資源簡介

(共23張PPT)
第三章第一節 重組DNA 技術的基本工具
gene of
interest clone gene of interest
into T;plasmid(making it recombinant)
results in a
recombinant
plant
recombinant plant
G >C blunt ends
(b)blunt end cutting plant cell
G
cut
C G isolate plasmid
Agrobacterium tumefaciens
transform recombinant DNA back to
A.tumefaciens
T0NA
T;plasmid
infect plant cell
with A.tumefaciens
A
T
C
C
3'
C< G
C< G□
G C
5’
C< G
G
T
A
G
G
5'
cut
sticky ends
G
cut
cut
Haelll C<
C<
3'
C< G
C< G
(a)sticky end cutting
十
G
T(
A
G
T-DNA region
T;plasmid
A
T
C
C
C
>C□
A
T
C
G
A
G
G
cellular DNA
G
G
01 重組DNA技術所需的三種基本工具是什么 他們的作用分別是什么
02 基因工程載體需要具備什么條件
本節聚焦
從社會中來
木瓜是一種非常健康的熱 帶水果，它富含17種以上 氨基酸及鈣、鐵等，還含 有木瓜蛋白酶、番木瓜堿 等營養物質，具有抗氧化 功能，可以減少炎癥，抗 擊疾病，并幫助我們保持 機體年輕功能。
■轉基因番木瓜的獲得需要依賴什么工程技術 基因工程和植物組織培養技術
■什么是基因工程 DNA 雙螺旋的直徑僅2nm, 科學家如何操作編輯基因
DNA sequence
of inerest
DNAof
interest
操作對象 ：
Open
vecter
Vecter containing
Wecter DNA cf intereut
結 果 ：
賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。
定向改造生物性狀；克服遠緣雜交不親和障礙。
基因工程
基因工程：是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，
創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術操作層面看，由于 基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫重組DNA技術。
基因重組
基因
分子水平
操 作 水 平 ：
原 理 ：
意義 ：
基因工程理論基礎
■ 為什么不同生物的DNA 分子能拼接起來
(1)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。
(2)雙鏈DNA分子的空間結構都是規則的雙螺旋結構。
■ 為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內 表達
(1)基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。
(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。
(3)生物界共用一套
剪 接 運
基因在空間上轉移并
成功表達
限制性內切核酸酶 — — “分子手術刀”
◆ 來源：主要是從原核生物中分離純化來的。 限制酶是一類酶
◆ 作用：能夠①識別雙鏈DNA 分子的特定核苷酸序列，②并且使每一條鏈中 特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
◆ 結果：
G C
識別序列中軸線兩側兩條鏈分別切開
黏性末端
C
G Haelll
cut
C
C
識別序列的中軸線兩條鏈分別切開
平末端
C
C
sticky ends
A
G
C< G
kcut
C< G
T( A
A T
G C
G
A
T
C
C
C
G
G
cut
cut
5′...GA ATTC...3 EcoR I: 3...CTTA AG...5
5′...ACTAGT..3′
Spe I: 3...TGAT CA...5′
5′...GATATC..3'
3...CT AT AG...5′
5′...AA GCTT..3' Hind III:3...T TCGAA...5′
● 特 點 1:都可以找到一 條中 ( 心 ) 軸 線 ；
● 特點2: 中軸線兩側的雙
鏈DNA上的堿基是反向對
稱重復排列的，稱為回文
序 列。 中軸線
正向讀與另一條鏈反向讀的堿基順序完全一致。
回文序列
大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成；也有少數限制酶的識別序列由4個
、8個或其他數量的核苷酸組成。
EcoRV:
限制酶名字的由來
屬名Escherichia首字母
R 型菌株
EcoR I
從中分離的第一個限制酶
種名coli 前兩個字母
酶的專一性
■ 推測限制酶存在于原核生物中 的作用是什么
主要起到切割外源DNA 使之失效， 從而達到保護自身的目的。
■ 為什么限制酶不切割原核生物 自身的DNA 分子
①含某種限制酶的細菌的DNA分 子不具備這種限制酶的識別序列；
②或者甲基化酶將甲基轉移到了
限制酶所識別序列的堿基上，使 限制酶不能將其切開。
限制性內切核酸酶—— “分子手術刀”
■ 限制酶能切開RNA 分子的磷酸二酯鍵嗎
不能，限制酶只能識別并切開特定序列的雙鏈
DNA 分子
■ 結合右圖，推斷限制酶切一次可斷開兩 個 磷酸二酯鍵，產生 兩 個游離的磷酸基團， 產 生 兩 個黏性末端，消耗 兩 分子水。
■ 要想獲得某個特定性狀的目的基因必須要用限 制酶切幾個切口 可產生幾個黏性(平)末端
要想獲得某個特定性狀的目的基因，要切2個切
口，產生4個黏性(平)末端。
限制性內切核酸酶—— “分子手術刀”
5 end
5 ond
限制性內切核酸酶 — — “分子手術刀”
2個不同來源的DNA 片段A 和B,A 片段用限制酶SpeI 進行切割，B 片段分別用
限制酶HindⅢ 、Xba I 、EcoRV和Xho I 進行切割。
Spe I HindⅢ Xba I EcoRV Xho I
-ACTAGT- -AAGCTT- -TCTAGA- -GATATC-
-CTATAG-
-TGATCA- -TTCGAA- -AGATCT- -GAGCTC-
■寫出限制酶Spe I、HindⅢ、Xba I和Xho I切割形成的黏性末端。
HindⅢ:
一A
-TTCGA
Xba I:
-C
-GAGCT
Spe I:
Xho I :
-TGATC.
T
-AGATC
限制性內切核酸酶—— “分子手術刀”
2個不同來源的DNA 片段A 和B,A 片段用限制酶SpeI 進行切割，B 片段分別用
限制酶HindⅢ 、Xba I 、EcoRV和Xho I 進行切割。
Spe I HindⅢ Xba I EcoRV Xho I
-ACTAGT- -TCTAGA- -GATATC-
-TGATCA- -TTCGAA- -AGATCT- -CTATAG-
■同種限制酶切割產生的黏性末端是否相同 不同限制酶切割產生的黏性末端 是否一定不同
同種限制酶產生的黏性末端相同。不同的限制酶可能會形成相同的黏性末端。
(同尾酶)
限制性內切核酸酶 — — “分子手術刀”
2個不同來源的DNA 片段A 和B,A 片段用限制酶SpeI 進行切割， B 片段分別用
限制酶HindII 、Xba I 、EcoRV和Xho I 進行切割。
Spe I HindⅢ Xba I EcoRV Xho I
■哪種限制酶切割B 片段產生的DNA 片段能與限制酶Spe I切割A 片段產生的DNA 片 段相連接 為什么
■連接完成后，該重組DNA 分子的新連接處能否再被所用的限制酶識別 為什么
Xba I。因 為Xba I 與Spe I 切割產生了相同的黏性末端。不能。因為所用的兩
種限制酶均不能識別該重組DNA 分子的新連接處的脫氧核苷酸序列。
-ACTAGT-
-TGATCA-
-TCTAGA-
-AGATCT-
-GATATC-
-CTATAG-
-TTCGAA-
◆ 分 類 ： E·coli DNA連接酶 G A A T T C C T T A A G U
A A !
來源于大 腸 桿 菌； 只連接黏性末端。 T4 DNA連接酶
DNA連接酶——“分子縫合針”
◆ 作用：將兩個DNA 片段連接起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的 磷 酸 二 酯 鍵。
來源于T4 噬菌體；
連接黏性末端和平末端。 一
DNA (水解)酶 切斷磷酸二酯鍵
將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
限制酶 切斷磷酸二酯鍵
將DNA 切成兩個片段
DNA 聚合酶 形成磷酸二酯鍵
將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端
(需要模版)
DNA連接酶 形成磷酸二酯鍵
將兩個DNA 片 段連接為一個DNA 分子
(不需要模版)
名稱 作用部位 作用效果
DNA連接酶—— “分子縫合針”
解旋酶 切斷堿基對間的氫鍵 將雙鏈DNA 分子局部解旋為單鏈
◆ 作用：將外源基因送入受體細胞。
◆ 分類：
動物、植物 動植物病毒
細菌 噬菌體
常用載體 質粒
裸露、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA 外，具有自我復制能
力的環狀雙鏈DNA。
基因進入受體細胞的載體—— “分子運輸車”
③具有特殊的標記基因
便于重組DNA分子的篩選 Origin
Stance Gene Replication
④對受體細胞無害、易分離
對受體細胞無毒害作用，避免受體細胞受到損傷
◆ 載體需具備的條件：
①穩定存在并能自我復制或整合到受體DNA 上
能使目的基因穩定存在且數量可擴增
②有一個至多個限制酶切割位點點
供外源DNA 片段(基因)插入其中
■有同學認為在含有某種抗生素的培養基中篩選存活的受體細胞不一定是導入 目的基因的受體細胞，這種說法是否合理 請解釋。
基因進入受體細胞的載體—— “分子運輸車”
selecable Marke,
triction es
Promoter
5……ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC ………3’
3…..…TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG……5”
5….....TCCTAGAATTC TCGGTATGAATTC CATAC………3’
3.….…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG…..5
用剪刀模擬EcoRI 識別下面質粒序列和切割位點進行“切割”,將下面DNA 切下的片段
重組到上面DNA 鏈的切口，并用透明膠條將切口粘連起來。
5...ATAGCATGCTATCCATGAATTCTCGGTATGAATTCGGCATAC...3'
3’...TATCGTACGATAGGTACTTAAGAGCCATACTTAAGCCGTATG...5’
思考 ·討論
重 組DNA 分 子
◆ 實驗原理：
DNA、RNA、 蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，
可以利用差異，選用適當的物理或化學方法對它們進行提取。
①DNA 不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理， 可以初步分離DNA與蛋白質。
②DNA 在不同濃度的NaCl 溶液中溶解度不同，它能溶于2
mol/L. 的NaCl 溶液(溶解DNA)。
③在 一 定溫度下， DNA遇二苯膠試劑會呈現藍色，因此二苯 胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。
探究 ·實踐 DNA 的粗提取與鑒定
◆ 目的要求： ① 了 解DNA 的物理和化學性質，理解DNA 粗提取和鑒定的原理。
② 學 會DNA 粗提取的方法以及用二苯膠試劑對DNA進行鑒定。
NaCI濃度 (mol/L)
稱取菜花，切碎，放入研缽，倒入研磨液 ,充分研磨。
在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取 上清液 ； 或將研磨液倒入塑料離心管中離心，取上清液。
在上清液中加入體積相等的、 預冷的酒精(95%) ,靜置2~3min, 溶液中出現的 白色絲狀物就是粗提取的DNA。
要輕緩，以免加劇DNA 斷裂，導致DNA 分子不能形成絲狀物。
用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物；
或將溶液倒入塑料離心管中離心，取沉淀物晾干。
DNA 的粗提取與鑒定
破碎細胞
DNA 的析出
去除雜質
探究 · 實踐
試管編號 A(對照組)
B(實驗組)
步驟1 2mol/L的NaC1溶液5mL 步驟2 不進行任何處理
加絲狀物或沉淀物
步驟3 加4mL的二苯胺試劑 步驟4 沸水浴加熱5min 實驗現象 溶液不變藍色
溶液逐漸變藍
實驗結論 DNA在沸水浴下遇二苯胺試劑會被染成藍色
探究 · 實踐 DNA 的粗提取與鑒定
DNA 的鑒定 將絲狀物或沉淀物溶于2 mol/L的NaCl 溶液中，
加入 二苯胺 試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。
■ 選什么樣的材料實驗更易成功 為什么強調充分研磨
選擇DNA含量較高的生物組織易成功。
研磨不充分，會使DNA 分子不能從細胞核中釋放出來，影響提取的DNA 含量
■豬血和雞血，哪個適合用作提取DNA 的材料 操作時如何防止血液凝固
豬血(哺乳動物的成熟紅細胞)無細胞核，不適合；
雞血中紅細胞有核DNA, 且核DNA的量較多，適合。
可以在雞血中加入檸檬酸鈉，防止血液凝固。
■ 如果用雞血動物細胞做材料，也需要研磨裂解釋放細胞中的DNA 嗎
雞血中加入清水，讓細胞吸水脹破，釋放DNA。
探究 · 實踐
DNA 的粗提取與鑒定
探究 · 實踐 DNA 的粗提取與鑒定
■ 實驗中進行了2次靜置或離心，目的是將DNA 和 雜質分子 分開。
■ 第1次操作后， DNA 存在于 上 清 液 中；第2次操作后DNA 存在于 析出的白色絲狀物 或 離心管沉淀 中。
■ 基于細胞中化合物分析，研磨液應該具有什么樣的特性和功能
SDS: 使蛋白質變性與DNA 分離；
EDTA: 是一種DNA 酶的抑制劑，可防止細胞破碎后DNA 酶降解DNA;
Tris: 提供緩沖體系， DNA在這個緩沖體系中呈穩定狀態。
■ 研磨后用紗布過濾得到濾液，可以用濾紙代替嗎
不可以，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失。
■ 你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎 用二苯胺試劑鑒定的結果如何
觀察提取的DNA的顏 色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中 的雜質較多。
二苯胺試劑鑒定呈現藍色說明實驗基本成功；如果不呈現藍色，可能的原因有 所提取的DNA 含量低，或者在實驗操作過程中出現了失誤等。
■ 你能分析出粗提取的DNA 中可能含有哪些雜質嗎
本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。
■與其他同學提取的DNA 進行比較，實驗結果有何不同，分析產生差異的原因。
本實驗可以采取分組的方式進行。各組由于選取不同的實驗材料、提取DNA 的方法等多方面原因最終使得DNA 的純度(顏色)、DNA 含量(二苯胺試劑
顯色的深淺) 等存在差異。
探究 · 實踐
DNA 的粗提取與鑒定

展開更多......

收起↑