資源簡(jiǎn)介 (共30張PPT)3.2 基因工程的基本操作程序DNA合成儀顯微注射技術(shù)1.酶切同種限制酶防止倒連、自連→兩端選擇兩種限制酶防止切斷目的基因等→載體和目的基因選同尾酶注意:限制酶特性二、構(gòu)建基因表達(dá)載體(1)限制酶的識(shí)別序列限制酶所識(shí)別序列的特點(diǎn)是:呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱,無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基,都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的 ,稱為回文序列在切割部位,一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。能被限制性內(nèi)切酶特異性識(shí)別的切割部位都具有回文序列:DNA連接酶2.連接①PCR法(注意引物的設(shè)計(jì))②雙抗生素抗性基因鑒定③測(cè)序法3.鑒定質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)整合在lacZ基因中,在多克隆位點(diǎn)插入外源目的基因,破壞了lacZ基因的結(jié)構(gòu),大腸桿菌形成白色的克隆。否則形成藍(lán)色克隆。典型例題三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn):Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。易感染雙子葉植物和裸子植物,對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌②轉(zhuǎn)化過程:具有趨化性(酚)注意:大多基因表達(dá)載體在受體細(xì)胞內(nèi)是獨(dú)立存在的!兩次拼接:第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上;第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。兩次導(dǎo)入:第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌;第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。將目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞中方法------ 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(2)花粉管通道法用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi),剪去柱頭,將DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法:顯微注射法提純含目的基因表達(dá)載體受精卵顯微注射移植到輸卵管或子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物(2)操作:顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞(1)微生物作受體細(xì)胞原因:(2)常用法:Ca2+處理常用菌:大腸桿菌(3)過程:Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA繁殖快,多為單細(xì)胞,遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。(感受態(tài)細(xì)胞法)實(shí)例:利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性,需要在體外進(jìn)行再加工。四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)—鑒定——③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等——檢查是否成功②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因常用PCR技術(shù)檢測(cè)DNA水平和RNA水平用抗原抗體雜交技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)水平DNA分子雜交基因探針待測(cè)DNA單鏈DNA或RNA片段,帶有某種標(biāo)記,能與目標(biāo)DNA或RNA的一條鏈發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。抗原—抗體雜交分子雜交(2)方法:RNA分子雜交(3)方法:抗原—抗體雜交鑒定——抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等例:用棉鈴飼喂棉鈴蟲,如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀,說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡,則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。(4)個(gè)體生物學(xué)水平鑒定基因編輯1.CRISPR/Cas9①設(shè)計(jì)合適的向?qū)蛄?br/>②將向?qū)蛄泻虲as9基因構(gòu)建基因表達(dá)載體③轉(zhuǎn)化④表達(dá)并組裝Cas9/gRNA復(fù)合體⑤定點(diǎn)切割(敲除絕大部分外顯子/敲除個(gè)別外顯子,移碼突變)⑥鑒定(PCR:擴(kuò)增出的條帶小或者無條帶/分子雜交/測(cè)序)② Cre-lox 介導(dǎo)的基因組特定位點(diǎn)重組1、兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相同,Cre重組酶敲除loxP間的序列;2、兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相反,Cre重組酶誘導(dǎo)loxP間的序列翻轉(zhuǎn);3、兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于不同的DNA鏈或染色體上,Cre重組酶誘導(dǎo)兩條DNA鏈發(fā)生交換或染色體易位。DNA的粗提取與鑒定探究和實(shí)踐探究-實(shí)踐DNA的粗提取與鑒定(一)基礎(chǔ)知識(shí)利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)上的差異,提取DNA,去除其他成分。2、提取DNA分子的基本思路是什么?1、提取大分子的基本思路是什么?選用一定的物理、化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。資料:當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 mol/L時(shí),DNA的溶解度最大在NaCl溶液濃度低于0.14 mol/L時(shí),DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低;在0.14 mol/L時(shí),DNA溶解度最小;當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí),DNA的溶解度又逐漸增大。如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出?先用2mol/L NaCl溶液溶解DNA,再加入蒸餾水,使其溶液濃度從2mol/L下降到0.14 mol/L,使DNA在鹽溶液中析出。① 描述DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線。將DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離酒精是一種常用有機(jī)溶劑,但DNA卻不能溶于酒精(特別是95%冷卻酒精),但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。問:采用DNA不溶于酒精的原理,可以達(dá)到什么目的?3、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性①蛋白酶—水解蛋白質(zhì),對(duì)DNA沒有影響。②高溫—大多數(shù) 在60~80℃時(shí)變性沉淀,而 在80℃以上才會(huì)變性。③洗滌劑—溶解細(xì)胞膜,去除 ;但對(duì)DNA沒有影響。蛋白質(zhì)DNA脂質(zhì)、蛋白質(zhì)4、DNA的鑒定在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色,因此用二苯胺試劑鑒定DNA分子。DNA+二苯胺沸水浴藍(lán)色30g洋蔥加10ml研磨液充分研磨過濾,4℃放置幾分鐘,取上清液(也可離心1500r/min,5min)加入等體積預(yù)冷酒精(95%),靜置2-3min玻璃棒卷起絲狀物,吸去水分(或者離心10000r/min,5min)溶于5ml,2mol/L的NaCl中,加入4ml二苯胺試劑,沸水浴5min方法步驟3-4mL體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精取5 g菜花+ 2-3mL研磨液研缽(加研磨液充分研磨,直至出現(xiàn)大量泡沫)過濾至塑料燒杯輕輕震蕩,出現(xiàn)白色絮狀物2cm長(zhǎng)度香蕉,剪碎加入10ml溫水,2g食鹽,5滴洗潔精,研磨過濾加入2g嫩肉粉,混合均勻,55-60℃水浴5-10min冷卻,加入等體積預(yù)冷酒精靜置2-3min,挑取白色絮狀析出物 展開更多...... 收起↑ 資源預(yù)覽 縮略圖、資源來源于二一教育資源庫(kù)