資源簡介

(共32張PPT)
四 mmngm
第一章發酵工程
第2節 微生物的培養技術及應用
人教版 ·選擇性必修3
問題探究
純培養
配制培養基
滅菌
具
接種
幾
分離
具
培養
自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中
分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的
微生物在混合的菌群中不是優勢種群時，僅通過一般 的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現。該怎么辦
由單一個體繁殖
所獲得的微生物 群體 。
> 如何從自然界中分離出需要的特定微生物
純培養物
聚合酶鏈式反應(PCR) 是一種在體外擴增DNA 片段的技術，
此項技術要求使用耐高溫的DNA 聚合酶。1973年，科學家布魯克 從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌(Taq 細 菌 ) , 進 而提取出耐高溫的DNA 聚合酶(Taq 酶 ) 。這種酶目前已被廣泛用 于聚合酶鏈式反應(PCR)。
> 討論：
1.篩選水生棲熱菌的思路是什么樣的
耐高溫的酶尋我→ 耐高溫生物體 尋找 高溫環境(熱泉、火山口)
2.為什么水生棲熱菌能從熱泉中篩選出來呢
這是因為水生棲熱菌能在70-80℃的高溫條件下生存，而絕大多數微生物在此條件下不能生存。
問題探究
美國黃石公園
啟示：尋找目的菌種時要根據它對 生存環境 的要求，到相應的環境中去尋找。
1.在被石油污染的土壤中可以篩選_分解石油 微生物。
2.在冰川凍土層可以篩選 耐 寒 微生物。
3.以纖維素為唯一碳源培養基_ 纖維素分解菌 o
實驗室篩選微生物原理：人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養、溫度和
pH) 等，同時抑制或阻止其他微生物生長。 選擇培養基應運而生。
一、選擇培養基
(1) 原 理 ：人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養、溫度和pH 等),同時抑制或阻止其他微 生物的生長。
( 2 ) 概 念 ：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長 的培養基，稱為選擇培養基。
( 3 ) 實 例 ：
> 70~80℃的高溫 —→ 分離耐熱菌 改變培養條件
> 不加碳源的培養基 — → 分離出自養微生物
營養缺陷
> 不加氮源的培養基 —→ 分離固氮微生物
> 加青霉素的培養基 — → 分離真菌(青霉素能殺死細菌、放線菌) 添加某種化
學物質
> 加高濃度食鹽 — → 分離金黃色葡萄球菌
> 加石油為唯一碳源 — → 分離出分解石油的分解菌 特殊碳、氮源
一、選擇培養基
培養基 培養基+氨芐青霉素
培養基中加氨芐青霉素
沒有抗氨芐青霉素
能力的菌落被淘汰 具有抗氨芐
青霉素能力 的細菌
問題：怎么證明一個選擇培養基具有選擇性呢
選擇培養基 怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細菌
一、選擇培養基
沒有氨芐 青霉素抗
性的細菌 能夠生長
思考討論： 怎么證明一個選擇培養基具有選擇性呢
應該設置基礎培養基(如牛肉膏蛋白胨培養基)或完全培養基作為對照，若
基礎培養基或完全培養基中生長的菌落數菌多于該選擇培養基，則該選擇培養基 具有選擇性。
基礎培養基 選擇培養基
問題：如果讓你配制一種培養基，讓土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出
來，培養基的配方該如何設計
一、選擇培養基
> 思考 · 討論：選擇培養基配方的設計
尿素[CO(NH ) ] 含氮量高，化學性質相對穩定，是現代農業生產中 一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細菌分解成NH ,
NH 再轉化成NO 、NH + 等被植物吸收。而這些細菌之所以能分解尿素， 是因為它們能合成脲酶 ，脲酶催化尿素分解產生NH ,NH 可作為細菌生 長的氮源。
> 怎樣才能將分解尿素的細菌從土壤中分離出來 尿 素
設計一種選擇培養基，用尿素作為唯一氮源，可以將分解尿素的細菌分離出來。
> 該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點
這種培養基與普通培養基相比，只是用尿素作為唯一氮源，培養基的其他營養成分基本相同。
一、選擇培養基
尿素的立體結構
1.從物理性質來講，兩者屬于固體培養基，判斷 依據是添加了凝固劑瓊脂 ;該類培養基的主要 用途為分離、鑒定、計數、保存。
2.從用途上來講， 培養基二 屬于選擇培養基， 目的是為了獲得 能分解尿素的微生物
3.兩種培養基共有的培養基成分有：
碳源、氮源、無機鹽、水。
培養基一的主要碳源為 牛肉膏，主要氮源為 蛋白胨 .
培養基二的碳源為 葡萄糖 ，氮源為 尿素 。
KH PO
1.4g
NaH PO
2.1g
MgSO ·7H O
0.2g
葡萄糖
10.0g
尿素CO(NH )
1.0g
瓊脂
15.0g
蒸餾水
定容到1000ml
牛肉膏
5.0g
蛋白胨
10.0g
NaCl
5.0g
瓊脂
20.0g
蒸餾水
定容到1000ml
鞏固練習
培養基二
培養基一
> 稀釋涂布平板法：
將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分
別涂布到固體培養基的表面，進行培養。在稀釋度足夠高的菌 液里，聚集在一起的微生物被分散成單個細胞，從而能在培養 基表面形成單個菌落。
選擇培養基 + 稀釋涂布平板 單菌落
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細菌，需要解決哪2個問題
① 選擇培養：獲得能分解尿素的細菌的純培養物。
② 計數：土壤菌液進行充分稀釋及科學的微生物數量測定方法—稀釋涂布平板法。
二、微生物的選擇培養
1mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
1×10 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107
1×10
2、稀釋涂布平板操作過程
第 1 步 ： 取 樣 并 稀 釋 1 0 倍 ② 將10g 土樣加入盛有
90mL 無菌水的錐形 瓶，充分搖勻。
第 2 步：系列梯度稀釋
3 取 1mL上清液加入盛有 9mL 無菌水的試管中， 依次等比稀釋。
二、微生物的選擇培養
① 鏟取土樣，將樣品
裝入紙袋中。
取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都
90 mL的無菌水
9mL 無 菌 水
需要滅菌。
10g
6 將涂布器放在火焰上灼 燒，
待酒精燃盡、 涂布器冷卻 后，再進行涂布。
不要將過熱的涂布器放在盛有酒精
的燒杯中，以免引燃其中的酒精。
9mL 無菌水
用涂布器將菌液均勻地涂布在
培養基表面。涂布時可轉動培 養皿，使涂布均勻。
2、稀釋涂布平板操作過程
第3 步：涂布平板
二、微生物的選擇培養
涂布結束后，要將涂布器灼燒滅菌。
⑤ :將涂布器浸入再盛 有酒 精的燒杯中
取出時，要讓多余的 酒精在燒杯中滴盡。
④ 取0 . 1mL 菌 液 ，
滴加到培養基表面
X0 區0 區 區m 區 0 區 0
1mL 1mL 1mL
1mL 1mL
1mL
耳
1×10
3、微生物培養
○待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30~37℃ 的恒溫培養箱中培
養1~2d 。 注意事項：涂布結束后，應將一個未接種的培養基和已接種
的培養基放在一起培養，以檢測培養基是否滅菌徹底。
○ 在涂有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。
二、微生物的選擇培養
稀釋106倍
稀釋105倍
稀釋104倍
空白對照
恒溫培養箱
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣
品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測除樣品
恰當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統計菌落數目的關鍵。
減少實驗誤差，保證實驗結果更準確
的平板進行計數。
中大約含有多少活菌。
一般選擇菌落數在30~300
因為當兩個或多個細胞連在一起，平板 上觀察到的只是一個菌落。
缺 點 統計的菌落數往往比活菌的實際數目低 。
同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數，然后取其平均值。
三、微生物的數量測定
因此，統計結果一般用 菌落數而不用活菌數來表示。
4、稀釋涂布平板計數法計數( 間 接 計 數 )
原 理
原 則
> 思考：平板劃線法能否達到對細菌進行計數的目的 為什么
不能，平板劃線法最開始的劃線
很可能菌類會長成一片，導致無
法計數，此外灼燒接種環的時候
也會殺死一部分菌類。
二、微生物的選擇培養
方法 平板劃線法
稀釋涂布平板法
純化原理 連續劃線
梯度稀釋→涂布平板
接種工具 接種環
涂布器
單菌落的獲得 從最后劃線區挑取
稀釋度合適的整個平板上都可找
到單菌落
用途 分離純化菌種， 獲得單菌落
①分離純化菌種，獲得單菌落
②用于計數
效果圖
相同點 ①都能分離純化菌種；②都在固體培養基上進行
二、微生物的選擇培養
平板劃線法與稀釋涂布平板法的比較
5、顯微鏡直接計數(直接計數)
原 理 利用特定的 細菌計數板 或 血細胞計數板 , 在顯微鏡下觀察、計
數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。
○細菌計數板 — 較薄，對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。
○血細胞計數板 — 較厚，用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數。 優 點 快速、直觀、設備簡單；能觀察微生物的形態特征。
也可選擇用臺盼藍染色法來區分活菌和死菌。
三、微生物的數量測定
缺 點 ①不能區分死菌和活菌，統計結果會偏大
②不適于運動的和個體小的細菌
量制濾字 02270113號
QIUJING B
XB.K.25 0.10mm 1/400mm
MC
無碳培養基+油煙污染物
A.圖中①~③的過程為梯度稀釋
B.在培養基中加入油煙污染物，其作用是為微生物提供碳源和能源
C.④使用的是固體培養基，需加入瓊脂作為微生物生長繁殖的營養物質
D.過程④可采用稀釋涂布平板法或平板劃線法分離菌種并進行計數
土壤樣品
培 養 培養
I Ⅱ
① ② ③
1.油煙污染由多種有害物質組成，不易降解。某同學從長期受到油煙污染的環
境中分離出油煙降解菌，其篩選分離過程如圖所示。下列敘述正確的是(B)
培 養
④ ⑤
鞏固提高
④
選取
①, ② 固體 ⑤ _ ⑥-
B.過程②可采用平板劃線法接種
C.過程③應選擇黃色菌株進行富集培養
D.培養基中添加β-紫羅酮起選擇作用
平③液體培養
接種
2. (2022 ·黑龍江雞西高二期末)如圖為選育高產β-胡蘿卜素的布拉霉菌的過程。
隨β-胡蘿卜素含量增加，菌體顏色從黃色加深至橙紅色。未突變菌不能在含有 β-紫羅酮的培養基上生長。下列有關敘述錯誤的是(C)
A.過程①屬于誘變育種 板培養
接種
紫外線照射
鞏固提高
胡蘿 卜素 的鑒 定
1.實驗目的：(1)從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌
(2)統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌
2.實驗原理： 絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才 能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中 分離出分解尿素的細菌。
常見的分解尿素的微生物：芽孢桿菌、小球菌、棒狀桿菌等細菌，某些真菌和
放線菌也能分解尿素。
四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
脲酶
2NH +CO
CONH ) +H O
3.實 驗 設 計 ：
(1)土壤取樣
細菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3~8 cm 的土
(2)制備培養基
①選擇培養基：以尿素為唯一氮源。
②牛肉膏蛋白胨培養基：
作為對照組，來判斷選擇培養基是否具有選擇作用。
葡萄糖
10.0g
尿素
1.0g
KH PO
1.4g
Na HPO
2.1g
MgSO ·7H O
0.2g
瓊脂
15.0g
蒸餾水
1000ml
四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作 完成后，一定要洗手。
壤層。鏟去表層土3cm 左右，取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。
注意
300 之間，適于計數的平板。
1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
102 10 104 105 106 107 10
立
10g 土樣 0 L水
1 10 10
2 ⑩ 106 3 10 109
⑩ 10
A組 B組 C組
(3)樣品的稀釋與稀釋涂布平板法接種
不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數在30~
選擇培養基(平行重復)
牛肉膏蛋白胨培養基(用以判斷選擇 培養基是否具有選擇作用)。
在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證
從中選擇出菌落數在30~300的平板進行計數 預實驗
測細菌數：一般用104 、10 、106 稀釋液
測放線菌：一般用10 、10 、105 稀釋液
測真菌數：一般用102 、10 、104 稀釋液
四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
選擇一個比較寬的范圍，將1×10 ~1×107倍稀 釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從 中選擇出菌落數在30~300的平板進行計數。
9mL 無菌水
107
107
107
(4)微生物的培養與觀察
① 培養條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。
(細菌一般在30-37℃的溫度下培養1-2d)
② 觀察：每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。以防止 因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。
稀釋度 10 10 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3
平均值
菌落數/ 平板
四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
思考：得到的菌落一定是分解尿素的細菌嗎 不一定，還需要進一步的鑒定。
在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑。培養某種細菌后，如果PH 升 高 ，
指示劑將變 紅，說明該細菌能夠分解尿素。
①液體培養基可以直接看液體的變色情況；
②固體培養基上可以觀察菌落周圍是否出現紅色環帶，紅色環 帶直徑與菌落直徑比值越大，說 明分解能力越強。
資料：細菌合成的脲酶將尿素分解為NH , NH 會使培養基的堿性增強，pH 升高，因此可以通過 檢測培養基pH 的變化來判斷是否發生了該化學反應，進而判斷該菌是否為尿素分解細菌。
四、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
pH 升高，酚紅指示劑變紅
4.進一步探究
脲酶 cO +2NH
CO(NH ) +H O
在培養基中加入某種指示劑或化學藥品(不影響微生
物正常生長),使微生物的某種代謝產物與培養基中的特 定指示劑或化學藥品發生反應。從而達到鑒定的作用。
> 幾種常用的鑒別培養基
拓展應用
大腸桿菌菌落呈現深紫色
伊紅—美藍培養基鑒別大腸桿菌
鑒別培養基：
伊紅—亞甲藍瓊脂培養基
念珠菌群顯色培養基
尿路菌群顯色培養基
淀粉培養基
普通培養基上所有菌種
都能生長
選擇培養基上部分菌種
才能生長
目的菌周圍出現特殊現象
非目的菌周圍無明顯現象
混合樣品
目的菌
非目的菌
> 培養基按用途分
選擇培養基
拓展應用
鑒別培養基
纖維素分解菌的篩選
纖維素其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為
它們能夠產生纖維素酶。已知剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這 樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等 發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅 與纖維素形成紅色復合物；而當纖維素被纖維素分解菌分解后，復合物 就無法形成，培養基中會出現以這些菌為中心的透明圈(如圖所示)。
(1)篩選纖維素分解菌的方法 剛果紅染色法 。該方法可以通過顏色 反應直接篩選。
(2)菌落周圍 有(有/沒有)透明圈，說明是纖維素分解菌。
幾種纖維素分解菌在剛果紅 培養基上形成的透明圈
拓展應用
下列有關本實驗的敘述，錯誤的是( C )
A.培養基除淀粉外還含有氮源等其他營養物質
B. 篩選分解淀粉的細菌時，菌液應稀釋后涂布
C.以上兩種細菌均不能將淀粉酶分泌至細胞外 D.H/C 值反映了兩種細菌分解淀粉能力的差異
菌種 菌落直徑： C(mm) 透明圈直徑： H(mm)
H/C
細菌I 5.1 11.2
2.2
細菌Ⅱ 8.1 13.0
1.6
1.篩選淀粉分解菌需使用以淀粉為唯一碳源的培養基。接種培養后，若細菌能分解
淀粉，培養平板經碘液處理，會出現以菌落為中心的透明圈(如圖),實驗結果見下表。
鞏固提高
透明圈
1. (2021 · 襄陽五中調研)下列關于“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實
驗操作的敘述，錯誤的是( B )
A.利用稀釋涂布平板法準確估計菌落數目的關鍵是有恰當的稀釋度
B.若要判斷選擇培養基是否起到了選擇作用需要設置未接種的牛肉膏蛋白胨 培養基作為對照
C.該實驗應采用稀釋涂布平板法
D.用以尿素為唯一氮源且添加了酸堿緩沖劑的培養基來培養該細菌后不會使 酚紅指示劑變紅
鞏固提高
2. (2021 · 山東淄博月考)下列關于土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的敘述.正確的是( A )
A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B.統計樣品中的活菌數目一般用平板劃線法
C.篩選分解尿素的細菌時，應以尿素作為培養基中唯一的營養物質
D.在以尿素為唯 一 氮源的培養基中加入酚紅指示劑，若指示劑變藍，則表明篩選到了分解 尿 素 的 細 菌
3.(2 021 · 四川綿陽期末)某同學將1 mL土壤樣液稀釋100倍，在3個平板上用稀釋涂布平板法分別接入
0.1 mL稀釋液，經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為56、57和58。下列敘述錯誤的是( D )
A.可得出土壤樣液中活菌大約為5.7×107個/L
B.此方法統計的菌落數往往比實際的活菌數目低
C.一般選擇菌落數為30~300的平板進行計數
D.顯微鏡直接計數法統計的是稀釋液中的活菌數
鞏 固 提 高
【概念檢測】
1.研究人員用無機鹽、瓊脂和石油配制的培養基從被石油污染的土壤中篩選出了一種
石油降解菌。判斷下列相關表述是否正確。
(1)這種培養基是一種選擇培養基。( √ )
(2)利用這種石油降解菌可以降解石油，修復土壤。( √ )
(3)相對于未被污染的土壤，從被石油污染的土壤中更容易分離到石油降解菌 ( √ )
2.用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落數就能
推測出樣品中的活菌數，原因是( D )
A. 菌落中的細菌數目是恒定的
B.平板上的一個菌落就是一個細菌
C. 通過此方法統計的菌落數與活菌的實際數目相同
D. 平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌
練習與應用
選擇培養基的作用
微生物選擇培養獲取純培養物的方法——稀釋涂布平板法
稀釋涂布平板法的操作過程
間接計數法—稀釋涂布平板法
直接計數—計數板計數法
科學實例
選擇培養基 篩選原則
選擇培養基的概念及舉例
①土壤取樣
②樣品的稀釋
③稀釋涂布平板法接種
④微生物的培養與觀察
微生物的選擇培養
微生物的數量測定
培養基的制備
實驗設計
實驗結果
土壤中分解尿素的細菌 的分離與計數
微生物的選擇培養和計數
課堂小結

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