資源簡介

(共32張PPT)
第1節(jié)
重組DNA技術(shù)的基本工具
第3章　基因工程
高考考點分析：
24年：T13 DNA的粗提取與鑒定
T25 ①黏性末端 ②重組載體的篩選
23年：T25 質(zhì)粒適于作基因運(yùn)載體的特點和條件
22年：T13 DNA的粗提取與鑒定
T25 限制酶的作用
21年：T13 DNA的粗提取與鑒定
T25 限制酶、DNA連接酶的作用
20年：T25 限制酶、DNA連接酶
學(xué)習(xí)目標(biāo)
1.通過資料分析，闡明基因工程的理論基礎(chǔ)。
2.通過模擬制作活動，闡明限制酶、DNA連接酶和載體的作用。
3.通過了解基因工程的發(fā)展歷程，認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開多個學(xué)科的理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。
抗蟲棉
情境視頻
棉花細(xì)胞
普通棉花
(無抗蟲特征)
(含抗蟲基因)
棉花植株
(有抗蟲特征)
基因工程
抗蟲基因
提取
蘇云金芽孢桿菌
(有抗蟲特征)
1944年艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實驗，不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物個體間轉(zhuǎn)移。
1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。截至1966年，64個密碼子均被破譯成功。
1970年科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）
1972年，伯格首先在體外進(jìn)行了DNA的改造，成功構(gòu)建了第一個體外重組DNA分子。
1982年，第一個基因工程藥物-重組人胰島素被批準(zhǔn)上市。基因工程藥物成為世界各國研究和投資開發(fā)的熱點。
1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假說。
1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。
20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。
1973年，科學(xué)家證明了質(zhì)粒可以作為基因工程的載體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，并實現(xiàn)了物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。
1985年，穆里斯等人發(fā)明PCR,為獲取目的基因提供了有效手段。
基因工程的建立過程
一
基因工程的概念和工具酶
一
基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫做重組DNA技術(shù)。
主要在生物體外
基因（DNA）
DNA分子水平
創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品
基因重組
定向改造生物遺傳特性；徹底打破種間界限
基因工程的概念
別名：
操作環(huán)境：
操作對象：
操作水平：
結(jié)果：
原理：
特點：
【歸納定義】
重組DNA技術(shù)
有性生殖中的基因重組是隨機(jī)的，并且只能在同一物種間進(jìn)行重組；基因工程可以實現(xiàn)遺傳物質(zhì)在不同物種間進(jìn)行重組，并且方向性強(qiáng)，可以定向地改變生物的性狀。
基因工程的理論基礎(chǔ)
任務(wù)一
1. 為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？
2. 為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？
(1)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。
(2)雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。
(1)基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。
(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。
(3)生物界共用一套遺傳密碼。
在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉時，既要在體外對含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要將重組DNA分子導(dǎo)入棉花體內(nèi)，并使其表達(dá)。DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。
科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？
一
基因工程的概念和工具酶
一
EcoRI 限制酶
大腸桿菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特異性識別____________序列，并切割_____和_____之間的______________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯鍵
當(dāng)限制酶在它的識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是黏性末端。
中軸線
3
結(jié)果：
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子手術(shù)刀”
5'
5'
3'
3'
黏性末端
限制酶
SmaI 限制酶
SmaI 限制酶只能識別 序列，切割 和 之
間的 。
CCCGGG
C
G
磷酸二酯鍵
當(dāng)限制酶在它的識別序列的中心軸線處切開時，產(chǎn)生的是平末端
中軸線
3
結(jié)果：
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子手術(shù)刀”
5'
5'
3'
3'
平末端
限制酶
限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)
任務(wù)二
②推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一種防御工具，用來切割侵入細(xì)胞的外源DNA，以保證自身安全。
思考：（1）①為什么限制酶主要從原核生物中分離純化而來？
因為原核細(xì)胞容易受到外源DNA的入侵。
③為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？
含某種限制酶的細(xì)菌的DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者被修飾（甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識別序列的堿基上），使限制酶不能將其切開。
限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)
任務(wù)二
(1)限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？
（2）限制性內(nèi)切核酸酶的作用是否都體現(xiàn)了酶的專一性？
不能。
可斷開2個磷酸二酯鍵；
產(chǎn)生2個游離的磷酸基團(tuán)；
產(chǎn)生2個黏性末端；
消耗2分子水。
限制酶只能識別并切開雙鏈DNA分子
酶的專一性
(2)請結(jié)合圖示，推斷限制酶切割一次可斷開幾個磷酸二酯鍵？
產(chǎn)生多少個游離的磷酸基團(tuán)？產(chǎn)生幾個黏性末端？消耗幾分子水？
限制性內(nèi)切核酸酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開，體現(xiàn)了酶的專一性。
限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)
任務(wù)二
(3)上圖中中間部位為“目的片段”，在切割含“目的片段”的DNA分子時，需用限制酶切割______次此DNA分子，斷裂______個磷酸二酯鍵,產(chǎn)生______個末端,新出現(xiàn)______個游離的磷酸基團(tuán)。
2
4
4
4
（4）圖1和圖2分別表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意圖。
圖1
圖2
限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)
任務(wù)二
①EcoR Ⅰ限制酶識別的堿基序列及切割的位點？切割產(chǎn)生的末端序列為？是哪類末端？
--GAATTC-- 切割位點在G和A之間 --G 粘性末端
--CTTAAG-- --CTTAA
（4）圖1和圖2分別表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意圖。
圖1
圖2
限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)
任務(wù)二
②SmaⅠ限制酶識別的堿基序列及切割的位點？切割產(chǎn)生的末端序列為？是哪類末端？
--CCCGGG-- 切割位點在G和C之間 --CCC 平末端
--GGGCCC-- --GGG
（5)觀察下列限制酶的識別序列和切割位點，回答：
①寫出這四種限制酶切割形成的末端。
②不同的限制酶能否切割形成相同的黏性末端？
限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)
任務(wù)二
--G --G AGCTT-- GATCT--
--CCTAG --CTTAA A-- A--
可以 如Bam I 與 Bgl II產(chǎn)生的末端相同
識別DNA 分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。
限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)
任務(wù)二
(6)若要在外源DNA片段上切割下來目的基因能否利用BamH I 為什么？
不能 因為會破壞目的基因。
將兩個DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
02
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子縫合針”
DNA連接酶
1
作用：
兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來
可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵。
用DNA連接酶連接兩個片段之間的磷酸二酯鍵
種類 ___________________
___________________
來源 大腸桿菌 T4噬菌體
作用 差別 E.coli DNA連接酶連接具有平末端的DNA片段的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 T4 DNA連接酶 E.coli DNA連接酶
T4 DNA連接酶
都能將雙鏈DNA片段“縫合“起來，
恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵。
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子縫合針”
2
種類：
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
旁欄思考：DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
只能將單個核苷酸連接到已有的核苷酸鏈上，形成磷酸二酯鍵
DNA聚合酶作用示意圖：
一
基因工程的概念和工具酶
一
“分子縫合針”
核心歸納
與DNA相關(guān)的幾種酶的比較
項目 DNA連接酶 DNA聚合酶 限制酶 解旋酶 DNA水解酶 RNA聚合酶
作用部位 形成磷酸二酯鍵 形成磷酸二酯鍵 破壞磷酸二酯鍵 破壞氫鍵 破壞磷酸二酯鍵 形成磷酸二酯鍵
作用對象 DNA片段 單個的脫氧核苷酸 DNA DNA DNA DNA
作用結(jié)果 將兩個DNA片段連接成重組DNA分子 將單個的脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端 切割DNA分子形成黏性末端或平末端 將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈 將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸 將單個核糖核苷酸依次連接到單鏈末端
一
基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
四
質(zhì)粒
將外源基因送入受體細(xì)胞。
動植物病毒
噬菌體
擬核DNA
質(zhì)粒
大腸桿菌細(xì)胞
目的基因插入位點
復(fù)制原點
氨芐青霉素抗性基因
大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖
裸露、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA外，具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA。
1
作用：
2
種類:
真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。
載體——“分子運(yùn)輸車”
思考：若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用噬菌體作為載體，其原因是什么？
噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶。
背誦：
1、“分子手術(shù)刀”是指什么？簡稱？
大多數(shù) 識別的序列由幾個堿基組成？少數(shù)有幾個？
2、常見的兩種上述物質(zhì)是？切割后分別產(chǎn)生什么末端？
3、“分子縫合針”是指？常見的有哪兩種？
連接黏性末端用？連接平末端用？為什么？
4、“分子運(yùn)輸車”是指？（常見3種）
質(zhì)粒作為載體需具備的條件？
擬核DNA
質(zhì)粒
大腸桿菌細(xì)胞
目的基因插入位點
復(fù)制原點
氨芐青霉素抗性基因
大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖
條件 原因
能自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制
有一個至多個限制酶切割位點
具有特殊的標(biāo)記基因
無毒害作用
能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)增
供外源DNA片段（基因）插入其中
便于重組DNA分子的篩選
對受體細(xì)胞無毒害作用，避免受體細(xì)胞受到損傷
3
載體需具備的條件:
一
基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”
二
核心歸納
標(biāo)記基因的篩選原理
載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。如圖所示：
思考：根據(jù)標(biāo)記基因的作用，有同學(xué)認(rèn)為在含有某種抗生素的培養(yǎng)基中篩選存活的受體細(xì)胞不一定是導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞，這種說法是否合理？并說明理由。
這種說法合理；因為僅導(dǎo)入載體的和導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞均能在該培養(yǎng)基中存活。
核心歸納
如何提高篩選的準(zhǔn)確性
當(dāng)質(zhì)粒上有兩個標(biāo)記基因時，可將目的基因插入其中一個標(biāo)記基因中，也就是重組質(zhì)粒上只含一個標(biāo)記基因，普通質(zhì)粒上含有兩個標(biāo)記基因。則沒有導(dǎo)入質(zhì)粒的受體細(xì)胞不具有標(biāo)記基因控制的性狀，導(dǎo)入普通質(zhì)粒的受體細(xì)胞具有兩個標(biāo)記基因控制的性狀，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞只具有一個標(biāo)記基因控制的性狀。這樣可根據(jù)標(biāo)記基因控制的性狀準(zhǔn)確篩選出含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。
4.圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，
①EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的末端為__________________。BamHⅠ切割后產(chǎn)生的末端為
_________________。
Sau3AⅠ切割后產(chǎn)生的末端為__________________。
GATC--
--
②BamHⅠ和Sau3AⅠ識別的堿基序列一樣嗎______。這兩種限制酶切割后產(chǎn)生的末端能否被DNA連接酶連接_______
③僅用BamHⅠ能否將目的基因切割下來_______；僅用EcoRⅠ能否將目的基因切割下來______。
④僅用Sau3AⅠ能否將目的基因切割下來_________；切割后的目的基因能否自己鏈接成環(huán)_____。
不一樣
能
不能
不能
能
能
⑤用Sau3AⅠ和EcoRⅠ共同作用能否將目的基因切割下來____，切割后的目的基因能否自己連接成環(huán)_____。
⑥與僅用Sau3AⅠ切割目的基因相比用Sau3AⅠ和EcoRⅠ共同切割目的基因的優(yōu)點是
_____________________________________________________.
⑦若僅用Sau3AⅠ切割目的基因，則應(yīng)用________________________切割質(zhì)粒。
⑧若用Sau3AⅠ和EcoRⅠ共同切割目的基因，則應(yīng)用________________________切割質(zhì)粒。
能
不能
可以防止目的基因自身成環(huán)
BamHⅠ
EcoRⅠ、BamHⅠ
練習(xí)：1.下列操作中選用哪種限制酶切割構(gòu)建重組DNA分子最好？為什么？
(注：AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因)
Hind Ⅲ和PstⅠ；
防止目的基因的自身環(huán)化；防止目的基因反向連接到載體。
2.選用下圖載體將目的基因?qū)爰?xì)菌中并將含有目的基因的細(xì)菌篩選出來
①在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素B，則應(yīng)選擇的限制酶為______
②在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素A，則應(yīng)選擇的限制酶為______
①或②
①
課堂小結(jié)

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