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3.2基因工程的基本操作程序 課件(共30張PPT) 2024-2025學(xué)年人教版(2019)高中生物學(xué)選擇性必修3

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3.2基因工程的基本操作程序 課件(共30張PPT) 2024-2025學(xué)年人教版(2019)高中生物學(xué)選擇性必修3

資源簡(jiǎn)介

(共30張PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
DNA合成儀
顯微注射技術(shù)
1.酶切
同種限制酶
防止倒連、自連→兩端選擇兩種限制酶
防止切斷目的基因等→載體和目的基因選同尾酶
注意:限制酶特性
二、構(gòu)建基因表達(dá)載體
(1)限制酶的識(shí)別序列
限制酶所識(shí)別序列的特點(diǎn)是:呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱,無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基,都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的 ,稱為回文序列
在切割部位,一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。
能被限制性內(nèi)切酶特異性識(shí)別的切割部位都具有回文序列:
DNA連接酶
2.連接
①PCR法(注意引物的設(shè)計(jì))
②雙抗生素抗性基因鑒定
③測(cè)序法
3.鑒定
質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)整合在lacZ基因中,在多克隆位點(diǎn)插入外源目的基因,破壞了lacZ基因的結(jié)構(gòu),大腸桿菌形成白色的克隆。
否則形成藍(lán)色克隆。
典型例題
三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞
(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
①特點(diǎn):
Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。
易感染雙子葉植物和裸子植物,對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。
Ti質(zhì)粒
目的基因
構(gòu)建
表達(dá)載體
導(dǎo)入
植物細(xì)胞
插入
植物細(xì)胞染色DNA
表達(dá)
新性狀
轉(zhuǎn)入
農(nóng)桿菌
②轉(zhuǎn)化過程:
具有趨化性(酚)
注意:大多基因表達(dá)載體在受體細(xì)胞內(nèi)是獨(dú)立存在的!
兩次拼接:第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上;第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。
兩次導(dǎo)入:第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌;第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。
將目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞中方法------ 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
(2)花粉管通道法
用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi),剪去柱頭,將DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。
2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞
方法:顯微注射法
提純含目的基因表達(dá)載體
受精卵
顯微注射
移植到輸卵管或子宮
受精卵發(fā)育
新性狀動(dòng)物
(2)操作:
顯微注射技術(shù)
3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞
(1)微生物作受體細(xì)胞原因:
(2)常用法:
Ca2+處理
常用菌:
大腸桿菌
(3)過程:
Ca2+處理大腸桿菌
感受態(tài)細(xì)胞
表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合
感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA
繁殖快,多為單細(xì)胞,遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。
(感受態(tài)細(xì)胞法)
實(shí)例:利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物
原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性,需要在體外進(jìn)行再加工。
四、目的基因的檢測(cè)與鑒定
檢測(cè)—
鑒定——
③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)
抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等
——檢查是否成功
②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA
①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插
入了目的基因
常用PCR技術(shù)檢測(cè)DNA水平和RNA水平
用抗原抗體雜交技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)水平
DNA分子雜交
基因探針
待測(cè)DNA
單鏈DNA或RNA片段,帶有某種標(biāo)記,能與目標(biāo)DNA或RNA的一條鏈發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。
抗原—抗體雜交
分子雜交
(2)方法:RNA分子雜交
(3)方法:抗原—抗體雜交
鑒定——
抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等
例:用棉鈴飼喂棉鈴蟲,如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀,說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡,則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。
(4)個(gè)體生物學(xué)水平鑒定
基因編輯
1.CRISPR/Cas9
①設(shè)計(jì)合適的向?qū)蛄?br/>②將向?qū)蛄泻虲as9基因構(gòu)建基因表達(dá)載體
③轉(zhuǎn)化
④表達(dá)并組裝Cas9/gRNA復(fù)合體
⑤定點(diǎn)切割(敲除絕大部分外顯子/敲除個(gè)別外顯子,移碼突變)
⑥鑒定(PCR:擴(kuò)增出的條帶小或者無條帶/分子雜交/測(cè)序)
② Cre-lox 介導(dǎo)的基因組特定位點(diǎn)重組
1、兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相同,Cre重組酶敲除loxP間的序列;
2、兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相反,Cre重組酶誘導(dǎo)loxP間的序列翻轉(zhuǎn);
3、兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于不同的DNA鏈或染色體上,Cre重組酶誘導(dǎo)兩條DNA鏈發(fā)生交換或染色體易位。
DNA的粗提取與鑒定
探究和實(shí)踐
探究-實(shí)踐
DNA的粗提取與鑒定
(一)基礎(chǔ)知識(shí)
利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)上的差異,提取DNA,去除其他成分。
2、提取DNA分子的基本思路是什么?
1、提取大分子的基本思路是什么?
選用一定的物理、化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。
資料:當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 mol/L時(shí),DNA的溶解度最大
在NaCl溶液濃度低于0.14 mol/L時(shí),DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低;在0.14 mol/L時(shí),DNA溶解度最小;當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí),DNA的溶解度又逐漸增大。
如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出?
先用2mol/L NaCl溶液溶解DNA,再加入蒸餾水,使其溶液濃度從2mol/L下降到0.14 mol/L,使DNA在鹽溶液中析出。
① 描述DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線。
將DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離
酒精是一種常用有機(jī)溶劑,但DNA卻不能溶于酒精(特別是95%冷卻酒精),但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。
問:采用DNA不溶于酒精的原理,可以達(dá)到什么目的?
3、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性
①蛋白酶—水解蛋白質(zhì),對(duì)DNA沒有影響。
②高溫—大多數(shù) 在60~80℃時(shí)變性沉淀,而 在80℃以上才會(huì)變性。
③洗滌劑—溶解細(xì)胞膜,
去除 ;
但對(duì)DNA沒有影響。
蛋白質(zhì)
DNA
脂質(zhì)、蛋白質(zhì)
4、DNA的鑒定
在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色,因此用二苯胺試劑鑒定DNA分子。
DNA
+
二苯胺
沸水浴
藍(lán)色
30g洋蔥加10ml研磨液充分研磨
過濾,4℃放置幾分鐘,取上清液(也可離心1500r/min,5min)
加入等體積預(yù)冷酒精(95%),靜置2-3min
玻璃棒卷起絲狀物,吸去水分(或者離心10000r/min,5min)
溶于5ml,2mol/L的NaCl中,加入4ml二苯胺試劑,沸水浴5min
方法步驟
3-4mL體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精
取5 g菜花+ 2-3mL研磨液
研缽(加研磨液充分研磨,直至出現(xiàn)大量泡沫)
過濾至塑料燒杯
輕輕震蕩,出現(xiàn)白色絮狀物
2cm長(zhǎng)度香蕉,剪碎
加入10ml溫水,2g食鹽,5滴洗潔精,研磨
過濾
加入2g嫩肉粉,混合均勻,55-60℃水浴5-10min
冷卻,加入等體積預(yù)冷酒精
靜置2-3min,挑取白色絮狀析出物

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