氮源的培養基生長繁殖
D．以尿素為唯一氮源的培養基可用于篩選產脲酶細菌
3．(2024·全國甲卷)合理使用消毒液有助于減少傳染病的傳播。某同學比較了3款消毒液A、B、C殺滅細菌的效果，結果如圖所示。回答下列問題：
(1)該同學采用顯微鏡直接計數法和菌落計數法分別測定同一樣品的細菌數量，發現測得的細菌數量前者大于后者，其原因是_____________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(2)該同學從100 mL細菌原液中取1 mL加入無菌水中得到10 mL稀釋菌液，再從稀釋菌液中取200 μL涂布平板，菌落計數的結果為100，據此推算細菌原液中細菌濃度為________個/mL。
(3)菌落計數過程中，涂布器應先在酒精燈上灼燒，冷卻后再涂布。灼燒的目的是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
__________________，冷卻的目的是________________________。
(4)據圖可知殺菌效果最好的消毒液是______，判斷依據是________________________________________________________________________________________(答出兩點即可)。
(5)鑒別培養基可用于反映消毒液殺滅大腸桿菌的效果。大腸桿菌在伊紅美藍培養基上生長的菌落呈__________色。
[夯實必備知識]自主診斷
考點1
一、1．營養物質　生長繁殖　3．(1)氮源　(2)維生素　酸　中性或弱堿　無氧　(3)CO2　CO2　N2
二、2．防止雜菌污染　3．獲得純凈的微生物培養物　4．物理、化學　5．(1)周圍的物品　(2)酒精燈火焰　6．高壓蒸汽滅菌　干熱滅菌　平板劃線法　倒置　未接種　28
考點2
一、抑制或阻止　NH3　尿素
二、2.90　3.0．1　酒精　冷卻　4．(1)30～37
(2)單菌落
三、1．(1)菌落數　(2)30～300　(3)30～300　同一稀釋度　平均值　(4)菌落數　2．(1)細菌計數板　血細胞計數板　(2)活菌　死菌
四、脲酶　尿素　中性　菌落數目穩定時
第51講　微生物的培養技術及應用
考點1
教材隱性知識
1．提示：培養基中的氮元素是微生物合成蛋白質、核酸等物質所必需的
2．提示：有的微生物能夠寄生于多種細菌體內，使細菌裂解；微生物可分解污水、污泥中的有機物
3．提示：防止冷凝后形成的水珠滴落在培養基上，防止培養基水分過快蒸發
澄清概念
1．√
2．×提示：乳酸菌經過無氧呼吸產生乳酸，故其生活的環境是酸性，培養基pH需偏酸性。
3．×提示：一般用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌。
4．√
達成學科素養
提示：(1)將未接種的培養基在適宜的條件下培養一段時間，觀察培養基上是否有菌落產生
(2)最后一次(第四次)劃線與第一次劃線區域重疊。殺死上次劃線后接種環上可能殘余的菌種，保證下一次劃線時的菌種直接來源于上一次劃線的末端
(3)A→B→G→F→E→C→D→H　C
評價遷移應用
1．B　[從物理性質看該培養基不含凝固劑，屬于液體培養基，從用途看該培養基含有指示劑，屬于鑒別培養基，A錯誤；培養基中屬于碳源的物質主要是葡萄糖，蛋白胨來源于動物原料，含有有機氮等營養物質，故屬于氮源的物質是蛋白胨，B正確；該培養基含有葡萄糖等有機碳源，培養的微生物屬于異養型，C錯誤；該培養基調節合適的pH后還需要進行滅菌，滅菌結束倒平板完成后，才能用于接種菌種，D錯誤。]
2．C　[接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前，可用紫外線照射30 min，以殺死物體表面或空氣中的微生物，A正確；無菌技術應圍繞著如何避免雜菌的污染展開，還應包括避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸，B正確；牛奶可使用巴氏消毒法，其優點是能夠殺死牛奶中的絕大多數微生物，并且基本不會破壞牛奶的營養成分，C錯誤；灼燒滅菌的對象可以是金屬用具和玻璃器皿，在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，D正確。]
3．D　[由圖可知，②中拔出棉塞后應握住棉塞上部；⑥中劃線時不能將培養皿的皿蓋完全拿開，應只打開一條縫隙；⑦中劃線時第5次的劃線不能與第1次的劃線相連；⑧中平板應倒置培養。①③④⑤正確，故選D。]
4．C　[倒平板后無須間歇晃動培養皿，A錯誤；培養皿中Ⅰ、Ⅱ區的細菌數量較多，一般從Ⅲ區挑取單菌落，B錯誤；該實驗Ⅲ區有單菌落，挑取培養后可達到菌種純化的目的，C正確；細菌培養基的pH應調至中性或弱堿性，其中尿素為唯一的氮源物質，可用于篩選尿素分解菌，D錯誤。]
考點2
教材隱性知識
1．提示：遺漏菌落的種類和數目　菌落粘連影響計數、培養基表面干燥脫水、微生物衰敗，菌落特征不易觀察
2．提示：相對較大　相對較小
澄清概念
1．×提示：選擇培養基可以篩選分離出某種微生物。
2．×提示：血細胞計數板適用于真菌的計數，細菌計數板用于細菌的數量測定等。
3．√
4．×提示：產脲酶菌不能分解酚紅指示劑。
5．×提示：土壤溶液稀釋倍數足夠高時，才能將聚集的細菌分散開，有助于在培養基表面形成單菌落。
達成學科素養
提示：(1)③的培養基中石油是唯一碳源
(2)接種時涂布不均勻
(3)培養基被雜菌污染
(4)篩選出分解石油能力最好的細菌
評價遷移應用
1．B　[要想獲得目的菌，應在富含該菌種的自然環境中篩選，故從經常使用除草劑A的土壤取樣比從其他土壤取樣更容易篩選到除草劑A分解菌，A正確；為擴大培養，實驗中培養基1為液體培養基，其目的是增加目的菌(除草劑A分解菌)的數量，起到篩選作用，B錯誤；根據題干信息可知，某科研小組從土壤中篩選出能夠將除草劑A分解的菌株，則應以除草劑A作為唯一氮源，在該培養基上只有目的菌能夠生存，其他雜菌因為缺少氮源不能生存，C正確；挑選菌落時，透明圈直徑與菌落直徑比值越大，表明細菌分解除草劑A的能力越強，D正確。]
2．B　[利用稀釋涂布平板法不可將稀釋液中的菌體完全分離，可能會出現兩個或多個菌體連在一起的現象，A錯誤；為保證結果準確，一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數，該實驗中稀釋倍數為105的平板菌落數在30～300內，最適合用來統計活菌數，B正確；以尿素為唯一氮源的培養基上長出的不都是尿素分解菌，還有可能是自生固氮菌，C錯誤；若在顯微鏡下利用細菌計數板直接計數，不能區分活菌和死菌，則統計結果一般比實際活菌數多，D錯誤。]
3．C　[要從土壤中將纖維素分解菌分離出來，應該將它們接種在以纖維素為唯一碳源的選擇培養基上，根據題述實驗中培養基的成分可知，該培養基不屬于選擇培養基，應該屬于鑒別培養基，A錯誤；該培養基pH需要調為中性或者弱堿性，用以培養細菌，B錯誤；涂布的0.1 mL培養液中活菌數可能高于200個，因為記數的菌落中可能含有由聚集在一起的兩個或兩個以上的細胞長成的菌落，C正確；三個平板菌落的平均值為200個，其中出現透明圈的菌落數平均值為30，即有30個纖維素分解菌，則10 g土樣中纖維素分解菌的數目約為30÷0.1×106×10＝3.0×109個，D錯誤。]
體驗真題
1．D　[由表可知：除了組別①之外，其他組別的基礎培養基中都添加了氨基酸，因此組別①是②③④⑤的對照組，A正確；由題意、表中信息可知：實驗的自變量為添加的氨基酸種類，各組別的培養溫度和時間均相同，說明培養溫度和時間均屬于無關變量，B正確；由①②結果可知：粗糙脈孢霉突變株在基礎培養基中無法生長，但在添加了甲、乙、丙3種氨基酸的基礎培養基中能正常生長，這表明甲、乙、丙3種氨基酸中有該突變株正常生長所必需的氨基酸，C正確；與組別①相比，在基礎培養基中，添加的氨基酸中含有丙氨基酸，則粗糙脈孢霉突變株都能正常生長，但在只添加甲、乙2種氨基酸的基礎培養基中無法生長，說明該突變株為氨基酸丙缺陷型，D錯誤。]
2．B　[根據題意可知，脲酶被去除鎳后失去活性，說明鎳是組成脲酶的重要元素，A正確；脲酶催化尿素水解的機理為降低化學反應所需的活化能，B錯誤；產脲酶細菌可利用NH4Cl里的氮源進行代謝活動，因此產脲酶細菌可在以NH4Cl為唯一氮源的培養基上生長繁殖，C正確；產脲酶細菌能利用脲酶催化尿素分解產生NH3，NH3可作為細菌生長的氮源，不能產脲酶的細菌則無法分解尿素獲得氮源，因此以尿素為唯一氮源的培養基可用于篩選產脲酶細菌，D正確。]
3．(1)前者微生物分散的活菌和死菌一起計數，后者存在多個活菌形成一個菌落的情況且只計數活菌　(2)5 000　(3)殺死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染　防止溫度過高殺死菌種　(4)A　A消毒液活細菌數減少量最多，且殺菌時間較短，效率最高　(5)(紫)黑
17 / 17課時數智作業(五十一)　微生物的培養技術及應用
1．(2024·廣東名校聯盟模擬)固氮微生物可將空氣中的氮氣(N2)還原為氨，并轉化為細胞中的含氮物質，是土壤中氮素的主要來源。表格是一個用于分離培養固氮微生物的培養基配方，其中甘露醇的分子式為C6H14O6，下列敘述中錯誤的是(　　)
物質名稱 C6H14O6 K2HPO4 MgSO4·7H2O NaCl CaSO4·2H2O CaCO3 H2O
含量 20 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.1 g 5 g 1 000 mL
A．甘露醇在培養基中的作用是調節滲透壓
B．固氮微生物合成的氨屬于初生代謝物
C．對該培養基先調節pH再進行濕熱滅菌
D．該培養基為選擇培養基，不含凝固劑
2．(2024·廣東深圳一模)在“酵母菌純培養”的實驗課中，學生進行平板劃線的實踐操作。下列敘述錯誤的是(　　)
A．開始接種前和劃線完畢后都要將接種環進行灼燒
B．棉塞拔出后和塞上前裝有培養液的試管口都要通過火焰
C．在酒精燈火焰附近用接種環蘸取一環菌液
D．將皿蓋完全打開后用接種環在培養基表面連續劃線
3．(2024·廣東茂名一模)某研究小組為比較藥物 AZA 和 CZA 對肺炎克雷伯菌的抑菌效果，用含有藥物的濾紙片進行抑菌實驗，結果如圖，下列敘述錯誤的是(　　)
A．培養皿和培養基都要經過滅菌處理
B．倒平板操作應在酒精燈火焰旁進行
C．本實驗是運用平板劃線法進行接種的
D．AZA抑制肺炎克雷伯菌的效果更好
4．(2024·廣東佛山期中)生長圖形法是一種測定微生物營養需求的簡便方法。為探究某嗜熱菌所需生長因子的種類，研究人員將該菌的懸浮液與不含任何生長因子、但含有其他必需營養物質的培養基混合后倒平板，然后在平板上劃分數區，再將甲、乙、丙三種生長因子分別添加到不同區域，培養結果如圖所示。根據圖示結果分析，該嗜熱菌生長需要的生長因子是(　　)
A．甲和丙　　　　　 B．乙和丙
C．甲和乙 D．甲、乙和丙
5．(2024·江蘇揚州模擬)橄欖油的主要成分是甘油三酯。研究者利用“橄欖油平板透明圈法”篩選獲得兩株產脂肪酶的菌株X 和Y, 檢測結果如表。下列相關敘述錯誤的是(　　)
酶活性(U·mL-1) 透明圈
空白 －
菌株X 6.9
菌株Y 7.7
A．培養基中的橄欖油可為微生物生長提供碳源
B．以上兩株菌株均可將脂肪酶分泌至細胞外
C．兩菌株中，Y所產脂肪酶活性高，應首選為理想菌株
D．改變溫度或pH，菌株X的透明圈可能會小于菌株Y的透明圈
6．(2024·江蘇泰州一模)某種物質A(一種含有C、H、N的有機物)難以降解，會對環境造成污染，只有某些細菌能降解A。研究人員按照如圖所示流程從淤泥中分離得到能高效降解A的細菌菌株。圖中③將M中的菌液稀釋一定倍數后，取0.1 mL涂布到平板上，初步估測搖瓶M中1 mL菌液中細菌數為2.4×108個。相關敘述正確的是(　　)
A．實驗時，淤泥及盛有培養基的搖瓶通常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌
B．乙中需要加瓊脂和物質A等，實驗需設平行重復實驗，無須另外設置空白對照
C．③接種方法為稀釋涂布平板法，涂布時用涂布器蘸取菌液均勻涂布于平板上
D．若乙平板上菌落數平均為240個，則接種的菌液的稀釋倍數為105
7．(2024·湖北武漢模擬)野生型大腸桿菌菌株能在基本培養基上生長，氨基酸營養缺陷型菌株由于發生基因突變而無法合成某種氨基酸只能在完全培養基上生長，下圖為純化某氨基酸營養缺陷型突變株的部分流程圖，數字代表培養基，A、B、C表示操作步驟。下列有關說法正確的是(　　)
A．①②為完全培養基，③④為基本培養基
B．A操作的目的是提高突變菌株的濃度
C．B操作可用涂布器蘸取菌液均勻地涂布在②表面
D．經C過程影印及培養后，可從④培養基中挑取E菌落進行純化培養
8．(2024·廣東梅州一模)某興趣小組為研究“使用公筷對餐后菜品細菌數量的影響”，將每道菜分為3 盤，一盤取樣冷藏，一盤使用公筷，一盤不用公筷，實驗過程如下圖。下列相關操作或敘述正確的是(　　)
A．將細菌接種在固體培養基 X上可采用平板劃線法
B．根據菌落的特征可以準確判斷細菌的種類
C．配制的培養基需經濕熱滅菌后調整pH，冷卻后倒平板
D．固體培養基 X 對菜品中的細菌沒有選擇性
9．(11分)(2024·廣東廣州期末)為探究鏈霉素對大腸桿菌抗性的作用，某科研小組設計實驗，先將對鏈霉素敏感的大腸桿菌原始菌種涂布在1號培養基上，培養出菌落后，將滅菌絨布在1號上印模，絨布沾上菌落并進行轉印，使絨布上的菌落按照原位接種到2號和3號培養基上。待3號上長出菌落后，在2號上找到對應的菌落，然后接種到不含鏈霉素的4號培養液中，培養后再涂布到5號培養基上，并重復以上步驟。請根據實驗回答下列問題。
注：影印法指用無菌絨布輕蓋在已長好菌落的原培養基上，然后不轉動任何角度，“復印”至新的培養基上進行接種。
(1)實驗中影印培養的目的是_________________________________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
比較2、3培養基與6、7培養基可以得出：與原始菌種相比，4號培養液中______________________________________。
(2)如果將4號培養液稀釋104倍后取0.1 mL涂布到5號培養基上，重復三次統計菌落數目分別為131、132、136個，則4號培養液中大腸桿菌的密度約為___________________。理論上，使用此方法比使用血細胞計數板直接計數的結果
_________(填“大”“小”或“相等”)，原因是____________________________
____________________________________________________________________。
(3)4號培養液中不含鏈霉素，一段時間后，4號培養液中大腸桿菌的數量減少了，原因是_______________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)通過本實驗結果，可以得出結論：_____________________________________
____________________________________________________________________。
課時數智作業(五十一)
1．A　[甘露醇主要為該培養基提供碳源，A錯誤；固氮微生物合成的氨是固氮微生物生長所必需的，屬于初生代謝物，B正確；為了防止調節pH過程中的雜菌污染，一般先調pH再進行濕熱滅菌，C正確；分析培養基成分可知，培養基中沒有氮源，不能夠固氮的微生物在該培養基上不能生長，因此該培養基為選擇培養基，沒有加入瓊脂，不含凝固劑，D正確。]
2．D　[接種前將接種環放在酒精燈火焰上灼燒滅菌，并需要在酒精燈火焰旁冷卻才能接種，劃線完畢后要將接種環進行灼燒，以防止雜菌污染，A正確；棉塞拔出后和塞上前裝有培養液的試管口都要通過火焰，B正確；酒精燈火焰旁存在無菌區域，在酒精燈火焰附近用接種環蘸取一環菌液，C正確；劃線操作時，為了防止雜菌污染，培養皿蓋不能完全打開，只能打開一條縫隙，操作時需要在酒精燈火焰旁進行，酒精燈火焰旁存在無菌區域，D錯誤。]
3．C　[培養皿和培養基都要經過滅菌處理才能使用，A正確；倒平板時為了避免雜菌污染，故應在酒精燈火焰旁進行，B正確；分析題圖可知本實驗是運用稀釋涂布平板法進行接種操作的，C錯誤；從圖中可以看出，AZA的抑菌圈更大，說明對肺炎克雷伯菌的抑菌效果更好，D正確。]
4．B　[圖中菌落生活在乙、丙區域之間，說明該嗜熱菌生長需要乙和丙，A、C、D錯誤，B正確。]
5．C　[橄欖油的主要成分是甘油三酯，培養基中的橄欖油可以提供微生物生長所需要的碳源，A正確；兩株菌株均可將脂肪酶分泌至細胞外，對培養基中的橄欖油進行分解，B正確；圖中透明圈大小不僅與酶活性的大小成正比，也和產酶量相關，兩菌株中，Y所產脂肪酶活性高，但X的透明圈更大，說明其酶產量更多，故Y不應首選為理想菌株，還應進行多次篩選，C錯誤；溫度或pH會改變酶的活性，若改變溫度或pH，菌株X的透明圈可能會小于菌株Y的透明圈，D正確。]
6．D　[實驗時，要從淤泥中分離得到能高效降解A的細菌菌株，則①為淤泥取樣進行稀釋，可以取淤泥加無菌水制成菌懸液，淤泥中有菌種，因此不能進行滅菌處理，A錯誤；乙為固體培養基，需要加瓊脂和物質A等，為了提高準確度，實驗需設平行重復實驗，且需要另外設置空白對照，檢測培養基配制是否合格，B錯誤；③接種方法為稀釋涂布平板法，接種工具是涂布器，但是不能用涂布器蘸取菌液，應該將菌液用微量移液管加入培養基中，用涂布器進行均勻涂抹，C錯誤；若乙平板上長出的菌落數平均為240個，假設稀釋倍數為a，根據搖瓶M中1 mL菌液中細菌數為2.4×108個，在每個平板上涂布0.1 mL稀釋后的菌液，則有240×a÷0.1＝2.4×108，則稀釋倍數a＝105，D正確。]
7．B　[由圖可知，①②④為完全培養基，③為基本培養基，A錯誤；紫外線可用于誘導突變，提高突變的頻率，A操作的目的是提高突變菌株的濃度，B正確；B操作是先將菌液滴加到培養基的表面，再用涂布器均勻地涂布在②表面，C錯誤；D菌落在基本培養基中無法生長，而在完全培養基上能夠生長，這說明D菌落是氨基酸營養缺陷型菌株，故經C過程影印及培養后，可從④培養基中挑取D菌落進行純化培養，D錯誤。]
8．D　[據題意可知，在固體培養基X上接種后還需進行計數，故只能用稀釋涂布平板法接種而不能用平板劃線法，A錯誤；在一定的培養條件下，不同種微生物表現出各自穩定的菌落特征，根據菌落的形狀、大小、顏色等特征，可以初步區分出不同種微生物，但不能準確判斷，B錯誤；配制的培養基需調整pH后經濕熱滅菌，冷卻后倒平板，C錯誤；固體培養基沒有做任何處理，所以對菜品中的細菌沒有選擇性，D正確。]
9．(除標注外，每空2分，共11分)(1)在不含鏈霉素的培養基的眾多菌落中，選出含有抗鏈霉素菌的菌落　抗鏈霉素的大腸桿菌所占比例增大(1分)　(2)1.33×107個/mL　小(1分)　血細胞計數板計數會把死菌也計入；當多個菌連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落　(3)營養物質大大減少，有害物質不斷積累(1分)　(4)鏈霉素在大腸桿菌抗鏈霉素抗性的形成中起到選擇作用
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