資源簡介

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動物細胞工程
第2章細胞工程
2006年，山中伸彌(S.Yamanaka,1962-) 等獲得了誘導(dǎo) 多能干細胞。我國科學(xué)家利用這種細胞培育出了小鼠。
1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年， 科學(xué)家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊。
1975年，米爾斯坦(C.Milstein,1927-
2002)和科勒(G.K hler,1946-1995) 等 創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)。
1959年試管兔誕生，之
后多種試管動物相繼出生。
1951年，張明覺(1908-1991)
等發(fā)現(xiàn)哺乳動物精子的獲能現(xiàn)象。
1981年，埃文斯(M.J.Evans,1941-) 等成功分離和培養(yǎng)小鼠的胚胎干細胞。
1958年，格 登(J.Gurdon,1933-) 用非洲爪 蟾進行體細胞核移植，成功培育出性成熟個體。 同一時期，童弟周(1902- 1979)等開展了魚類 細胞核移植工作。
1890年，希普 (W.Heape,1855-
1929)將安哥拉兔的胚胎移入比利時
兔的輸卵管內(nèi)，得到了兩只安哥拉兔，
這是世界上胚胎移植成功的首例。
1907年，哈 里 森(R.G.Harrion,1870-1959) 用一滴淋巴液 成功培養(yǎng)了蝌蚪的神經(jīng)元，首創(chuàng)了動物組織體外培養(yǎng)法。
動物細胞工程(含胚胎工程)
1996年，世界上第一只細胞克隆羊多莉在 英國誕生。隨后多種克隆動物相繼問世。
2014年，世界上第一個用單細胞基因組測 序進行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國誕生。
2017年，我國科學(xué)家首次培 育出體細胞克隆猴。
科技探索之路
從社會中來
在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人
的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健 康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產(chǎn)生 免疫排斥反應(yīng)。那么,怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚 能不能用自體皮膚的單個細胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚
可以從病人身上取少量正常、健康的皮膚在體外進行
培養(yǎng)、擴增； ——動物細胞培養(yǎng)
目前，科學(xué)家還在研究對皮膚干細胞進行培養(yǎng)，以獲
得適合臨床上使用的人造皮膚。 ——干細胞培養(yǎng)
通過細胞培養(yǎng)構(gòu)建的人造皮膚
動物細胞培養(yǎng)
從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后在適宜的培養(yǎng)條
件下，讓這些細胞生長和增殖的技術(shù)。
分散 單個細胞 適宜條件 細胞生長和增殖
原理： 細胞增殖
地 位 ：動物細胞工程的基礎(chǔ)
大 致 過 程 ： 動物體
組織
取出
動物體內(nèi)的細胞之所以能夠維持正常的生命活動，是因為機體給這些細胞提供了
適宜的條件，包括充足的營養(yǎng)和穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境等。動物細胞培養(yǎng)(模擬體內(nèi)細胞正常 生長增殖的環(huán)境 )也需要滿足這些條件。
無菌、無毒的環(huán)境；
適宜溫度、pH 和滲透壓； 適宜的氣體環(huán)境。
一 、動物細胞培養(yǎng)的條件
動物細胞 培養(yǎng)所需的
基本條件
糖類、氨基酸
、無機鹽、維 生素 ……
其他
條件
營養(yǎng)
條件
1.營 養(yǎng) 營養(yǎng) 條件：合成培養(yǎng)基+血清等天然成分
(1)已知營養(yǎng)成分 動物細胞常用的糖類是葡萄糖，與植物組織培養(yǎng)常用蔗糖不同 細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)(糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等);
將細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基稱為合成培 養(yǎng) 基。
(2)未知營養(yǎng)成分
血清(含人類未知、細胞生長增殖所必需的物質(zhì))等天然成分；
(3)培養(yǎng)基的類型(物理性質(zhì))
一般使用液體培養(yǎng)基，也稱為培養(yǎng)液。
一、動物細胞培養(yǎng)的條件
為什么對動物細胞進行培養(yǎng)時通常要添加血清
1、血清中含有必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)，這些都是細胞生長 和代謝所必需的。
2、血清中含有多種細胞生長因子，如上皮生長因子(EGF)、 血小板源生長因子 (PDGF)、 成纖維細胞生長因子(FGF) 等，這些因子可以促進細胞增殖和分化。
3、血清中含有多種激素，如胰島素和促生長激素，它們可以調(diào)節(jié)細胞的代謝和生 長。
4、血清中的某些成分(粘附分子)可以幫助細胞粘附到培養(yǎng)容器上，這對于許多 細胞系的生長是必要的。
5、血清中的某些成分可以結(jié)合和去除培養(yǎng)基中的有毒物質(zhì)，起到一定的解毒作用， 減少有毒物質(zhì)對細胞的毒害。
至今血清中仍有許多對細胞生長有利的因子未研究清楚。
血清中含有多種未知的促細胞生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，這是細胞生長和增殖所必需的。
2.無菌、無毒的環(huán)境
( 1 ) 無 菌 ： · 培 養(yǎng) 液、培養(yǎng)用具滅菌處理；
· 無菌操作；
· 適量添加抗生素。
( 2 ) 無 毒 ： · 定期更換培養(yǎng)液。
清除代謝物，防止代謝物積累對細胞自身造成危害。
一、動物細胞培養(yǎng)的條件
3.溫度、pH 和滲透壓
( 1 ) 溫 度 ：哺乳動物細胞培養(yǎng)的溫度多以36.5±0.5℃ 為宜；
(2)pH: 多數(shù)動物細胞生存的適宜pH 為 ；
(3)滲透壓：適宜的滲透壓維持細胞正常的形態(tài)和功能。
一、動物細胞培養(yǎng)的條件
4.氣體環(huán)境 O : 細胞代謝所必需
(1)氣體的組成及作用： 95%空氣 + 5%CO ;
(2)培養(yǎng)裝置：培養(yǎng)皿或 松蓋培養(yǎng)瓶
(3)培養(yǎng)儀器： CO 培養(yǎng)箱養(yǎng)
一、動物細胞培養(yǎng)的條件
CO : 維持培養(yǎng)液的pH
松蓋培養(yǎng)瓶
培養(yǎng)皿
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)
二、動物細胞培養(yǎng)的過程
分散成單個細胞
轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液進
放入CO 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
放入CO 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
制成細胞懸液
行原代培養(yǎng)
取動物組織
傳代培養(yǎng)
取材對象：一般取材于動物胚胎或幼齡動物的組織、器官。
取材原因：細胞分化程度低，增殖能力強，容易培養(yǎng)。
二、動物細胞培養(yǎng)的過程
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)
取動物組織
將動物組織塊剪碎 胰蛋白酶處理
制成細胞懸液 或膠原蛋白酶
思考：1.為什么要分散成單個細胞
動物細胞與細胞靠在一起，彼此限制了生長和增殖 ( 接
原代培養(yǎng) 觸抑制);
細胞與培養(yǎng)液充分接觸，有利于細胞生長和增殖。
傳代培養(yǎng) 2.用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理說明動物細胞間的物質(zhì)
主要是什么成分 蛋白質(zhì)
二、動物細胞培養(yǎng)的過程
取動物組織
分散成單個細胞
方法：機械方法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間。
將動物組織塊剪碎 胰蛋白酶處理
或膠原蛋白酶
思考：3.可以用胃蛋白酶來處理組織嗎
不可以，因為胃蛋白酶的最適PH為1.5左右；
4.胰蛋白酶處理時間過長，會怎樣
長時間會分解細胞膜蛋白，破壞細胞結(jié)構(gòu)，把 細 胞 消化掉。注意控制時間和酶用量。
二、動物細胞培養(yǎng)的過程
方法：機械方法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間。
制成細胞懸液
原代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)
取動物組織
分散成單個細胞
二、動物細胞培養(yǎng)的過程
取動物組織
分散成單個細胞 制成細胞懸液
制成細胞懸液
操作：往分散的單個細胞中加入培養(yǎng)液將細胞制成細胞懸液。
原代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)
原代培養(yǎng)：指動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)。
體外培養(yǎng)的動物細胞類型：
制成細胞懸液
原代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)
細胞密度過大、
有害代謝物積累、 營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等
接觸抑制
能夠懸浮在培養(yǎng)液
中生長增殖；
需要貼附于某些基
質(zhì)表面才能生長增 殖。(大多數(shù))
取動物組織
分散成單個細胞
二、動物細胞培養(yǎng)的過程
轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶進行原代培養(yǎng)
直接在培養(yǎng)皿進行原代培養(yǎng)
細胞分裂受阻
細胞懸液
轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶進行原代培養(yǎng)
直接在培養(yǎng)皿進行原代培養(yǎng)
原代培養(yǎng)細胞呈現(xiàn)的特點： 瓶壁上的細胞是單層細胞。
細胞貼壁 接觸抑制
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)
二、動物細胞培養(yǎng)的過程
細胞懸液
對細胞進行分瓶培養(yǎng)，讓 細胞繼續(xù)增殖。
培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面 光滑、無毒、易于貼附。
二、動物細胞培養(yǎng)的過程
388222 傳代培養(yǎng)
取動物組織
分散成單個細胞
傳代培養(yǎng)： 分瓶后的細胞培養(yǎng)。
思考：如何收集原代培養(yǎng)的細胞進行傳代培養(yǎng)
懸浮生長的細胞直接用離心法收集；
貼壁生長的細胞先用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細 胞，然后再用離心法收集。
制成細胞懸液
原代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)： 分瓶后的細胞培養(yǎng)。
思考：細胞可以一直進行傳代培養(yǎng)嗎
分瓶培養(yǎng)后的細胞一般傳至10代左右，細胞的生長、分裂就 會出現(xiàn)停滯，大部分細胞衰老死亡，但也有極少數(shù)細胞能存 活下來，并可傳至40-50代，這種傳代細胞稱為細胞株。
當(dāng)細胞株傳至50代以后會再次出現(xiàn)停滯，不能繼續(xù)傳代，但 有部分細胞的細胞核型(遺傳物質(zhì))發(fā)生了改變，并帶有癌變 的特點，從而有可能在適宜培養(yǎng)條件下無限傳代下去，這種 傳代細胞叫作細胞系。
二、動物細胞培養(yǎng)的過程
388222 傳代培養(yǎng)
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養(yǎng)
傳代培養(yǎng)
植物組織培養(yǎng)
動物細胞培養(yǎng)
原理 植物細胞的全能性
細胞增殖
培養(yǎng)前處理 離體
用機械法或胰蛋白酶、膠原蛋
白酶將組織細胞分散開
取材 離體植物器官、組織、細胞
動物胚胎或幼齡動物的組織、
器官
培養(yǎng)基的物理性質(zhì) 固體
液體(又稱培養(yǎng)液)
培養(yǎng)基的成分 水、有機營養(yǎng)成分、無機營 養(yǎng)成分、植物激素
糖類、氨基酸、無機鹽、維生素 等營養(yǎng)物質(zhì)及血清等天然成分
特有成分 植物激素
血清
相同點 細胞分裂方式都是有絲分裂；都要嚴(yán)格的進行無菌操作。
動物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的比較
3.分 類 ：
干細胞分類
按來源 按分化潛能
胚胎干細胞 成體干細胞 全能干細胞 多能干細胞 專能干細胞
1.概 念 ：干細胞是指動物和人體內(nèi)仍保留的少數(shù)具有分裂和分化能力的細胞。 在一定條件下，干細胞可以分化成其他類型的細胞。
2.分 布 ：早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中。
三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用
早期胚胎中
具 有分化為成年動物體內(nèi)的任何一種類型的細胞 ，并
進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。
在體外分化成心肌細胞、神經(jīng)元和造血干細胞等。
必須從胚胎中 獲 取 ，涉及倫理問題。
4.胚胎干細胞
分布
特點
應(yīng)用實例
ES細 胞
局限性
三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用
胚胎干細胞
造血干細胞 ( 骨髓、外周血和臍帶血中 )
神經(jīng)干細胞 (神經(jīng)系統(tǒng)中)
精原干細胞 (睪丸中)
具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織， 不具有發(fā)育成完整個體的能力
治療白血病及一些惡性腫瘤放 療或化療后引起的造血系統(tǒng)、 免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病
治療神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)系統(tǒng) 退行性疾病 (如帕金森病、阿 爾茨海默病等)
5.成體干細胞
分布 成體組織或器官內(nèi)
三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用
造血干細胞 →
神經(jīng)干細胞 →
舉例
特點
成體干細胞
應(yīng)用實例
通過體外誘導(dǎo)成纖維細胞、 T細胞和B細胞等得到的類似 胚胎干細胞的一種細胞
將特定基因，特定蛋白導(dǎo)入細胞；用小分子化合物誘導(dǎo)
形 成 。
誘導(dǎo)過程無須破壞胚胎；可以避免免疫排斥反應(yīng)。
可治療鐮狀細胞貧血癥；在治療阿爾茲海默病、心血管
疾病等領(lǐng)域的研究也取得新進展
來源
制備方法
優(yōu)點
應(yīng)用實例
Osteocytes
Neurons
Cardiac Cells
Enterocytes
三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用
6.誘導(dǎo)多能干細胞
誘導(dǎo)多能干細胞
iPS細胞
iPS Cells
Hepatocytes
Sox2 KIf4
OOc-Myc
Fibroblasts Oct4( IO iPSC
Pathological molecular
pathways
"P/an
Differentiation in the tissue
of interest
New drugs
Toxicity test
2006年，日本科學(xué)家山中伸彌，從24個對胚胎干細胞維持十分重要的基因 中篩選出4個基因組合(Oct4、Sox2、c-myc 和KLF4), 在小鼠的成纖維細胞 中誘導(dǎo)表達，成功誘導(dǎo)出一種多能干細胞，稱“誘導(dǎo)多能干細胞” (iPS 細 胞 ) , 并用iPS細胞治療了小鼠的鐮狀細胞貧血。
2012年山中伸彌與約翰 ·戈登一起獲得諾貝爾生理學(xué)獎或醫(yī)學(xué)獎。
iPSC reprogramming
c-Myc 作為原癌基因 ，一方面促進細胞的
自我更新，另一方面也增加了細胞的成瘤性。
Klf4
Oct3/4 Sox2
腫瘤細胞
RNA水平的重編程避免了 因為基因插入而導(dǎo)致的成瘤 風(fēng)險
抗體誘導(dǎo) 微流體技術(shù)大規(guī) 模誘導(dǎo)
山中伸彌首次將Oct3/4, Sox2 、c-Myc 和KIf4四種 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入細胞
日本完成世界首例iPS細 胞移植手術(shù)，治療老年 黃斑變性
2006 2008 2009 2011
2014 2017 2019
Kim 通過機械牽張刺激成功使 體細胞重編程為iPSCs
非整合型附著體載體方法 獲得的iPSC
人纖維蛋白原在誘導(dǎo)psc 效率提高
Nakagawa 將四種轉(zhuǎn)錄 因子去掉c-Mye
山中伸彌發(fā)現(xiàn)Oct3/4是 最重要
潛能擴展的多能 干細胞
細胞衰老
iPS細胞
體細胞
c-Myc
選項 提供物質(zhì)
作用
A 抗生素
主要防止動物細胞在培養(yǎng)過程中被病毒感染
B 血清
補充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)
C 氧氣
滿足細胞代謝的需要
D 二氧化碳
維持培養(yǎng)液的酸堿度
下列有關(guān)動物細胞培養(yǎng)時所提供的物質(zhì)及其作用的描述不正確的是( A )
課堂鞏固
A.步驟①的操作不需要在無菌環(huán)境中進行
B.步驟②中用鹽酸溶解細胞間物質(zhì)使細胞分離
C.步驟③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶處理
D.步驟④培養(yǎng)過程中不會發(fā)生細胞癌變
如圖為動物成纖維細胞的培養(yǎng)過程示意圖。下列敘述正確的是( C)
課堂鞏固
②制備細 ③原代培養(yǎng) 胞懸浮液
①切取
組織
④傳代培養(yǎng)
A. 甲→ 乙過程通常需要剪碎后，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理
B. 在丙中培養(yǎng)的細胞通常在10代以內(nèi)， 一般未發(fā)生癌變
C. 丁過程表示傳代培養(yǎng)，大多細胞一般能增殖10～50代
D. 培養(yǎng)過程中應(yīng)提供5%CO 和95%O 的氣體環(huán)境，以維持培養(yǎng)液正常的pH
課 堂 鞏 固
下圖為幼鼠腎臟上皮細胞培養(yǎng)過程示意圖，下列有關(guān)敘述錯誤的是(D)
腎臟組織塊
0
甲 乙 丙 丁
左圖為動物細胞培養(yǎng)過程示意圖，請回答以下幾個問題：
( 1 ) 容 器A中的動物器官或組織首先要剪碎，然后用胰蛋白酶 處理，其目的是 使組織分散成單個細胞 _ ;
(2)培養(yǎng)先在B瓶中進行。瓶中的培養(yǎng)基成分有葡萄糖、 氨基酸、無機鹽、維生素和 動物血清 等。當(dāng)細胞分裂生長 到 相互接觸時，就會停止增殖，需用胰蛋白酶處理后分瓶繼續(xù) 培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。
(3)有一類不正常的動物細胞，體外培養(yǎng)不受接觸抑制 機制的制約而表現(xiàn)為“瘋長”,這類細胞最可能是癌 細 胞。
課堂鞏固
練習(xí)與應(yīng)用
一、概念檢測
1.判斷下列有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的表述是否正確。
(1)培養(yǎng)環(huán)境中需要O , 不需要CO 。( *
(2)細胞要經(jīng)過脫分化形成愈傷組織。( ×)
(3)培養(yǎng)液中通常含有糖類、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清。( √)
(4)培養(yǎng)瓶中的細胞需定期用胰蛋白酶處理，分瓶后才能繼續(xù)增殖。( ×)
2.干細胞有著廣泛的應(yīng)用前景。下列相關(guān)敘述錯誤的是( A)
A.干細胞是從胚胎中分離提取的細胞
B、造血干細胞可以分化為各種血細胞
C.不同類型的干細胞，它們的分化潛能是有差別的
D.由iPS細胞產(chǎn)生的特定細胞，可以在新藥的測試中發(fā)揮重要作用
現(xiàn)在關(guān)于iPS細胞的研究正在不斷深入。請你從以下兩個方面來查閱資料進行思考。
(1)由于誘導(dǎo)iPS細胞、促使其分化都需要時間，因此用某人特異的iPS細胞進行醫(yī) 療只限于時間比較充裕的情形。從實際事故、疾病發(fā)生的不可預(yù)測性方面考慮，如果 要將這些細胞用于緊急情況，應(yīng)該提前采取什么措施
像建立骨髓庫一樣，有研究團隊正在嘗試建立HLA多態(tài)性豐富的iPS細胞庫，可 以為需要的人找到HLA匹配度較高的iPS細胞，這樣不僅可以節(jié)省時間、成本，還能 減輕異體干細胞移植后發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)。
(2)如果誘導(dǎo)iPS細胞定向分化為生殖細胞的技術(shù)發(fā)展成熟，該技術(shù)可能會有哪些應(yīng) 用 又可能帶來哪些問題
該技術(shù)可能被用于治療不孕癥；獲得足夠量的生殖細胞來進行瀕危物種的克隆 研究；獲得生殖細胞進行轉(zhuǎn)基因操作，再經(jīng)過受精、胚胎發(fā)育等過程來獲得轉(zhuǎn)基因 動 物 。
該技術(shù)可能帶來一系列的倫理問題。例如，如果用同一個人的iPS細胞分別誘 導(dǎo)形成精子和卵子，兩者受精可能培育出“單親”嬰兒；有的人還可能有目的地選 擇iPS細胞，從而“設(shè)計”嬰兒。
練習(xí)與應(yīng)用~~~~~~~~~~~~
二、拓展應(yīng)用

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