資源簡(jiǎn)介

第二節(jié) 基因工程的基本操作程序
第一課時(shí)
人教版高中生物學(xué)教材《生物技術(shù)與工程》（選擇性必修三）第三章
與載體拼接
普通棉花
（無(wú)抗蟲(chóng)特性）
棉花細(xì)胞
抗蟲(chóng)棉
（有抗蟲(chóng)特性）
導(dǎo)入
抗蟲(chóng)基因
重組DNA分子
培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建
3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
4.目的基因的 檢測(cè)與鑒定
蘇云金桿菌
基因工程的基本操作程序（4個(gè)步驟）
1
2
3
4
目的基因的篩選與獲取
基因表達(dá)載體的構(gòu)建
將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
目的基因的檢測(cè)與鑒定
目的基因的篩選與獲取
一、目的基因
（1）概念：
用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因；
與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。（Bt抗蟲(chóng)蛋白基因：轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉）。
主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子
（2）實(shí)例：
目的基因的篩選與獲取
二、篩選合適的目的基因
方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。
DNA測(cè)序儀
核苷酸序列比對(duì)
氨基酸序列比對(duì)
美國(guó)國(guó)家生物信息中心
越來(lái)越多基因的功能和結(jié)構(gòu)被分析。
一、目的基因的獲取
目的基因：主要指編碼蛋白質(zhì)的基因
一、目的基因的獲取
一、目的基因的獲取—從基因文庫(kù)中獲取目的基因
基因文庫(kù)：
將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。
重難點(diǎn)解析
基因文庫(kù)
將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。
① 概念
② 分類(lèi):按外源DNA片段的來(lái)源分類(lèi)
種類(lèi)
部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，
如：cDNA文庫(kù)
基因組文庫(kù)： 含有一種生物的全部基因
選修3
P10
考
點(diǎn)
1.建立基因文庫(kù)
（1）建立基因組文庫(kù)
某生物所有的DNA
基因組所有基因
每個(gè)基因和運(yùn)載體結(jié)合形成重組DNA分子
導(dǎo)入受體菌
基因組文庫(kù)
特定的限制性?xún)?nèi)切核酸酶
一、從基因文庫(kù)中獲取目的基因
1.建立基因文庫(kù)
（1）建立基因組文庫(kù)
缺點(diǎn)：工作量大，盲目性強(qiáng)
適用：原核生物、病毒等
一、從基因文庫(kù)中獲取目的基因
1.建立基因文庫(kù)
（2）建立cDNA文庫(kù)
請(qǐng)寫(xiě)出由mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA的過(guò)程
成熟的mRNA
單鏈DNA
雙鏈DNA分子（cDNA）
一、從基因文庫(kù)中獲取目的基因
逆轉(zhuǎn)錄酶
DNA聚合酶
一、從基因文庫(kù)中獲取目的基因
1.建立基因文庫(kù)
（2）建立cDNA文庫(kù)
某種生物的單鏈mRNA
單鏈互補(bǔ)DNA
雙鏈cDNA片段
導(dǎo)入受體菌株中儲(chǔ)存
逆轉(zhuǎn)錄酶
DNA聚合酶
逆轉(zhuǎn)錄酶
與載體連接
cDNA文庫(kù)
特點(diǎn)：cDNA是不含內(nèi)含子和非編碼區(qū)
基因組文庫(kù)
cDNA文庫(kù)
基因組文庫(kù) VS cDNA文庫(kù)
歸納對(duì)比
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}文庫(kù)類(lèi)型
cDNA文庫(kù)
基因組文庫(kù)
文庫(kù)大小
小
大
啟動(dòng)子
無(wú)
有
內(nèi)含子
無(wú)
有
基因多少
某種生物部分基因
某種生物全部基因
物種間的
基因交流
可以
部分基因可以
為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？
尋根問(wèn)底
提示：構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。
如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。
1
怎么獲??？怎么擴(kuò)增？
尋根問(wèn)底
2
1. 怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需要的目的基因呢？
一般是根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、 基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因。
2. 怎樣大量擴(kuò)增我們所得到的目的基因呢？
利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因
選修3
P9
利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因
獲取目的基因
2
① 概念：PCR是在生物______復(fù)制__________________的
核酸合成技術(shù)（又稱(chēng)為多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）
② 原理：____________________
③ 前提：________________________________
④ 條件： ___________、______________________、
___________ 、_____________________。
體外
特定DNA片段
DNA雙鏈復(fù)制原理
模板DNA
四種脫氧核苷酸
引物
熱穩(wěn)定DNA聚合酶
一段已知目的基因的核苷酸序列
引物：是指能與DNA母鏈一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的一小段DNA或RNA。
使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。
利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因
獲取目的基因
2
⑤過(guò)程：
DNA聚合酶特性：不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈，
因此，需要引物。
引物：是指能與DNA母鏈一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的一小段DNA或RNA。使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。
變性：90度以上加熱至90～95℃
復(fù)性：50度左右冷卻至55～60℃
延伸：加熱至72℃左右 70～75℃
靶序列
靶序列
目的基因的雙鏈模板在熱力作用下， 斷裂，形成單鏈DNA;
氫鍵
（加熱至90～95℃）
PCR 循環(huán)第一步：高溫變性
靶序列
靶序列
引物 Ⅰ
引物 Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
與單鏈模板相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合
引物
（冷卻至55～60℃）
PCR 循環(huán)第二步 ：引物與靶序列復(fù)性
靶序列
靶序列
引物Ⅰ
引物Ⅱ
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Taq DNA
聚合酶
在 作用下進(jìn)行延伸。
DNA聚合酶（Taq酶）
（加熱至70～75℃）
PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸
PCR技術(shù) VS DNA復(fù)制
歸納對(duì)比
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}
PCR技術(shù)
DNA復(fù)制
相同點(diǎn)
原 理
堿基互補(bǔ)配對(duì)
原 料
四種脫氧核苷酸
條 件
模板、能量、酶
不同點(diǎn)
解旋方式
DNA在高溫下變性解旋
解旋酶催化
場(chǎng) 所
體外復(fù)制
細(xì)胞核內(nèi)
酶
熱穩(wěn)定的DNA聚合酶
細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶
結(jié) 果
大量的DNA片段
形成2個(gè)完整的DNA分子
目的基因以指數(shù)形式在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增。
1. 如果基因比較小，核苷酸序列又已知，可以通過(guò)
什么方法獲取目的基因？
深入思考：
可以通過(guò)DNA合成儀用
化學(xué)方法直接人工合成。
用化學(xué)方法人工合成
獲取目的基因
3
逆轉(zhuǎn)錄法
目的基因的mRNA
雙鏈DNA
（目的基因)
化學(xué)合成法
蛋白質(zhì)的氨基酸序列
mRNA序列
基因的核苷酸序列
目的基因
人工合成
逆轉(zhuǎn)錄酶
推測(cè)
推測(cè)
單鏈DNA
DNA聚合酶
對(duì)點(diǎn)練：利用PCR獲得和擴(kuò)增目的基因
01
【素養(yǎng)提升③】引物的設(shè)計(jì)：
1．PCR擴(kuò)增的 (填“是”或“不是”)
完整的模板DNA分子，
理由是 。
2．如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是 。
3.要保證目的基因能與載體相連接，要在兩種引物的 分別
添加上 。
不是
PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段
根據(jù)目的基因兩端（ ′端）的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物
5′端
限制酶的識(shí)別序列
3
對(duì)點(diǎn)練：利用PCR獲得和擴(kuò)增目的基因
01
【素養(yǎng)提升③】引物的設(shè)計(jì)：
4.圖2是某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理，
第1組不合理的原因： 。
第2組不合理的原因： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ會(huì)因局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效
引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)因出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效
設(shè)計(jì)引物的原則：
①兩種引物之間:
；
②每種引物內(nèi)部:
；
不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)
不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)

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