資源簡介

(共57張PPT)
專題九　生物技術(shù)與工程
角度一　PCR技術(shù)原理與條件
命題熱點(diǎn)九　PCR技術(shù)
1．PCR過程中不需要解旋酶，需要升高溫度才能打開氫鍵，但此時(shí)的溫度不會(huì)破壞磷酸二酯鍵。因此，雙鏈DNA加熱變性后變?yōu)閱捂湥⑽捶纸獬蓡误w。
2．PCR過程中使用的耐高溫的DNA聚合酶需要Mg2＋激活，因此PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。
3．PCR的擴(kuò)增結(jié)果：DNA分子以指數(shù)形式擴(kuò)增(約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)次數(shù))。
角度二　PCR產(chǎn)物的電泳鑒定
1.原理：脫氧核苷三磷酸(dNTP)3′－C上的－OH被－H替換后轉(zhuǎn)化為雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。在PCR反應(yīng)體系中加入待測DNA片段、4種dNTP、1種32P標(biāo)記的ddNTP和1種引物及其他所需材料，經(jīng)擴(kuò)增后獲得不同長度的DNA片段混合物。利用每種32P標(biāo)記的ddNTP分別進(jìn)行PCR后，將產(chǎn)物點(diǎn)樣在變性凝膠上進(jìn)行電泳分離，通過放射性自顯影檢測，就可以讀出DNA的核苷酸序列。
2.實(shí)例：如圖中DNA片段的待測堿基序列5′－TTGGCTGCAA－3′。
角度三　PCR技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例
1．?dāng)U增某DNA片段：將引物設(shè)計(jì)在DNA片段的兩端。
2．從某一DNA分子上擴(kuò)增其中一部分：將引物設(shè)計(jì)在要擴(kuò)增的DNA片段兩端。
3．定點(diǎn)突變：在引物的外側(cè)(5′端)加上需要的序列(如限制酶 切割位點(diǎn)、特定的啟動(dòng)子或標(biāo)記序列等)。
1. (2024·蘇州模擬)RNA的檢測可以采用實(shí)時(shí)熒光RT－PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的方法，RT－PCR的具體過程如圖，下列敘述正確的是(　　)
A．PCR體系中一定要添加從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶
B．過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進(jìn)行n次循環(huán)的擴(kuò)增，理論上需要2n個(gè)引物B
C．該技術(shù)用于對某些微量RNA病毒的檢測，可提高檢測的靈敏度
D．PCR反應(yīng)中周期性的溫度設(shè)置是特定的，與擴(kuò)增的目的基因和引物無關(guān)
【答案】　C
【解析】　PCR體系中需要的是耐高溫的DNA聚合酶，不是從受體細(xì)胞中提取的DNA聚合酶，A錯(cuò)誤；過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進(jìn)行n次循環(huán)的擴(kuò)增，根據(jù)DNA分子半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，該過程理論上至少需要2n－1個(gè)引物B，B錯(cuò)誤；利用實(shí)時(shí)熒光RT－PCR技術(shù)對某些微量RNA病毒進(jìn)行檢測時(shí)，可提高檢測的靈敏度，是因?yàn)樵黾恿舜郎yRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA的數(shù)量(或濃度)，便于檢測，C正確；PCR反應(yīng)中溫度呈現(xiàn)周期性變化，其中溫度超過90 ℃的目的是雙鏈DNA解聚為單鏈，然后冷卻到50 ℃左右使引物與互補(bǔ)DNA鏈結(jié)合，繼續(xù)加熱到72 ℃左右，目的是在耐高溫的DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。所以PCR反應(yīng)中周期性的溫度可在一定范圍內(nèi)設(shè)置，不是特定的，D錯(cuò)誤。
2. (2024·廣州模擬)由于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)不同，植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出T－DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，以此可確定T－DNA插入的具體位置。下列說法錯(cuò)誤的是(　　)
A．進(jìn)行PCR擴(kuò)增的依據(jù)是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理
B．進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要的酶有解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶
C．利用圖中的引物①④組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列
D．通過與受體細(xì)胞的基因組序列比對，可確定T－DNA的插入位置
【答案】　B
【解析】　PCR擴(kuò)增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理，A正確；進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要耐高溫的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)，但不需要解旋酶，B錯(cuò)誤；DNA的兩條鏈反向平行，子鏈從引物的3′端開始延伸，則利用圖中的引物①④組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列，C正確；通過與受體細(xì)胞的基因組序列比對，即可確定T－DNA的插入位置，D正確。
3. (2024·忻州模擬)閱讀資料1、資料2，回答下列問題。
【資料1】　我國科學(xué)家把腺病毒中負(fù)責(zé)復(fù)制的關(guān)鍵基因剪切掉，但保留其侵染人體細(xì)胞的能力。隨后，將其與逆轉(zhuǎn)錄獲得的新型冠狀病毒S蛋白(介導(dǎo)新型冠狀病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵成分)基因整合，構(gòu)建出了兩種病毒的融合型病毒——重組腺病毒DNA疫苗。
【資料2】　新型冠狀病毒核酸測序能夠監(jiān)測新變異毒株的出現(xiàn)，具體做法是先提取新型冠狀病毒RNA，利用RT－PCR技術(shù)(即將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增)獲取目標(biāo)DNA區(qū)域；隨后進(jìn)行DNA測序，通常采用雙脫氧核苷酸測序法，其原理是雙脫氧核苷酸(ddNTP)的2′、3′碳原子都不含羥基，在DNA合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以中斷DNA分子合成反應(yīng)。在四個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)體系中，分別額外摻入ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP，使DNA復(fù)制隨機(jī)終止，產(chǎn)生不同長度的DNA片段，然后進(jìn)行凝膠電泳分離檢測，從而分析獲得目標(biāo)DNA區(qū)域的堿基序列。
(1)資料1中，構(gòu)建出兩種病毒的融合型病毒這一步驟在基因工程中被稱為__________________________________。融合型病毒入侵人體細(xì)胞后，S蛋白基因在人體細(xì)胞內(nèi)的遺傳信息傳遞過程為____________ __________________________________________(用文字和箭頭表示)。
(2)接種重組腺病毒DNA疫苗后，人體長時(shí)間內(nèi)仍可檢測到重組腺病毒DNA。請由此推測重組腺病毒DNA疫苗只需注射一針即可起到長期免疫保護(hù)作用的原因是____________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________。
(3)資料2中，RT－PCR技術(shù)中使用的酶有____________________。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、________三步，其中復(fù)性的結(jié)果是________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________。
(4)下圖為資料2中雙脫氧核苷酸測序電泳結(jié)果，據(jù)此可分析出目標(biāo)DNA區(qū)域X的堿基序列為________________________________(按5′→3′方向書寫)。
(2)重組腺病毒DNA在人體細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)抗原，可反復(fù)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生防御作用
(3)逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶　延伸　兩種引物(通過堿基互補(bǔ)配對)與兩條單鏈DNA結(jié)合(答出引物與模板鏈結(jié)合或互補(bǔ)配對即可)
(4)5′－CTGACTT－3′
中溫延伸三個(gè)不同的步驟。①變性：加熱使模板DNA在高溫下雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；②復(fù)性：使溶液溫度降至50 ℃左右，模板DNA與引物按堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合；③延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72 ℃左右，耐高溫的DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷酸，按5′→3′方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。(4)由題意可知，雙脫氧核苷酸測序法的原理是雙脫氧核苷酸(ddNTP)的2′、3′碳原子都不含羥基，在DNA合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以中斷DNA分子合成反應(yīng)，DNA合成過程中子鏈沿3′端向下延伸，并且過程中遵循堿基互補(bǔ)配對原則，得到的結(jié)果如題圖，可知目標(biāo)DNA區(qū)域X的堿基序列應(yīng)是5′－CTGACTT－3′。
4. (2024·衡水模擬)草甘膦是世界上使用最廣泛的除草劑，轉(zhuǎn)EPSPS基因抗除草劑水稻是中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研發(fā)的水稻品種，靶標(biāo)對象為草甘膦。回答下列問題：
(1)EPSPS基因一條鏈的兩端序列如圖1。采用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增EPSPS基因，需要使用的引物序列為___________________________ _______________(標(biāo)出5′和3′端)。若PCR過程經(jīng)過4次循環(huán)，需要的引物的數(shù)量為________個(gè)。
(2)如表為操作過程中可能用到的限制酶，圖2為經(jīng)切割得到的目的基因及末端(除黏性末端序列外，其他堿基序列省略)，圖3為要使用的質(zhì)粒，其中的Tetr、Ampr為標(biāo)記基因。
由圖3可以看出，將EPSPS基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法為____________________，作為表達(dá)載體，除圖中結(jié)構(gòu)，未標(biāo)注的結(jié)構(gòu)為________。對質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)，選用的兩種酶為__________________。
(3)植物激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生，能從產(chǎn)生部位運(yùn)送到作用部位，對植物的______________________的微量有機(jī)物，將導(dǎo)入EPSPS基因的細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，所用培養(yǎng)基中需要添加植物激素，若要探究生長素和細(xì)胞分裂素的比例(比值為1、比值大于1、比值小于1)對培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生的影響。實(shí)驗(yàn)思路為______________________________________________ _______________________________________________________。
【答案】　(1)5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′　30
(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法　啟動(dòng)子　BclⅠ和SmaⅠ
(3)生長發(fā)育有顯著影響　取4組已滅菌的裝有MS培養(yǎng)基的錐形瓶，不同組別培養(yǎng)基的差異為不添加任何植物激素，生長素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值為1、比值大于1以及比值小于1，其他條件相同且適宜，觀察外植體的生長發(fā)育情況
【解析】　(1)利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，引物需要與模板的3′端(—OH端)結(jié)合，并遵循堿基互補(bǔ)配對原則，據(jù)圖可知，采用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增EPSPS基因，需要使用的引物序列為5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′；PCR技術(shù)大量擴(kuò)增目的基因時(shí)，緩沖液中需要加入的引物個(gè)數(shù)計(jì)算公式為2n＋1－2，因此若一個(gè)該DNA分子在PCR儀中經(jīng)過4次循環(huán)，需要24＋1－2＝30個(gè)引物。(2)由圖3可知，重組質(zhì)粒中含有T－DNA，據(jù)此可知將EPSPS基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；圖示表達(dá)載體中含有目的基因、終止子、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因等，故還缺少的是啟動(dòng)子；基因表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)，需要將目的
基因和載體切割出相同的末端，圖示BamHⅠ會(huì)破壞目的基因，若對質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)，選用的兩種酶為BclⅠ和SmaⅠ。(3)植物激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生，能從產(chǎn)生部位運(yùn)送到作用部位，對植物的生長發(fā)育有顯著影響的微量有機(jī)物；分析題意，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖翘骄可L素和細(xì)胞分裂素的比例(比值為1、比值大于1、比值小于1)對培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生的影響，則實(shí)驗(yàn)的自變量是兩種激素的比例，因變量是培養(yǎng)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循對照與單一變量原則，可設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如下：取4組已滅菌的裝有MS培養(yǎng)基的錐形瓶，不同組別培養(yǎng)基的差異為不添加任何植物激素，生長素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值為1、比值大于1以及比值小于1，其他條件相同且適宜，觀察外植體的生長發(fā)育情況。
5. (2024·煙臺(tái)模擬)胸腺素β4(Tβ4)是肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽家族的一員，具有促進(jìn)毛囊發(fā)育，加快毛發(fā)生長的作用。為了探究Tβ4基因?qū)π∈蟀l(fā)育的作用，研究人員構(gòu)建了特異性表達(dá)載體，并通過核注射技術(shù)轉(zhuǎn)染小鼠單倍體ES細(xì)胞，培育出轉(zhuǎn)Tβ4基因小鼠。回答下列問題：
(1)利用PCR技術(shù)可以獲取和擴(kuò)增目的基因。PCR中引物結(jié)合在模板鏈的__________端，子鏈的延伸方向是__________。
(2)利用引物2和引物3________(填“能”或“不能”)鑒定Tβ4基因插入位點(diǎn)。
(3)綠色熒光蛋白基因的作用是_______________________________ _______________________________________________。
為檢測轉(zhuǎn)Tβ4基因小鼠是否培育成功，從分子水平上，可采取的檢測包括________________________________________________________ _________________________________________________________。
(4)為獲得較多的小鼠卵母細(xì)胞，可采取的措施是____________ ___________。若需獲得更多遺傳性狀相同的轉(zhuǎn)基因小鼠，可在胚胎移植前對囊胚進(jìn)行分割，分割時(shí)應(yīng)注意________________________。
【答案】　(1)3′　5′→3′　(2)能
(3)作為標(biāo)記基因，鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(便于重組DNA分子的篩選)　通過DNA分子雜交技術(shù)檢測小鼠染色體DNA上是否插入Tβ4基因；通過分子雜交技術(shù)檢測Tβ4基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA；用抗原—抗體雜交法檢測Tβ4基因是否翻譯出Tβ4
(4)向雌鼠體內(nèi)注射一定量的促性腺激素　將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割
【解析】　(1)PCR中引物的5′端作為子鏈的起點(diǎn)結(jié)合在模板鏈的3′端，子鏈延伸方向是從5′端到3′端。(2)引物2和3可擴(kuò)增一部分外源基因、一部分染色體DNA序列，可鑒定Tβ4基因插入位點(diǎn)。(3)綠色熒光蛋白基因作為標(biāo)記基因，用于鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(便于重組DNA分子的篩選)。從分子水平上，可通過DNA分子雜交技術(shù)檢測小鼠染色體DNA上是否插入Tβ4基因；通過分子雜交技術(shù)檢測Tβ4基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA；用抗原—抗體雜交法檢測Tβ4基因是否翻譯出Tβ4。(4)用外源促性腺激素處理雌鼠，可獲得數(shù)量較多的卵母細(xì)胞。在對囊胚階段的胚胎進(jìn)行分割時(shí)，應(yīng)注意將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割，否則內(nèi)細(xì)胞團(tuán)少的部分發(fā)育會(huì)受阻或發(fā)育不良甚至不能發(fā)育。
基因編輯是指對基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù)可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上，在該位點(diǎn)上剪斷靶標(biāo)DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達(dá)成了“編輯基因”。有些單基因突變導(dǎo)致的遺傳疾病，目前也正在嘗試用基因編輯技術(shù)進(jìn)行治療。讓我們有機(jī)會(huì)通過編輯基因來救治基因問題所導(dǎo)致的遺傳病患者，但是現(xiàn)在面臨的挑戰(zhàn)是如何把基因編輯工具傳送到細(xì)胞或組織里面。所以，從這個(gè)角度考慮，血液疾病可能是用基因編輯工具治療的首選，因?yàn)槲覀兡馨蜒?xì)胞取出來，在體外進(jìn)行基因修復(fù)后再送回體內(nèi)。
命題新情境九　基因編輯技術(shù)
1.基因魔剪：CRISPR/Cas9系統(tǒng)
CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9蛋白和人工設(shè)計(jì)的gRNA構(gòu)成。在gRNA引導(dǎo)下，Cas9與靶序列結(jié)合并將DNA雙鏈切斷。隨后細(xì)胞通過自身的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，將斷裂上下游兩端的序列連接起來，但通常會(huì)在斷裂處造成少量核苷酸的插入或缺失。
當(dāng)DNA雙鏈斷裂后，如果細(xì)胞中有DNA修復(fù)模板(由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列組成)，斷裂部分可依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行精確修復(fù)，從而將目的基因錨入指定位點(diǎn)。
通過在Cas9基因中引入突變，可獲得只能切割一條鏈的nCas9。將nCas9與胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶融合，科學(xué)家開發(fā)出了單堿基編輯技術(shù)(圖2)，能夠?qū)Π形稽c(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的堿基編輯，最終可以分別實(shí)現(xiàn)C→T(G→A)或A→G(T→C)的堿基替換。
科學(xué)家通過對CRISPR/Cas系統(tǒng)的不斷改造，使其還可激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。雖然目前CRISPR/Cas技術(shù)還存在一些不足，如脫靶問題，但作為一種革命性的技術(shù)，其應(yīng)用前景廣闊。
2.基因定點(diǎn)突變技術(shù)——引物重疊PCR技術(shù)：
(1)該過程需要4種引物。
(2)PCR1的產(chǎn)物AB是引物a和引物b擴(kuò)增的結(jié)果。
(3)PCR2的產(chǎn)物CD是引物c和引物d擴(kuò)增的結(jié)果。
(4)產(chǎn)物AD的形成不需要另加引物，但需要耐高溫的DNA聚合酶。
(5)需要改變的堿基位于引物b和引物c上。
(6)引物b和引物c之間應(yīng)有部分堿基互補(bǔ)。
(7)PCR3中突變產(chǎn)物AD的擴(kuò)增需要引物a和引物d。
1. (2024·蘇州模擬)馬里蘭醫(yī)學(xué)中心成功將豬心臟移植到一名57歲的心臟病患者身上，雖然這顆心臟僅僅存活了2個(gè)月，但仍然為異種器官移植的可行性提供了可觀的數(shù)據(jù)。為了降低免疫排斥反應(yīng)，研究者借助CRISPR/Cas9技術(shù)對移植的豬心臟進(jìn)行了基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由向?qū)NA(sgRNA)和Cas9蛋白兩部分組成，sgRNA可引導(dǎo)Cas9蛋白到特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，其機(jī)制如圖所示。下列說法錯(cuò)誤的是(　　)
A．若要對一個(gè)基因進(jìn)行編輯，則通常至少需要設(shè)計(jì)兩個(gè)序列不同的sgRNA與目標(biāo)DNA的兩條鏈進(jìn)行配對
B．sgRNA可以特異性識別目標(biāo)DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯鍵
C．有時(shí)sgRNA會(huì)因錯(cuò)誤結(jié)合而出現(xiàn)“脫靶”現(xiàn)象，一般sgRNA序列越短，脫靶率越低
D．為降低免疫排斥反應(yīng)，可通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除相關(guān)抗原蛋白基因
【答案】　C
【解析】　若要對一個(gè)基因進(jìn)行編輯，由于基因含有兩條互補(bǔ)的單鏈，因而通常至少需要設(shè)計(jì)兩個(gè)序列不同的sgRNA 與目標(biāo)DNA的兩條鏈進(jìn)行配對，A正確；由于DNA和RNA之間可進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，因而sgRNA可以特異性識別目標(biāo)DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯鍵，進(jìn)而可以將目標(biāo)基因剪切下來，B正確；sgRNA序列越短，DNA分子上與其互補(bǔ)的特定序列會(huì)越多，錯(cuò)誤結(jié)合概率越高，脫靶率越高，C錯(cuò)誤；為降低免疫排斥反應(yīng)，可通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除相關(guān)抗原蛋白基因，進(jìn)而可避免免疫排斥反應(yīng)發(fā)生，為異體器官移植提供保障，D正確。
2. (2024·杭州模擬)通過設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5′端分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述正確的是(　　)
A．在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離脫氧核糖核苷酸、ATP、Taq DNA聚合酶等
B．第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/4
C．引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識別位點(diǎn)有利于DNA聚合酶識別和結(jié)合
D．第2輪PCR，引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長的突變基因
【答案】　B
【解析】　在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離脫氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等，但不需要加入ATP，A錯(cuò)誤；在第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA有2個(gè)，總DNA分子共8個(gè)，所以比例為1/4，B正確；引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識別位點(diǎn)，可以配合載體的限制酶識別位點(diǎn)，幫助目的基因定向定點(diǎn)插入載體，避免發(fā)生自身環(huán)化，C錯(cuò)誤；第2輪PCR，引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈不等長的突變基因，其中②較長，D錯(cuò)誤。
3. (2024·邵通模擬)大引物PCR定點(diǎn)突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，如圖表示利用大引物PCR對基因M進(jìn)行定點(diǎn)誘變。下列說法錯(cuò)誤的是(　　)
A．第一輪PCR中，至少需要2個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板
B．第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產(chǎn)物DNA的兩條鏈
C．?dāng)U增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物通常需具備啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯
D．為了使兩輪PCR在同一支試管中進(jìn)行，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)考慮不同的退火溫度
【答案】　B
【解析】　第一輪PCR中，需要先合成一條鏈，再用這條鏈合成互補(bǔ)鏈，至少需要2個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板，A正確；第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴(kuò)增的大引物外，第二輪PCR仍需加入的引物是另一種側(cè)翼引物，以便進(jìn)行另一條鏈的延伸，B錯(cuò)誤；若要使目的基因可以表達(dá)出蛋白質(zhì)，則需要在PCR擴(kuò)增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物上具備啟動(dòng)子和終止子，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，C正確；為了使兩輪PCR反應(yīng)在同一支試管中進(jìn)行，引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮不同的退火溫度，第二輪PCR的退火溫度應(yīng)該比第一輪高，D正確。
4. (2024·蘭州模擬)蛋白質(zhì)工程中可以利用引物引導(dǎo)的方法對DNA進(jìn)行定點(diǎn)突變，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的特定氨基酸。圖示為這種定點(diǎn)誘變方法的實(shí)驗(yàn)流程。據(jù)圖分析，下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A．待突變質(zhì)粒的甲基化修飾不會(huì)影響PCR擴(kuò)增
B．用于突變的兩條引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對
C．圖中所示限制酶能夠識別質(zhì)粒中發(fā)生甲基化的位點(diǎn)
D．突變質(zhì)粒缺口補(bǔ)齊依賴于大腸桿菌DNA連接酶的作用
【答案】　B
【解析】　甲基化修飾屬于表觀遺傳的一種，只會(huì)影響基因的表達(dá)過程，不會(huì)影響基因的復(fù)制，而PCR擴(kuò)增的實(shí)質(zhì)就是DNA在體外進(jìn)行復(fù)制，所以待突變質(zhì)粒的甲基化修飾不會(huì)影響PCR擴(kuò)增，A正確；由圖可以看出，用于突變的兩條引物之間在第三、四幅圖(從左往右)中都進(jìn)行了堿基互補(bǔ)配對，B錯(cuò)誤；由圖可以看出，經(jīng)限制酶切割后，被甲基化修飾的待突變質(zhì)粒模板被切割(第四幅圖虛線的環(huán))，所以圖中所示限制酶能夠識別質(zhì)粒中發(fā)生甲基化的位點(diǎn)，C正確；由圖可以看出，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后突變質(zhì)粒的缺口被補(bǔ)齊，而大腸桿菌中有DNA連接酶，且DNA連接酶可以進(jìn)行DNA片段之間的連接，所以突變質(zhì)粒缺口補(bǔ)齊依賴于大腸桿菌DNA連接酶的作用，D正確。
5. (2024·綿陽模擬)隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，科學(xué)家已能在極短時(shí)間內(nèi)對基因進(jìn)行編輯，更改生命密碼，揭示生命的運(yùn)作原理。科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)利用這一技術(shù)能在許多方面為人類服務(wù)，比如利用轉(zhuǎn)基因蚊子達(dá)到消滅蚊子的目的。
(1)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對雙鏈DNA的精確切割，由三部分組成：crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白，如圖1。crRNA與tracrRNA結(jié)合形成sgRNA，sgRNA依據(jù)______________________原則與靶向序列特異性結(jié)合，引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂，細(xì)胞在修復(fù)斷裂的DNA時(shí)會(huì)隨機(jī)插入、刪除或替換部分堿基對，從而引發(fā)__________________。
(2)研究者利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和同源重組修復(fù)技術(shù)提高蚊蟲群體中雄蚊比例，以達(dá)到有效控制雌蚊叮咬人類傳播多種傳染病的可能。同源重組修復(fù)是一種高保真的DNA雙鏈斷裂、修復(fù)技術(shù)，原理如圖2，其過程為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)切割使DNA特定部位的________________鍵斷裂后，啟動(dòng)同源修復(fù)，使得DNA上的靶向序列被替換成所需序列。通過________________技術(shù)將基因表達(dá)載體導(dǎo)入蚊子受精卵，該受精卵發(fā)育成雄性蚊蟲。Cas9蛋白將對應(yīng)的靶向序列進(jìn)行切割，以基因表達(dá)載體中同源序列間的DNA為模板進(jìn)行修復(fù)，最終實(shí)現(xiàn)子代都繼承相應(yīng)基因，使群體中雄蚊比例升高。
(3)除利用轉(zhuǎn)基因滅蚊之外，還存在寄生菌滅蚊技術(shù)。當(dāng)雄蚊被沃爾巴克菌感染后，精子會(huì)被細(xì)菌產(chǎn)生的毒素污染。健康雌蚊的卵細(xì)胞與這些“毒精子”相遇后，產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)不相容效應(yīng)，導(dǎo)致后代無法正常發(fā)育。相對于寄生菌滅蚊，利用轉(zhuǎn)基因滅蚊的優(yōu)勢有_______________ ______________________________________________________________________________________________________________________________________。(答出兩點(diǎn))
(4)目前我國尚不允許釋放轉(zhuǎn)基因蚊蟲，請結(jié)合已學(xué)生物學(xué)知識解釋原因：________________________________________________________ ________________________________________________________________________________。
【答案】　(1)堿基互補(bǔ)配對　基因突變　(2)磷酸二酯　顯微注射
(3)避免引入致病菌，減少污染；能穩(wěn)定遺傳，釋放少量蚊蟲即可起到控制作用；能夠持續(xù)起作用
(4)避免基因逃逸或轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散引發(fā)的基因污染等問題
【解析】　CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)類似基因工程中的限制酶，切割DNA上特定片段后插入目的基因。基因工程中動(dòng)物細(xì)胞一般選擇受精卵細(xì)胞作為受體細(xì)胞。(1)圖1中crRNA和tracrRNA結(jié)合形成sgRNA，sgRNA通過堿基互補(bǔ)配對原則與圖2中的同源序列結(jié)合，引導(dǎo)Cas9蛋白對DNA進(jìn)行切割。細(xì)胞在修復(fù)斷裂的DNA 時(shí)會(huì)隨機(jī)插入、刪除或替換部分堿基，從而引發(fā)基因突變，造成基因結(jié)構(gòu)的改變。(2)CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)切割使 DNA 特定部位的磷酸二酯鍵斷裂后，雙鏈斷裂，啟動(dòng)同源修復(fù)，使得DNA 上的靶向序列被替換成所需序列。將基因表
達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞受精卵使用顯微注射技術(shù)。(3)寄生菌滅蚊技術(shù)需要使用致病菌感染雄蚊，污染環(huán)境。相對于寄生菌滅蚊，利用轉(zhuǎn)基因滅蚊可以避免引入致病菌，減少污染；能穩(wěn)定遺傳，無須代代操作，釋放少量蚊蟲即可起到控制作用；能夠持續(xù)起作用。(4)轉(zhuǎn)基因蚊蟲有可能造成基因逃逸，擴(kuò)散到自然界其他生物，導(dǎo)致基因污染等問題，故目前我國尚不允許釋放轉(zhuǎn)基因蚊蟲。

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