資源簡介

第一章　第二節　第2課時
基 礎 題 組
一、選擇題
1．(2024·四川成都高二校聯考期中)下圖是牛肉膏蛋白胨培養基的配方，據此分析下列相關敘述錯誤的是( )
成分 蛋白胨 牛肉膏 NaCl
含量 10.0 g 5.0 g 5.0 g
操作 將上述物質溶解后，用蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH為7.0～7.2
A.該培養基是液體培養基
B．該培養基是選擇培養基
C．該培養基中含有維生素
D．該培養基不適合霉菌生長
答案：B
解析：該培養基成分中無瓊脂，是液體培養基，A正確；從功能上說，牛肉膏蛋白胨培養基是通用(基礎)培養基，適合絕大多數細菌生長，不具有選擇性，B錯誤；牛肉膏和蛋白胨提供了維生素，C正確；霉菌適合在酸性培養基中生長，D正確。故選B。
2．(2023·山東省煙臺市高三適應性測試)噬菌斑是在固體培養基上由一個噬菌體增殖并裂解宿主菌后形成透明的溶菌空斑，不同噬菌體噬菌斑的形態大小不同。工作人員將0.1 mL稀釋106倍的噬菌體樣品與敏感細菌混合后平鋪在平板上培養一段時間，得到如圖所示結果。下列敘述錯誤的是(　　 )
A．噬菌體樣品應有足夠的稀釋度，以保證初期一個細菌最多被一個噬菌體吸附
B．根據培養基上噬菌斑的數量可以計算出敏感細菌和噬菌體的數量
C．若平均每個平板的噬菌斑數量為150，則該樣品中實際噬菌體數可能高于1.5×109個/mL
D．根據培養基上噬菌斑的形狀等特征可判斷是否需要進一步純化噬菌體
答案：B
解析：由題意“噬菌斑是在固體培養基上一個噬菌體增殖并裂解宿主菌后形成透明的溶菌空斑”可知，噬菌體樣品應有足夠的稀釋度，以保證初期一個細菌最多被一個噬菌體吸附，A正確；分析題意可知，噬菌斑是由噬菌體增殖并裂解宿主菌后形成的，不是細菌增殖造成的，所以不能計算出敏感細菌的數量，B錯誤；若平均每個平板的噬菌斑數量為150，則該樣品中計算出噬菌體數量為：150÷0.1×106＝1.5×109個/mL，但實際過程中，可能一個細菌不止被一個噬菌體吸附，所以該樣品中實際噬菌體數可能高于1.5×109個/mL，C正確；由題意“不同噬菌體噬菌斑的形態大小不同”可知，根據培養基上噬菌斑的形狀等特征可判斷是否需要進一步純化噬菌體，D正確。故選B。
3．原油中含有大量有害的、致癌的多環芳烴。土壤中有些細菌可以以原油中的多環芳烴為碳源，在培養基中形成分解圈。為篩選出能高效降解原油的菌種，某小組同學設計了相關實驗。下列有關敘述不正確的是(　　 )
A．應配制被原油污染土壤的土壤稀釋液備用
B．配制以多環芳烴為唯一碳源的選擇培養基
C．將土壤稀釋液滅菌后接種到選擇培養基上
D．在選擇培養基上能形成分解圈的為所需菌種
答案：C
解析：被原油污染的土壤中含有更多的能夠降解原油的細菌，A正確；為篩選出能高效降解原油的菌種，選擇培養基應以多環芳烴作為唯一碳源，在該選擇培養基上能形成分解圈的為所需菌種，B、D正確；所需的菌種在土壤稀釋液中，土壤稀釋液不能進行滅菌，C錯誤。
4．在做分離分解尿素的細菌實驗時，甲同學從對應稀釋倍數為106的培養基上篩選出大約150個菌落，而其他同學只篩選出大約50個菌落。下列有關敘述，出現科學性錯誤的是(　　 )
A．甲同學出現這種結果的原因可能是土樣不同，也可能是操作過程出了問題
B．可以將甲同學配制的培養基在不加土樣的情況下進行培養作為空白對照，以證明培養基是否受到污染
C．讓其他同學用與甲同學一樣的土壤進行實驗，如果結果與甲同學一致，則可以證明甲同學無誤
D．B、C選項的實驗思路都遵循了實驗的對照原則
答案：D
解析：甲同學獲得的菌落數遠大于其他同學，可能是由于所取的土樣不同，也可能是由于操作過程中被污染，A正確；被污染可能是因為培養基滅菌不徹底，或操作過程中沒有保證無菌操作，將甲同學配制的培養基在不加土樣的情況下進行培養作為空白對照，可以證明培養基是否受到污染，B正確；若題述結果是土樣不同造成的，讓其他同學用與甲同學一樣的土壤進行實驗，如果結果與甲同學一致，則可以證明甲同學操作正確，C正確；B選項的實驗思路遵循了實驗的對照原則，C選項的實驗思路遵循了實驗的重復原則，D錯誤。
5．用10、102和103倍稀釋液進行涂布培養細菌后，其菌落平均數為2 890、270和50，則每毫升樣品中菌落總數(涂布平板時所用的稀釋液體積為0.1 mL)為(　　 )
A．2.89×105個 B．3.85×105個
C．6.0×105個 D．2.7×105個
答案：B
解析：計數時一般選擇平均菌落數在30～300之間的平板，題中所給菌落數在30～300之間的為270和50，應取二者的平均值進行計算，根據公式每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×M，故每毫升菌落總數為(270÷0.1×102＋50÷0.1×103)÷2＝3.85×105(個)。
6．(2024·福建省漳州市教學質量檢測)某學者用“影印培養法”研究大腸桿菌抗藥性形成與環境的關系：將原始敏感菌種接種在1號培養基上，培養出菌落后，將滅菌絨布在1號上印模，絨布沾上菌落并進行轉印，使絨布上的菌落按照原位接種到2號和3號培養基上。待3號上長出菌落后，在2號上找到對應的菌落，然后接種到不含鏈霉素的4號培養基中，培養后再接種到5號培養基上，重復以上步驟。實驗過程如圖所示。下列相關敘述錯誤的是(　　 )
A．大腸桿菌抗鏈霉素的變異可能是由基因突變引起的
B．1號和5號采用稀釋涂布平板法將菌種接種在相應的培養基上
C．4號、8號、12號培養基中抗性菌落(株)的比例最大的是4號
D．大腸桿菌抗藥性的形成是在施加鏈霉素之前，而發生選擇作用是在施加鏈霉素之后
答案：C
解析：大腸桿菌是原核生物，大腸桿菌抗鏈霉素的性狀可能是由基因突變引起的，A正確；由圖可知，1號和5號采用稀釋涂布平板法將菌種接種在相應選擇培養基上，B正確；4號、8號、12號培養基中，大腸桿菌抗鏈霉素菌株的比例逐漸增大，因此抗性菌落(株)的比例最大的是12號，C錯誤；微生物的抗藥性突變是自發產生的，環境只能對抗藥性突變進行選擇，因此大腸桿菌抗藥性的形成是在施加鏈霉素之前，而發生選擇作用是在施加鏈霉素之后，D正確。故選C。
二、非選擇題
7．(2023·湖北宜昌高二校聯考期中)研究者從溫泉中篩選出高效產生耐高溫淀粉酶的嗜熱菌，其篩選過程如圖1所示。回答下列問題：
(1)該培養基中必須以________作為唯一的碳源。
(2)Ⅰ號、Ⅱ號培養基都屬于固體培養基，配置時__________________(填“先調pH后滅菌”或“先滅菌后調pH”)。Ⅱ號培養基上的接種方法為__________，從其上挑取單個菌落進行液體培養后，可借助特定的__________________或____________________采用__________進行直接計數，該方法是一種常用的、快速直觀的測定微生物數量的方法。
(3)挑選出能產生耐高溫淀粉酶的嗜熱菌菌落的鑒別方法是：將得到的菌懸液轉接于同時含有葡萄糖和淀粉為碳源的固體培養基上培養，得到若干菌落后用________作顯色處理，得到如圖2所示結果，可判斷圖中________________的菌落含有所需菌種。
答案：(1)淀粉
(2)先調pH后滅菌　平板劃線法　細菌計數板　血細胞計數板　顯微鏡
(3)碘液　周圍不顯藍色
解析：(1)分析題意，本實驗目的是篩選高效產生耐高溫淀粉酶的嗜熱菌，則應以淀粉為唯一碳源，在該培養基上只有能分解淀粉的微生物能生長。(2)為避免雜菌污染，配置時應先調pH后滅菌；據圖可知，Ⅱ號培養基中是劃線分布，故接種方法是平板劃線法；微生物的直接計數方法是細菌計數板(適用于細胞小的)或血細胞計數板(適用于細胞大的)；常用的、快速直觀的測定微生物數量的方法是顯微鏡直接計數。(3)淀粉與碘液反應呈藍色，但如果淀粉分解菌中的淀粉酶將淀粉水解后就不能呈藍色，則會出現無色的透明圈，故圖乙所示情況中周圍不顯藍色的菌落含有所需菌種。
能 力 提 升
一、選擇題
1．下表為培養某種微生物的培養基配方，下列相關敘述錯誤的是( )
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O FeSO4 (CH2O) H2O 青霉素
含量 3 g 1 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 30 g 1 L 0.1萬單位
A.依物理性質劃分，該培養基屬于液體培養基
B．由培養基的原料可知，所培養微生物的同化作用類型是異養型，培養的微生物可以是酵母菌
C．培養基中的唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3
D．若用該培養基培養纖維素分解菌，則應除去(CH2O)，再添加纖維素
答案：D
解析：由培養基配方表可知，該培養基中沒有加入瓊脂，屬于液體培養基，A正確；(CH2O)屬于有機碳源，因此所培養微生物的同化作用類型是異養型，培養的微生物可以是酵母菌，B正確；能為微生物的生長繁殖提供所需碳元素的物質叫碳源，能為微生物的生長繁殖提供所需氮元素的物質叫氮源，該培養基中唯一碳源是(CH2O)，唯一氮源是NaNO3，C正確；纖維素分解菌是細菌，青霉素對其具有殺滅作用，故若用該培養基培養纖維素分解菌，則應除去(CH2O)和青霉素，再添加纖維素，D錯誤。
2．某小組的同學為了調查湖水中細菌的污染情況而進行了實驗，包括制備培養基、滅菌、接種及培養、菌落觀察與計數。下列與此實驗相關的敘述中，正確的是(　　 )
A．實驗用過的帶菌培養基經過加熱后才能倒掉
B．利用平板劃線法對細菌進行分離純化并計數
C．觀察細菌培養的實驗中，最好是在另一平板上接種清水作為對照實驗
D．培養基中含有的蛋白胨、淀粉可分別為細菌培養提供氮源和碳源
答案：D
解析：實驗用過的帶菌培養基，需要用濕熱滅菌(高壓蒸汽滅菌)法滅菌后才能倒掉，以免污染環境，A錯誤；利用平板劃線法可以對細菌進行分離純化，但是不能計數，應利用稀釋涂布平板法對細菌進行分離純化并計數，B錯誤；要使該實驗所得結果可靠，還應該同時在另一平板上接種無菌水作為對照實驗，C錯誤；培養基中含有的蛋白胨、淀粉可分別為細菌培養提供氮源和碳源，蛋白胨也可以提供碳源，D正確。
3．下列關于測定土壤中微生物數量的敘述，不正確的是(　　 )
A．顯微鏡直接計數計算的結果比實際值偏大
B．當樣品的稀釋度足夠高時，一個活菌會形成一個菌落
C．采用稀釋涂布平板計數法獲得的菌落數往往少于實際的活菌數
D．統計菌落數目時，只要菌落數目在30～300的平板都可以計數，并以它們的平均值作為統計結果
答案：D
解析：利用稀釋涂布平板法計數時，當稀釋倍數適宜的情況下才可以計數其菌落數在30～300的平板，稀釋倍數不足或過大時，會影響計數結果，所以D錯誤。
4．某些土壤細菌可將尿素CH4N2O分解為CO2和NH3，供植物吸收和利用，但分解物CO2不能為該菌提供營養。下列關于配制分離這一菌種的選擇培養基的成分符合要求的是(　　 )
A．僅尿素 B．尿素＋葡萄糖
C．僅葡萄糖 D．牛肉膏蛋白胨
答案：B
解析：配制該培養基時應選尿素為唯一氮源，同時，該菌不能以分解物CO2為營養，即該菌為異養的，應加入葡萄糖來提供碳源，因此應選B。
5．(2024·浙江校聯考)嗜熱菌又稱高溫細菌，是一類生活在高溫環境中的微生物。研究者從溫泉中篩選高效產生高溫淀粉酶的嗜熱菌，其篩選過程如圖1所示。將得到的菌懸液轉接于同時含有葡萄糖和淀粉作碳源的固體培養基上培養，得到若干菌落后用碘液作顯色處理，結果如圖2所示。下列說法正確的是(　　 )
A．甲、乙試管為液體培養基，液體培養基能分離獲得嗜熱菌單菌落
B．只有能產生淀粉酶的微生物才能在I、Ⅱ號培養基上生長
C．丙試管中嗜熱菌數量迅速增加，培養過程中需保證充足的營養和室溫條件
D．圖2中周圍不顯藍色的菌落含有所需的嗜熱菌
答案：D
解析：甲、乙試管為液體培養基，液體培養基不能分離出單菌落，A錯誤；結合題干可知，只有能產生高溫淀粉酶的微生物才能在I、Ⅱ號培養基上生長，B錯誤；結合題干可知，丙中噬熱菌數量迅速增加，培養過程中需保證充足的營養和高溫條件，C錯誤；圖2中周圍不顯藍色的菌落，說明其產生的淀粉酶可以在高溫下分解淀粉，所以周圍不顯藍色的菌落含有所需的嗜熱菌，D正確。故選D。
6．(2024·河北模擬預測)釀酒酵母菌種的性能是決定果酒品質的重要因素。如圖表示從土壤中篩選釀酒酵母的過程。下列敘述正確的是(　　 )
A．圖示接種方法為稀釋涂布平板法，據結果推測1 g土壤中酵母菌數最多為1.6×106(個)
B．分離、純化酵母菌時，還可采用平板劃線法且該方法也需要進行③步驟操作
C．獲得釀酒酵母純培養物的關鍵是防止雜菌污染，故應對土壤、培養基及用具進行滅菌
D．進行步驟⑤時，應用液體培養基培養④中的酵母菌，并檢測酵母菌的數量和酒精含量
答案：D
解析：圖示接種方法為稀釋涂布平板法，據結果推測1 g土壤中酵母菌數為1.6×106(個)，該方法估算值低于真實數值，故1 g土壤中酵母菌數最少為1.6×106(個)，A錯誤；分離、純化酵母菌時，還可采用平板劃線法但該方法不需要進行③步驟操作，B錯誤；對土壤滅菌可將其中的釀酒酵母殺死，將不能獲得釀酒酵母的純培養物，C錯誤；用經過④純化的菌種，需要檢測酵母菌的數量和酒精含量，然后進行步驟⑤，D正確。故選D。
二、非選擇題
7．金黃色葡萄球菌具有高度耐鹽性，在血平板(培養基中添加適量血液)上生長時，可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色。下面是某研究小組測定某水樣中金黃色葡萄球菌濃度的實驗操作。請回答下列問題：
(1)金黃色葡萄球菌的培養基為質量分數為7.5%的NaCl牛肉膏蛋白胨培養基，此培養基能為金黃色葡萄球菌的生長提供__________________________。培養基中加入質量分數為7.5%的NaCl利于金黃色葡萄球菌的篩選，原因是__________________________________________________。
(2)上述培養基的滅菌方法是______________________________。在制作血平板時需等平板________后，方可加入血液，以防止__________________。
(3)現將10 mL菌液進行梯度稀釋，依次稀釋成10、102、103、104倍的4個稀釋樣液，再取4個稀釋樣液各0.1 mL分別接種到4組血平板上(每組3個，每個接種0.1 mL)，所用方法是__________________。在血平板上，金黃色葡萄球菌菌落的周圍會出現_____________________。若在103倍稀釋液的3個血平板上，金黃色葡萄球菌菌落數分別為35、36和37，則每升水樣中的活菌數約為_______________。
答案：(1)碳源、氮源、水和無機鹽　不影響金黃色葡萄球菌生長的同時抑制其他菌的生長
(2)濕熱滅菌(高壓蒸汽滅菌)法　冷卻　高溫破壞血細胞
(3)稀釋涂布平板法　透明圈(溶血圈) 　3.6×108個
解析：(1)培養基能為微生物的生長提供碳源、氮源、水和無機鹽。因為金黃色葡萄球菌具有高度耐鹽性，培養基中加入質量分數為7.5%的NaCl不影響金黃色葡萄球菌的生長，但會抑制其他菌的生長，因此利于金黃色葡萄球菌的篩選。(2)對培養基滅菌常用濕熱滅菌法或高壓蒸汽滅菌法。在制作血平板時需等平板冷卻后，方可加入血液，以防止高溫破壞血細胞。(3)現將10 mL菌液進行梯度稀釋，依次稀釋成10～104倍的4個稀釋樣液，再取4個稀釋樣液各0.1 mL分別接種到4組血平板上(每組3個，每個接種0.1 mL)，則所用方法是稀釋涂布平板法。金黃色葡萄球菌在血平板(培養基中添加適量血液)上生長時，可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色。因此在血平板上，金黃色葡萄球菌菌落的周圍會出現透明圈(溶血圈)。若在103組的3個血平板上，金黃色葡萄球菌菌落數分別為35、36和37，則每升水樣中的活菌數約為×103××1 000＝3.6×108(個)。
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第1章　發酵工程
第2節　微生物的培養技術及應用
第2課時　微生物的選擇培養和計數
知識點一　發酵與傳統發酵技術
基礎知識·雙基夯實
1．概念：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱為選擇培養基。
2．實例：篩選土壤中分解尿素的細菌的選擇培養基以___________
______。
3．原理：人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養、溫度和pH等)，同時抑制或阻止其他微生物的生長。
氮源
尿素為唯一
1．選擇分解尿素的細菌的培養基為液體培養基。(　　 )
2．可以篩選出石油降解菌的培養基為鑒別培養基。(　　 )
×
×
1.要分離出分解纖維素的微生物，應在什么樣的環境中取土樣？應配制什么樣的培養基？
提示：應從富含纖維素的環境中取土樣，如樹林中多年落葉形成的腐殖土。應配制以纖維素為唯一碳源的培養基。
2．根據選擇培養基的原理，如何篩選出耐酸菌？
提示：可將培養基的pH調至酸性，再接種培養。
課內探究·名師點睛
1．選擇培養微生物的四種方法及其實例
選擇培養原理 具體處理 分離菌種
利用營養缺陷型選擇培養基進行的選擇培養 不加含碳有機物的無碳培養基 分離自養型微生物
無氮培養基 分離自生固氮微生物
選擇培養原理 具體處理 分離菌種
利用微生物(目的菌)對某種營養物質的特殊需求，使該營養物質成為某類微生物的唯一供給者 石油作為唯一碳源的培養基 分離能消除石油污染的微生物
尿素作為唯一氮源的培養基 分離能分解尿素的微生物
在完全培養基中加入某些化學物質，利用加入的化學物質抑制部分微生物生長或利于部分微生物生長 加入青霉素等抗生素 分離酵母菌和霉菌等真菌，同時抑制細菌、放線菌的生長
加入高濃度的食鹽 分離金黃色葡萄球菌
選擇培養原理 具體處理 分離菌種
在高鹽環境中 可分離耐鹽菌，其他菌在高鹽濃度下易失水而不能生存
在高溫環境中 可分離得到耐高溫的微生物，其他微生物在高溫環境中因酶失活而無法生存
2.尿素分解菌的鑒定
在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的脲酶將尿素分解成了NH3。NH3會使培養基的堿性增強，pH升高。在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，培養某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，則可初步說明該種細菌能夠分解尿素。
3．鑒別培養基
(1)特點：根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品。
(2)用途：鑒別不同種類的微生物(如可用伊紅—亞甲藍瓊脂培養基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌。若有，菌落呈現深紫色)。
1.選擇培養基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物，通過不含有機物的培養基、缺氮培養基、含尿素(不含其他氮源)的培養基，可從土壤中分離出的微生物依次是(　　 )
A．硝化細菌、放線菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．異養細菌、放線菌、硝化細菌
D．自養細菌、固氮菌、分解尿素的細菌
答案：D
解析：不含有機物的培養基可以選擇自養微生物，缺少氮元素的培養基可以選擇固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培養基可以選擇能分解尿素的微生物。
能在選擇培養基上生長的不一定是所需要的目的菌。原則上選擇培養基只允許特定種類的微生物生長，但實際上，微生物的培養是一個非常復雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產物生長繁殖，因此能在選擇培養基上生長的微生物不一定都是所需的微生物，還需進一步的鑒定。
變式訓練 (2024·錦州期末)大腸桿菌的含量是國家飲用水重要檢測指標之一，如圖所示，用濾膜法和伊紅—亞甲藍瓊脂培養基(EMB培養基)測定水中大腸桿菌含量的大致流程為準備工作→用濾膜過濾待測水樣→將濾膜轉移到EMB培養基上→培養→觀察并統計菌落數目。下列敘述正確的是(　　 )
伊紅—亞甲藍瓊脂培養基配方
基礎培養基　　　　　　　 100 mL
　20%乳糖溶液 2 mL
　2%伊紅水溶液 2 mL
　0.5%亞甲藍水溶液 1 mL
　瓊脂 1.5 g
A．EMB培養基從用途來分屬于選擇培養基
B．配方的基礎培養基中除水外還必須含有無機鹽和碳源
C．觀察并統計菌落數目時，應選擇培養基上的深紫色菌落進行計數
D．選用濾膜孔徑的大小不會影響實驗結果
答案：C
解析：EMB培養基從用途來分屬于鑒別培養基，A錯誤；配方的基礎培養基中除水外還必須含有無機鹽和氮源，乳糖可作為碳源，B錯誤；大腸桿菌在EMB培養基上可呈深紫色，并有金屬光澤，觀察并統計菌落數目時，應選擇培養基上的深紫色菌落進行計數，C正確；選用濾膜孔徑過大可能會導致實驗結果比實際值偏小，D錯誤。
知識點二　微生物數量測定方法分析
基礎知識·雙基夯實
一、微生物的選擇培養
1．菌液稀釋
(1)將10 g土樣加入盛有_______mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，得到稀釋10倍的菌液。
(2)取1 mL上清液加入盛有9 mL無菌水的試管中，得到稀釋102倍的菌液，依次等比稀釋。
90
2．稀釋涂布平板法的操作步驟
涂布平板：用涂布器將_______均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻
3．待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30～37 ℃的恒溫培養箱中培養1～2 d。
4．結果：在涂布有合適濃度菌液的平板上觀察到分離的單菌落。
菌液
二、微生物的數量測定
1．常用方法：_________________和顯微鏡直接計數法。
2．稀釋涂布平板法統計樣品中活菌的數目
(1)為了保證結果準確，同一稀釋度下，應至少設3個平板，一般選擇菌落數在_________________________的平板進行重復計數，并取平均值。
(2)統計的菌落數往往比活菌的實際數目少，因為________________
_____________，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示。
稀釋涂布平板法
30～300，適于計數
當兩個或多個細胞
連在一起時
3．利用顯微鏡進行直接計數
(1)工具：特定的細菌計數板或血細胞計數板。
(2)統計的結果一般是活菌數和死菌數的總和。
特別提醒：顯微鏡直接計數法本身不能區分細菌的死活，因此一般用來統計總菌數。但是，通過一定的輔助處理，可以實現活菌計數，如在計數前用臺盼藍染液進行染色，可以通過統計無色細胞的個數來對活菌進行計數。
1．用平板劃線法培養計數，應選擇菌落數在10～100的平板。(　　 )
2．利用稀釋涂布平板法統計菌落數目的理論依據是當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌。(　　 )
×
√
1.為什么一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數？
提示：若平板上菌落數過多，說明稀釋度過低，菌體的密度大，就會出現更多的兩個或兩個以上的菌體形成的菌落，結果不準確，且計數較困難。若平板上菌落數過少，菌落形成的偶然性大，結果也不準確。
2．稀釋涂布平板法和顯微計數法對微生物計數產生的實驗誤差如何？試分析原因。
提示：稀釋涂布平板法計數的值比實際值小，原因是當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落；顯微計數法計數的結果比實際值大，原因是顯微鏡下無法區分細胞的死活，計數時包括了死細胞。
3．在稀釋涂布平板法中，為何需至少涂布3個平板？
提示：作為重復實驗，統計時取平均值，以減少偶然因素對實驗結果的影響，增強實驗結果的說服力。
4．為什么要選取菌落數目穩定時的記錄作為結果？
提示：盡量縮小統計的菌落數與實際活菌數的差值，因為繁殖慢的菌體開始看不出明顯的菌落。(或：可以防止培養時間不足而導致遺漏菌落。)
課內探究·名師點睛
1．微生物數量測定方法
微生物數量測定的常用方法有稀釋涂布平板法、顯微鏡直接計數法等。二者的比較如下表所示：
項目 顯微鏡直接計數法 稀釋涂布平板法(間接計數法)
原理 利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計數一定容積的樣品中微生物的數量 當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約有多少活菌
主要用具 顯微鏡、細菌計數板(或血細胞計數板) 培養基
項目 顯微鏡直接計數法 稀釋涂布平板法(間接計數法)
計數數據 菌體本身 培養基上的菌落數
優點 計數方便、操作簡單 計數的是活菌
缺點 死菌、活菌都計算在內 操作較復雜，有一定誤差
計算公式 每毫升原液含菌數＝每小格平均菌體數×400×10 000×稀釋倍數 每毫升原液含菌數＝培養基上平均菌落數×稀釋倍數 ÷涂布液體積
2.平板劃線法與稀釋涂布平板法的比較
項目 平板劃線法 稀釋涂布平板法
工具 接種環 涂布器
分離
單菌
落的
原理 通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。在數次劃線后培養，可以分離到由一個細菌細胞繁殖而來的肉眼可見的細胞群體，即菌落 將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細菌細胞，從而能在培養基表面形成單個菌落
特點 可以分離得到單菌落，且操作簡單，但不宜計數 可以分離得到單菌落，可以計數，但操作復雜
2.(2024·長春聯考)平板劃線法和稀釋涂布平板法是純化微生物的兩種常用方法，下列描述正確的是(　　 )
A．都要將菌液進行一系列的梯度稀釋
B．平板劃線法是將不同稀釋度的菌液通過接種環在固體培養基表面進行連續劃線的操作
C．稀釋涂布平板法是將不同稀釋度的菌液倒入液體培養基進行培養
D．都是在固體培養基上進行的，都需要在酒精燈火焰旁進行接種
答案：D
解析：平板劃線法不需要進行梯度稀釋，A、B均錯誤；稀釋涂布平板法是將不同稀釋度的菌液滴加到固體培養基的表面，然后用涂布器將菌液均勻涂布在培養基表面，C錯誤；稀釋涂布平板法和平板劃線法都需要形成單菌落，都必須在固體培養基上進行接種，且均需無菌操作，都需要在酒精燈火焰旁進行接種，D正確。
稀釋涂布平板法計數的幾個注意事項
(1)為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。
(2)要設置對照實驗，且一定要涂布至少3個平板作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。
(3)計數時機：每隔24 h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。
(4)用此種方法統計的菌落數目往往比活菌的實際數目低。這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示。
變式訓練 下列有關稀釋涂布平板法計數和顯微鏡直接計數法的描述不正確的是(　　 )
A．利用血細胞計數板計數屬于顯微鏡直接計數法，其缺點是不能區分死菌與活菌
B．兩種計數方法，其統計值與實際值相比，均有差異，但差異原因不同
C．兩種計數方法均能在計數的同時觀察到所研究微生物的形態特征
D．當菌落數目穩定時，一般選取菌落在30～300的且差異不大的平板進行計數
答案：C
解析：顯微鏡直接計數法只能看到細菌，無法區分死菌和活菌，A正確；稀釋涂布平板法計數中，當多個細菌連在一起時，平板上觀察到的往往是一個菌落，故而統計值比實際值小，顯微鏡直接計數法不能區分死菌和活菌，故測定的微生物數量往往大于實際的活菌數，因此兩種計數方法的統計值與實際值相比均有差異，但差異原因不同，B正確；稀釋涂布平板法觀察到的是菌落的形態特征，而不是微生物的形態特征，顯微鏡直接計數法觀察到的是微生物的形態特征，C錯誤；當菌落數目穩定時，一般選取菌落在30～300的且差異不大的平板進行計數，D正確。
知識點三　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的實驗操作
基礎知識·雙基夯實
1．分離原理：土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成_______。利用尿素作為唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。
脲酶
2．操作步驟
(1)土壤取樣
土壤中的微生物主要分布在距地表3～8 cm的土壤層(酸堿度接近中性)，取樣時用的鐵鏟和取樣袋使用前都需要滅菌。
(2)樣品的稀釋
為保證獲得菌落數為30～300的平板進行計數，可將稀釋倍數為1×103～1×107的稀釋液分別涂布到平板上培養。
(3)微生物的培養與觀察
不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌一般在30～37 ℃的溫度下培養1～2 d(放線菌一般在25～28 ℃的溫度下培養5～7 d；霉菌一般在25～28 ℃的溫度下培養3～4 d)。在菌落計數時，每隔24 h統計一次菌落數目，選取_______________時的記錄作為結果。
菌落數目穩定
1．分解尿素的細菌在分解尿素時，可以將尿素轉化為氨，使得培養基的pH降低。(　　 )
2．在用涂布器涂布平板時，為了操作方便可完全打開培養皿的皿蓋。(　　 )
3．利用稀釋涂布平板法和平板劃線法均可實現細菌的分離和計數。(　　 )
×
×
×
甲、乙兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數。在對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下兩種統計結果。
(1)甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為230，該同學的統計結果是否真實可靠？為什么？
(2)乙同學在該濃度下涂布了3個平板，統計的菌落數分別為21、212、256，該同學將21舍去，然后取平均值。該同學對實驗結果的處理是否合理？為什么？
(3)某同學在三種稀釋度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，統計菌落數，得到了以下的數據，試計算1 g樣品的活菌數。
平板
菌落
稀釋度 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
提示：(1)不可靠。為增強實驗的說服力與準確性，應設置重復實驗，在同一稀釋度下涂布至少3個平板，統計結果后計算平均值。
(2)不合理。微生物計數時，如果實驗中出現重復實驗結果不一致的情況，應分析實驗過程中可能的影響因素，找出差異的原因，需重新實驗，而不能簡單地舍棄。
(3)105的稀釋度下取0.1 mL涂布的三個平板上的菌落數在30～300，計算其平均值為(212＋234＋287)/3≈244。進一步可以換算出1 g樣品中活菌數為(244÷0.1)×105＝2.44×108。
課內探究·名師點睛
1．實驗設計流程
2．結果分析與評價
內容 現象 結論
有無雜菌污
染的判斷 對照的培養皿中無菌落生長 未被雜菌污染
選擇培養基中菌落數偏高 被雜菌污染
菌落形態多樣，菌落數偏高 培養基中混入其他氮源
選擇培養基的篩選作用 牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數目大于選擇培養基上的數目 選擇培養基具有篩選作用
樣品的稀釋操作 得到2個或2個以上菌落數目在30～300的平板 操作成功
重復組的結果 若選取同一種土樣，統計結果應接近
3.如圖為土壤中分解尿素的細菌的分離與計數實驗中樣品稀釋示意圖。據圖分析，下列敘述正確的是(　　 )
A．3號試管的稀釋倍數為103倍
B．4號試管中稀釋液進行平板培養得到的菌落平均數恰好為5號試管的10倍
C．5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為1.7×109個
D．該實驗方法統計得到的結果往往會比實際活菌數目要多
答案：C
解析：分析題圖可知，3號試管的稀釋倍數為104倍，A錯誤；4號試管中稀釋液進行平板培養得到的菌落平均數不一定恰好為5號試管的10倍，B錯誤；5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(個)，C正確；在固體培養基上可能存在兩個或多個菌體形成一個菌落的情況，因此用稀釋涂布平板法得到的結果往往會比實際活菌數目少，D錯誤。
變式訓練 分解尿素的微生物廣泛存在于農田等土壤中，下列關于對分解尿素的微生物進行分離和計數的操作正確的是(　　 )
A．分解尿素的微生物含有脲酶，因此配制培養基時應選擇包括尿素在內的多種物質作為氮源
B．培養基中添加酚紅作為指示劑，培養后，培養基pH會降低，可使指示劑變紅色
C．在接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先培養一段時間，目的是檢測培養基平板滅菌是否合格
D．計數時，在同一稀釋度下，任取3個平板對其中的菌落數進行統計，取其均值即可
答案：C
解析：分解尿素的微生物含有脲酶，配制分解尿素的培養基時應以尿素作為唯一氮源；培養基中添加酚紅作為指示劑，培養后，細菌合成的脲酶將尿素分解為氨，培養基的堿性增強，pH升高，可使指示劑變紅色；為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。
指點迷津·撥云見日
不能理解“多次劃線”與“逐步稀釋分散成單菌落”的關系
平板劃線法中通過“多次劃線”操作，達到“逐步稀釋分散成單個菌落”的結果。具體分析如下：
(1)通過每次劃線稀釋菌種，線條末端菌體數少于線條首端。
(2)每次劃線前灼燒接種環，殺死接種環上的微生物，保證下一次劃線的菌種來自上一次劃線的末端。再次通過劃線稀釋菌種，依次類推，得到單個菌落。
4.下圖中甲是稀釋涂布平板法中的部分操作，乙是平板劃線法的劃線操作。下列敘述中錯誤的是(　　 )
A．甲圖中涂布前要將涂布器灼燒，冷卻后才能涂菌液
B．甲、乙兩圖的操作中只有甲可以用于微生物的計數
C．乙圖中接種環需要灼燒5次
D．乙圖中連續劃線的起點是上一次劃線的末端
答案： D
解析：甲圖中采用了稀釋涂布平板法，涂布前要將涂布器灼燒，冷卻后才能涂菌液，A項正確；乙圖的操作對應平板劃線法，無法用于微生物的計數，B項正確；乙圖平板中劃了5個區域，因此操作過程中接種環需要灼燒6次，C項錯誤；乙圖中每次劃線的起點是上一次劃線的末端，D項正確。
1.選擇培養基是指允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。
2．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素為唯一氮源的選擇培養基分離能分解尿素的細菌。
3．為確保結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。
4．當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。
5．稀釋涂布平板法統計的菌落數往往比活菌的實際數目少，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
課堂達標·鞏固訓練
1．分離土壤中分解尿素的細菌，對培養基的要求是(　　 )
①加尿素　②不加尿素　③加瓊脂　④不加瓊脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸鹽　⑧不加硝酸鹽
A．①③⑤⑧
B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑦
D．①④⑥⑦
答案：A
解析：要分離分解尿素的細菌應以尿素為唯一氮源，①正確、 ②錯誤；分離土壤中分解尿素的細菌用固體培養基，需加入瓊脂，③正確，④錯誤；培養基中需要加碳源即葡萄糖，⑤正確，⑥錯誤；不需要其他氮源，故不加硝酸鹽，⑦錯誤，⑧正確。故符合題意的有①③⑤⑧，A正確。
2．用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落數就能推測出樣品中的活菌數。原因是(　　 )
A．平板上的一個菌落就是一個細菌
B．菌落中的細菌數是固定的
C．此時的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌
D．此方法統計的菌落數一定與實際的活菌數相同
答案：C
解析：用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌，偶爾會來自兩個或更多個活菌。
3．請分析以下材料，并回答問題：
材料一：硝化細菌是一類能進行化能合成作用的細菌，包括亞硝酸細菌和硝酸細菌兩個菌群，這兩個菌群通常生活在一起。亞硝酸細菌可將氨氧化成亞硝酸，硝酸細菌可將亞硝酸氧化成硝酸，氨和亞硝酸分別是亞硝酸細菌和硝酸細菌的唯一能源。
材料二：可利用以下兩種選擇培養基，通過振蕩培養從土壤中分離得到較純凈的硝酸細菌和亞硝酸細菌。
1號選擇培養基 2號選擇培養基
(NH4)2SO4 NaNO2
NaCl MnSO4
FeSO4 Na2CO3
K2HPO4 K2HPO4
MgSO4 MgSO4
CaCO3 NaH2PO4
蒸餾水 蒸餾水
答案：(1)NaNO2　缺乏亞硝酸細菌生長繁殖所需的唯一能源物質氨
(2)好氧
(3)瓊脂　(NH4)2SO4(或NH)　稀釋涂布平板　菌落
解析：材料一是回答(1)(2)(3)的依據；對材料二的分析應從表中成分的分析著手。

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