資源簡介

(共56張PPT)
1997年，我國政府首次批準商 業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年， 我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100 多個，減少農藥用量40萬噸，增收 節支社會經濟效益450億元。
你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎 P77
從社會中來
轉基因抗蟲棉與普通棉花
普通棉花
(無抗蟲特性)
3.將目的基因 導入受體細胞
導入 棉花細胞
表達Bt基因
Bt基因 重組DNA 分子 抗蟲棉 4.目的基因的
檢測與鑒定
與載體拼接
2.基因表達 載體的構建
1.目的基因的 篩選與獲取
蘇云金桿菌
提取
第3章基因工程
第2節基因工程的基本操作程序
取出質粒
用限制酶切斷DNA
用連接酶連接目的基因
連接酶
高二生物組
本節主要解決的困惑
1.利用PCR獲取和擴增目的基因
2.基因表達載體的構建過程
原核細胞
真核細胞
不同點 編碼區是 連續_的
編碼區是間隔 的 、不連續的
相同點 都由能夠編碼蛋白質的 編碼區和具有調控作用的 非編碼區組成的
非編碼區：不能編碼蛋白質，調控遺
真核細胞基因的結構示意圖 傳信息的表達
包括：編碼區上游編碼區下游
點
錄
終
轉
點
錄
起
轉
非編碼區 編碼區(轉錄區) 非編碼區
啟動子 終止子
轉錄 轉錄
起點 終點
非編碼區
非編碼區
編碼區(轉錄區)
啟動子
終止子
知識回顧1:基因的結構
編碼區：編碼蛋白質的合成
原核細胞基因的結構示意圖
知識回顧1:基因的結構
名稱 功能 位置 序列特征 轉 錄 因 子 結 合 對 g e n e 表 達 的 影 響 啟動子 啟動gene的轉錄 gene的5'端上游 具有特定的序列特征，如 原核生物的啟動子具 有-10和-35區域，終止子 具有特定的終止信號 與RNA聚合酶及其 他轉錄因子結合 正向調控gene表達 終止子 終止gene的轉錄 gene的3'端下游 不需要 負向調控gene表達 內含子 在轉錄后被剪接掉， 不參與編碼蛋白質 gene內部，被外顯子分隔 內含子通常在5'和3'端具 有剪接位點，而外顯子則 包含編碼序列 不需要 兩者兼有 外顯子 編碼蛋白質的序列， 轉錄后保留在mRNA 中 gene內部，編碼區域的一部分 不需要 兩者兼有 增強子 增強特定gene的轉錄 活性 可以位于gene的任何位置，包 括上游、下游或內部 含有特定的調控序列，可 以與轉錄因子結合 與增強子結合蛋白 (如轉錄激huo因 子 ) 結 合 正向調控gene表達 沉默子 降低特定gene的轉錄 活性 可以位于gene的任何位置，包 括遠高gene的區域 與沉默因子結合 負向調控gene表達
需要細胞提供能量
需要解旋酶的作用
結果：氫鍵斷裂，雙鏈打開
游離的脫氧核苷酸
5'
DNA解 旋 酶
知識回顧2:DNA的復制過程
2 =2
# # z =4
#####z =8
DNA 聚 合 酶
新合成的子鏈
DNA 聚 合 酶
合成子鏈
解 旋
—
知識回顧3:基因的表達
轉錄
RNA 加工
■AAAA
AAAA
翻譯
細胞質
細胞核
內含子 外顯子
DNA
mRNA
蛋白質
真核細胞與原核細胞中基因表達過程示意圖
mRNA
mRNA
蛋白質
DNA
RNA
轉錄
翻譯
3.同種生物的不同細胞中，由于基因的選擇性表達，mRNA的種類和數量 一般是不相同的，但tRNA和rRNA的種類一般沒有差異。
基因B
3'- 5'
5'- 3'
基因A 基因C
模板鏈 非模板鏈
1 轉錄時，DNA鏈完全解開嗎 整個DNA都轉錄 邊解旋邊轉錄

轉錄不是轉錄整個DNA,是轉錄其中要表達的基因，以基因的一條鏈為模板，
2不同基因的模版鏈是否相同
點撥提升1
不同基因模板鏈不同
①原核生物細胞里沒有相應的 酶 來去除內含子；
②原核生物沒有真核的蛋白質 加工系統(如內質網、高爾基 體 等 )
真核基因：編碼區(外顯子+
內含子)
前體mRNA 一般不能產生原來的蛋白質
【思考1】:如果把一個真核生物的基因導入原核細胞中表達， 一 定會產生原來的蛋白質嗎
相應酶去除內含子
成 熟mRN 成熟
翻譯 mRNA
A Eis
內含子 外顯子
轉錄
多肽鏈
蛋白質
深度思考
加工
內含子
外顯子
內含子 外顯子 內含子 外顯子
代nWnwwwn 真核基因：編碼區(外顯子+內含子
轉錄 轉錄 )
前體mRNA
【思考2】:如果把真核基因導入原核細胞中表達，不考慮蛋白質加工的 問題，如何產生與原來結構相同的蛋白質
這種雙鏈DNA 是不含內含子 的DNA, 叫做
cDNA
相應酶 去除內含子
成熟 mRNA
把真核基因的cDNA 導入到原核細胞中表達。
提取 mRN逆轉錄酶DNA 單鏈 單 鏈
深度思考
DNA
雙鏈
酶
與生物抗逆性相關的基因 (Bt 抗蟲基因)
與優良品質相關的基因
2. 實 例 ： 與生物藥物和保健品相關的基因 ( 胰島素、干擾素基因)
與毒物降解相關的基因
與工業用酶相關的基因等
( 一 ) 從基因文庫中獲取；
3.目的基因獲取方法： (二)通過DNA合成儀直接合成；
(三)利用PCR技術擴增；
寰
目的基因的篩選與獲取
1. 目 的 基 因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或得預期表達產
物等的基因，主要指的是編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控 作 用 的 因 子。
涵：心①
① 0
霧
(一)從基因文庫中獲取目的基因 (未知序列)
1. 基因文庫概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入到受體菌的群體中 儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。
2.基因文庫類型： 基因組文庫 (包含一種生物的所有基因)
部分基因文庫(包含一種生物的一部分基因)(cDNA 文庫)
某種生物某個時期的mRNA
反轉錄
cDNA
與運載體連接導入
受體菌群體
部分基因文庫 (cDNA 文庫)
某生物體內全部DNA
限制酶
許多DNA片段
與運載體連接導入
受體菌群體
基因組文庫
(二)人工合成目的基因(已知序列)
1. 前 提 ：基因比較小、核苷酸序列已知
2. 方 法 ：通過DNA合成儀用化學方法直接合成目的基因
DNA 合成儀
DNA復制所需的基本條件 參與的組分 在DNA復制中的作用 解旋酶(體外用高溫代替) 打開DNA雙鏈 DNA兩條母鏈 提供DNA復制的模板 4種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 與兩條母鏈結合的2種引物 使DNA聚合酶能夠從引物3′端連接脫氧核苷酸 作用
1. 概 念 ：PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。
它是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分 與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。
2.方式： 以指數方式擴增，即_2n_ (n 為擴增循環的次數)
困惑點一：利用PCR獲取和擴增目的基因
3.條件：
探究要求： 合作交流
思考以下問題，小組合作交流，派代表展示成果，時間3min。
(1)什么是引物 DNA復制時為什么需要引物
是指兩段與待擴增的DNA序列互補的一小段DNA或RNA。
在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從引物的3′端延伸
( 1 ) 設 計一 對與目的基因兩側的部分脫氧核苷酸序列互補配對的引物 ( 保證以DNA的兩條鏈為模板進行擴增):
①為方便構建重組質粒，需在引物5'端添加適當的限制酶的識別序列/酶切位點；
② 為保證目的基因與載體正向連接，常在兩種引物上設計不同的酶切位點；
③為避免引物自身折疊，設計引物時需避免引物之內部形成堿基互補配對。
④ 為避免引物自連，設計引物時需避免引物之間形成局部堿基互補配對。
PCR過程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR 過程溫度較高，所以需要能耐高溫的DNA 聚合酶。
b. 復性 (復性55℃-60℃):系統溫度降低，引物與DNA模板結合
形成局部雙 鏈
50℃ (5)復性溫度與設計的引物(長度、堿基組成)有關：
①長度相同但G—C 含量高的引物需要設定的復性溫度較 高 ；②若復性溫度過高，則會破壞引物與模板的結合，可 能 導致PCR 反應得不到任何擴增產物。
4.利用PCR 獲取和擴增目的基因過程
3'
9 5°℃a.變性 (90℃-95℃):雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵 斷裂，
形成單鏈DNA
引物1 退火溫度低會造成非特異性條帶
72℃c. 延伸 (70℃ -75℃):在Taq酶的作用下，合成與模板互補
的DNA鏈_。
Taq酶
DNA引 物
引物2
Taq酶
引 物 1
DNA引 物
引物之
5'
3'
模 板DNA
比較項目 細胞內DNA復制
PCR技術
區 別 解旋方式 解旋酶催化
DNA在高溫下變性解旋
場所 主要在細胞核內
細胞外(主要在PCR擴增儀內)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等
熱穩定的DNA聚合酶(Taq酶)
溫度 細胞內溫和條件
控制溫度，需在不同溫度下進行
結果 合成整個DNA分子
擴增特定的DNA片段或基因
聯系 ①模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板 ②原料：均為四種脫氧核苷酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) ③酶：均需DNA聚合酶 ④引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成
知識小結：PCR 技術與細胞內DNA復制的比較
90℃以上， DNA 雙鏈解開 50℃左右，引物與DNA 結合
5'
72℃左右，新DNA 合成
第 一 次 循 環
3’
5'
3’
5' [
3’
5'
5'
高溫變性、低溫復性
3’
5'
第 二 次 循 環
3'
5'
5'
中 溫 延 伸
高溫變性、低溫復性
第 一 次 循 環
3’
5'
5’
中 溫 延 伸
次 循 環
第 三
3’
引 物
引 物
待擴增的DNA
(2)圖形顯示一輪循環產生的子鏈長度小于模板鏈的長度，
到第三輪循環時，才開始出現2個兩條脫氧核苷酸鏈等長的子代DN A。
弟 T 牝 發 制(Z 東 從 鏈 廠 第 乙 牝 發 制 ( 4 東 從 鏈 廠 第 ○ 機 友 制 0 示 從 旺7
DNA變性
再與引物復性 合成DNA
DNA 變性
再與引物復性 合成DNA
樣品DNA 變性 再與引物復性
etc.
etc,
etc.
etc.
etc.
合成DNA
復 制 次 數 1 2
3
D N A 分 子 數 2 4
8
含 引 物 的 D N A 分 子 數 2 4
8
含 其 中 一 種 引 物 的 D N A 分子數 1=2 -1 3=2 -1
7=2 -1
同 時 含 兩 條 引 物 的 D N A 分子數 0=2 -2 2=2 -2
6=2 -2
共 消 耗 引 物 的分子數 2=2 -2 6=2 -2
14=2 -2
含 脫 氧 核 苷 酸 鏈 等 長 的 D N A 分 子 數 0=2 -2 O=2 -4
2=2 -6
點撥提升1:PCR中的數量關系
例 1 6 利 用PCR 將某小段含目的基因的 DNA 分子擴增循環
n 次，則 B
A. 需要已知目的基因的全部序列以便設計引物
B.共需2"+1-2個引物參與子代 DNA 分子的合成
C.應向反應體系中加入解旋酶、DNA 聚合酶、緩沖液等
D. 理論上第4輪循環產物中含兩種引物的 DNA 片段占15/16 解析 只需要已知目的基因兩端的序列便可設計引物，A 錯 誤；擴增循環n 次，需一種引物的數量為2”-1,常規 PCR 共需 兩種引物的數量為2×(2”-1)=2"+ -2,B 正確；不需向 PCR 的反應體系中加入解旋酶，C 錯誤；理論上第4輪循環產物中含兩
種引物的 DNA 片段占(2 -2)/16=7/8,D 錯誤。
答案 B
學以致用1
d.標記基因 檢測目的基因是否導入受體細胞 (抗生素抗性基因)
e、復制原點： DNA聚合酶結合位點
2.基因表達載體的構建過程
困惑點二：基因表達載體的構建 (核心)
探究要求： 合作交流
表達特定性狀
位于基因的首端，是RNA聚合酶結合位點， 基因轉錄的開始
位于基因的末端，終止轉錄
思考基因表達載體的組成的相關問題，小組合作交流，派代表展示成果，時間3min。
表達載體
終止子
復制原點
抗生素基因
a.目的基因
b. 啟動子
c.終止子
1.基因表達載體的組成
插人基因
啟動子
啟 動 子
2.基因表達載體的構建過程
質粒
標記基因-
(1)用一定的限制酶 切割質粒，
使其出現一個切口，露出
黏性末端。
( 2 ) 用同一種限制酶 切斷目的基 因，使其產生 相同的黏性末端_。
終止子
目的基因
復制原點
限制酶切割位點
C限制酶 限制酶
獲取目的基因
D 連接酶
重組 DNA 分子
基因表達載體構建模式圖
(3)再加入適量DNA連接酶,將切下的目的基因片段插入質粒的 切 口 處，形成了一個重組DNA 分子(重組質粒)。
限制酶切割位點
DNA 分 子
限制酶處理
兩個切口
獲得目的基因
質粒
同種
一個切口
兩個黏性末端
限制酶切割位點
限制酶
獲取目的基因
標記基因一
限制酶
2.基因表達載體的構建過程
限制酶切割位點
啟動子、 終止子
重組DNA分子
(重組質粒)
連接酶
重 組DNA 分 子
DNA連 接 酶
目的基因
復制原點
質粒
【思考1】使用一種DNA 限制酶進行切割，是否只會得到目的基因與
載體結合的這一種重組DNA
目的基因自連
自連
質粒自連
目的基因與質粒連接
質粒與質粒連接
目的基因與目的基因連接
目的基因
L2
2
深度思考
21
1'
2'
21'
1
2'
片段間的 連接
載體
雙酶切
· 防止質粒重新環 化
· 防止質粒與目的 基因反向連接
· 防止目的基因自 身環化
【思考2】如何防止目的基因和質粒的自身環化以及目的基因的反
深度思考
自的基因(4 AGR
G
SA
向連接
山
表達載體
表達載體
復制 原點
8g/n
EcoR I
EcoR I
復制 原點
BglII
oe
A6
點撥提升2
①載體與表達載體的區別：
二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。
表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。
②工具酶： 限制酶、 DNA連接酶
兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵。
③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。
④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。
游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉錄并翻譯成蛋 白 質 ，游離的DNA 片段也無法隨著細胞分裂而進行復制，導致子代細胞中不再含有 目的基因。若將目的基因插入載體，由于載體可以在細胞內復制，隨著細胞分裂， 載體會帶著目的基因存在于每個子代細胞中 。這 樣 ，基因工程才有意義。
點撥提升3:重組載體的篩選
載體上的 一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵
抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性 基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性。在含有該抗生素 的培養基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞。
腸 桿 菌 1 : 未 吸 收
腸 桿 菌 2 : 吸 收 了
腸 桿 菌 3 : 吸 收 了
限 n 是 的 因am2
鹵 方向
啟 子 眼 終止上
質 粒
復 制原 點
未導入
廣 粒
擬 核DNA
大 腸 桿 菌 1
圖 2
復 原 點
晶命覆I
螺
擬 核DN
大 腸 桿 菌 2
亞 組 質 粒 子 入 大 腸 桿 首
任 何 質 粒 。
重 組 質 粒 。
空 質 粒 。
目 的 越 因
雙 n 切 t 切
目 的 基 因
重
制 原
窟
行 飾 選
組 質 粒
點
檢
擬 核DN 大 腸 桿 菌 3
眼 制n2
雙 的 切
切 吉 粒 壓 粒
露
并 進
標記基因
制n的1
大 大 天
4 . 2 0
)
)
)
1
2
3
(
(
(
子
菌
宣
我 們 需 要 的 是 大 腸 桿 菌 2 , 那 么 如 何 將 大 腸 桿 菌 1 和 大 腸 桿 菌 3 淘 汰 掉
首 先 ， 我 們 要 把 大 腸 桿 菌 1 和 大 腸 桿 菌 2 以 及 大 腸 桿 菌 3 進 行 區 分 。 這 個 很 簡 單 的 ，
因 為 我 們 的 質粒 上攜 帶 有 標 記 基 因 ， 如 圖 2 4 . 2 0 中 所 示 的 氨 芐 青 霉 素 的 抗 性 基 因 AmpR。 這
個 基 因 的 存 在 ， 就 可 以 賦 予 它 的 宿 主 細 胞 一 種 能 夠 多 抵 抗 氨 芐 青 霉 素 的 能 力 ， 即 能 夠 在 含 有
芐 青 霉 素 的 培 養 基 上 生 長 的 能 力 。 所 以 我 們 可 以 把 得 到 的 全 部 大 腸 桿 菌 稀 釋 涂 布 在 含 有 p 的 選 擇 培 養 基 上 ， 大 腸 桿 菌 1 無 法 生 長 ， 生 長 出 來 的 菌 落 不 是大 腸桿 菌 2 就 是 大 腸
* 菌 3 。
我們的目的基因一定要插入LacZ 基因的內部，即由于目的基因的插入，要將LacZ 基 因破壞掉。這樣，我們只需要將得到的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素以及X-gal 的培養 基上：
① 大腸桿菌1被氨芐青霉素殺死了；
② 大腸桿菌2由于LacZ 基因已經被破壞了，所以無法降解X-gal, 形成白色的菌落；
③ 大腸桿菌3由于沒有目的基因插入， LacZ 基因可以表達，所以可以降解X-gal, 形成藍色的菌落，如圖24.21所示。
的基因插入其中一個標記基因的內部，如Te 基因的內部。由于目的基因的插入，導致
Te 基因被破壞了，也就不再能夠賦予宿主細胞抗四環素的能力了。所以現在的情況是：
① 大腸桿菌1既不能抗氨芐青霉素，也不能抗四環素；
② 大腸桿菌2只能抗氨芐青霉素；
③ 大腸桿菌3既能抗氨芐青霉素，也能抗四環素。
所以我們可以把得到的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的培養基上，大腸桿菌1無法
生長，得到的菌落是大腸桿菌2或大腸桿菌3。然后我們把這些菌落原位轉印到含有四環 素的培養基上，有些菌落可以生長(大腸桿菌3),有些菌落無法生長(大腸桿菌2)。我們 需要的就是在氨芐青霉素的培養基上可以生長而在四環素的培養基上無法生長的那些大腸 桿菌。
(2)藍白斑篩選法：這種方法是目前實驗至經常使用的方法，原理說起來有點麻煩，但 操作很簡單。我們選用的質粒，除了有Amp 外，還有一個LacZ 基因。LacZ 基因編碼的 β-半乳糖苷酶，該酶可以將X-gal 降解為X 和gal 。X-gal 就是5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D- 吡喃半乳糖苷。X-gal 本身無色，被β-半乳糖苷酶水解得到5-溴-4氯-3-羥基-吲哚和 半乳糖。5-溴-4-氯-3-羥基-吲哚本身無色，但在空氣中會自發二聚并氧化為5,5'-二溴-4,4'- 二氯靛染料，是一種不溶的深藍色產物。半乳糖本身無色。
藍色菌落舍掉，白色菌落有的是需要
的菌落，有的并不是所需菌落，所以
后續一般還需要PCR等方式確認。
其次，如何區分大腸桿菌2和大腸桿菌3的問題。我們常用的做法有兩種：雙抗篩選
法和藍白斑篩選法。
(1)雙抗篩選法：這種方法是傳統的方法，其原理很簡單，操作稍麻煩。我們選用的質 應，除了有Am 外，還有一個抗生素的抗性基因，如四環素的抗性基因TeP 。將我們的
學以致用2
1.如圖是利用基因工程技術培育轉基因植物，生產可食用疫苗 的部分過程示意圖，其中PstI 、SmaI 、EcoR I 、Apal 為四種 限制酶。下列說法錯誤的是( C )
A. 圖示對質粒和目的基因切割用到了兩種限制酶
B.抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來
C. 構建基因表達載體時需要用到限制酶Sma l
D . 除圖示組成外，表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結構
PstI SmaI EcoRI
含抗原基
因的DNA
PstI
霉 質粒
ApaI
RI
aI
co
m
E
S
素基因
抗卡那
抗原基因
表達 載體
第三步：將目的基因(重組質粒)導入受體細胞
探究要求： 合作交流
思考有關轉化的相關問題，小組合作交流，派代表展示成果，時間3min。
1.轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩 定 和表達_的過程
將目的基因導入 農桿菌轉化法(最多)
植物細胞
花粉管通道法
2.方 法 ：將目的基因導入
將 入 ——感受態細胞 (Ca+處理)
微生物細胞
目的基因導
動物細胞 ——顯微注射法
使用Ca +處理可使細胞處于一種能吸收周圍環境中
DNA分子的生理狀態。 (感受態細胞)
◆ 過 程
微生物作為受體細胞的優點：
繁殖快，單細胞，遺傳物質相對較少 ，易于培養操作
Ca +轉化法(導入微生物)
表達載體與感受 態細胞混合
感受態細胞吸 收DNA分子
Ca +處 理 細胞
感受態 細胞
為什么常選用受精卵作為受體細胞呢
取受精卵 顯微注射 胚胎移植
①體積大，易操作。
②全能性高，易培養
成完整個體。
操作程序：
提純基因表達載體
顯微注射法(導入動物細胞)
病毒介導法(主要用于導入動物細胞)
科學家也用病毒DNA與目的基因一起構建的載體，去感染受體動物
細胞，也能使目的基因導入動物細胞內。 如用腺病毒載體，搭載新冠 病毒S基因，進入人體內，使人體產生對S蛋白的免疫記憶。
二 三 Adenoines Hest cels
△ 日 △m
Htecu na Wl Veoo1
腺 病 毒 包 裝 腺 病 毒 感 染 細 胞
10 dsy
o
會
Ncalntegrabao
ct bat ce
以 《
①用微量注射器將含目的基因的 DNA溶液直接注入子房中 ；
②在植物授粉后一定時間內， 剪去柱 頭， 將DNA溶液滴在花柱切面，使目 的基因通過花粉管通道進入胚囊。
花粉管通道法(我國獨創)
適用生物：開花植物
農桿菌細胞內含有的Ti質粒上的T-DNA 可轉 移至受體細胞，并且將其整合到該受體細胞染 色體 DNA 上
將目的基因插入
染色體的DNA 中
表現出新性 植物組織培養 狀的植株
兩次轉化
轉入
農桿菌
T-DNA
構建基因 表達載體
(Ti質 粒)
目的基因
農桿菌轉化法
導入 植物 細 胞 、
兩次拼接
重組
Ti質粒
知識小結：受體細胞的選擇
①轉基因植物用 體細胞(葉、芽、根)或受精卵
②轉基因動物用 受精卵 (一般不能用體細胞); 原因是：受精卵有發育的全能性 。
③微生物常用大腸桿菌、酵母菌 等。微生物作為受體細胞的優點 是_繁殖快，單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養操作 _。
④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等則受體細胞為真核細胞 原因是_ 分泌蛋白等需內質網、高爾基體等的加于
⑤一定不能用哺乳動物成熟的紅細胞，
原因是 _ 無核，無器，不能合成蛋白質 O
細胞種類 植物細胞 動物細胞
微生物細胞
常用 方法 農桿菌轉化法、 基因槍法、花 粉管通道法 顯微注射 技術
Ca +處理法
受體細胞 體細胞或受 受精卵
原核細胞
轉 化 過 程 精卵 以農桿菌轉化 法為例： 將 目 的 基 因 插 入 T i 質 粒 的 T - D N A 上 → 農 桿 菌 → 導 入 植 物 細 胞 → 整 合 到 受 體 細 胞 的 D N A 上→表達 將含有目的基 因的表達載體 提純→取受精 卵→顯微注射 →受精卵發育 →獲得具有新 性狀的動物
Ca +處理細胞 →
感受態細胞→重
組表達載體與感
受態細胞混合→
感受態細胞吸收
DNA分子
基因槍技術：
又被稱為生物彈道技術 或微粒轟擊技術，是用火 藥爆炸或者高壓氣體加 速將包裹了DNA的球狀金 粉或者鎢粉顆粒直接送 入完整的組織或者細胞 中的一種技術。它是基 因轉移技術中的一種方 法。
其基本原理就是采用一 種微粒加速裝置，使裹著 外源基因的微米級的金 或鎢(它們比重大，而且 化學性質都很穩定)顆粒 獲得足夠的動量打入靶 細胞或組織。
點撥提升4
目的基因導入受體細胞
1.在將目的基因導入受體細胞的相關操作中，敘述正確的是( C )
A.導入植物細胞時均采用農桿菌轉化法
B.轉基因動物的獲得多數運用基因槍法
C.大腸桿菌作為受體細胞時通常需要使用Ca + 處理
D.導入目的基因的動物受精卵在培養液中發育成轉基因動物
學以致用3
定
2.是否可以確定目的基因一定能夠進行表達
3.是否可以確定得到了新的性狀
不一定!
按前面三個步驟進行了操作，
1.是否可以確定目的基因進入了受體細胞并能維持穩
如何判斷
類型 檢測內容 方法
結果顯示
分子水 平檢測 目的基因是否插入 受體細胞染色體的 D N A 上 DNA分子雜交技術 (DNA和DNA之間)
是否顯示出雜 交帶(分子探
雜交后顯
是否轉錄出mRNA 分子雜交技術 (DNA和mRNA之間)
同上(分子探 雜交后顯
是否翻譯出蛋白質 抗原一抗體雜交
同上
個體水 平鑒定 包括抗蟲或抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗 性程度；基因工程產品與天然產品進行活性比較，以確 定功能是否相同等
第四步：目的基因的檢測與鑒定
翻譯
蛋白質 個 體
目的基因 轉錄 是否插入 |
針與DNA 示出來)
針與mRNA 示出來)
mRNA
知識拓展：基因探針
(1)定義：
是一段帶有檢測標記 (熒光或同位素標記),且順序已知的，與目 的基因能互補的核酸序列 (DNA 或RNA)。
(2)特點：
①應是單鏈，若為雙鏈，必須先行變性處理成單鏈。
②應帶有容易被檢測的標記。它可以包括整個基因，也可以僅僅是 基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉而來的RNA。
(3)核酸雜交： 互補的兩條核酸單鏈通過復性形成雙鏈的過程。
可以用于檢測目的基因：將待測DNA與目的基因探針混合，
如果發生了核酸雜交，則說明有目的基因。
1.制作出與目的基因序列相同的有同位素標記的DNA片 段 (基因探針), 并 用PCR 擴 增 ；
2. 提取受體細胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養液；
3.高溫變性處理，使之全部變為單鏈，觀察是否出現雜交DNA片段。
第四步：目的基因的檢測與鑒定
方法1: PCR擴增
方法2: DNA分子雜交技術
基本思路：
原理： DNA半保留復制
原理： 堿基互補配對
①.檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因
②.檢測目的基因是否轉錄出了mRNA
方法：PCR擴增或DNA分子雜交技術
基本思路：
1. 制作出與目的基因序列相同的有同位素標記的DNA(cDNA)片 段 (基因探針), 并用PCR擴增；
2. 提取受體細胞全部RNA, 直接與基因探針置于同一培養液；
3.高溫變性處理，使之全部變為單鏈，觀察是否出現分子雜交片段
第四步：目的基因的檢測與鑒定
第四步：目的基因的檢測與鑒定
方法：抗原-抗體雜交技術
蘇云金桿菌
o
O
原理：抗原抗體的特異性結合
標記抗體
③.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質
抗原
提取蛋白
電泳分離
轉基因生物
Bt抗蟲蛋白
二 二
雜交
提取
DNA分子 限制酶切 ① 瓊脂糖凝- 膠電泳 硝酸纖- 維素膜 ⑦ 放射 自顯影 DNA 片段
②電泳
③↓變性
④↓轉膜
⑤ 加入特異 V性探針
⑥| 洗膜
SDS- 聚丙烯- 酰胺凝膠電泳 硝酸纖- 維素膜 ⑤放射 自顯影 ①電泳
② 轉膜
③、加入標記
④|洗膜
瓊脂糖凝- 膠電泳 硝酸纖— 維素膜 ⑤放 射 自顯影 ①電 泳
② 轉膜
③ 加入特異 V性探針
④| 洗膜
點撥提升四
抗原一抗體雜交
各種蛋白質
分子雜交
各種RNA
DNA分子雜交
V的抗體
類型 檢測內容
方法
個體生物學 個體是否具有相應性狀
抗蟲、抗病的接種實驗
水平的鑒定 或產物是否具有功能活性
產品功能活性比較
第四步：目的基因的檢測與鑒定
2.個體水平的檢測
蟲沒有死
沒有表達
蟲被殺死
目的基因表達
沒有抗蟲基 因的棉植株
有抗蟲基因 的棉植株
實例：如何鑒定轉基因抗蟲棉是否培育成功
接種
棉鈴蟲
非轉基因
轉Bt基因
轉基因生物 鑒定方法
成功標志
抗蟲植物 飼喂害蟲(抗蟲接種實驗)
害蟲死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)接種實驗
未染病
抗鹽堿植物 一定濃度的鹽水澆灌
正常生長
抗除草劑植物 噴灑除草劑
正常生長
獲取目的基因產物 的轉基因生物 提取細胞產物與天然產 品進行功能活性比較
功能、活性 正常
個體生物學水平的鑒定具體方法舉例
階段 I 階 段 Ⅱ →
A. 階段 I、Ⅱ 應用的技術分別是重組DNA技術、植物組織培養技術
B. 對耐鹽基因表達產物的檢測可采用抗原抗體雜交技術
C. 可用抗生素抗性基因作為探針來檢測受體細胞中是否導入了目的基因
D. 可用PCR檢測受體細胞中的耐鹽基因是否轉錄出mRNA
1.如圖為科學家利用耐鹽堿植物中的耐鹽基因培育耐鹽水稻
新品系的過程。下列相關說法錯誤的是( C )
抗生素抗性基因
水稻 細胞
C
耐鹽基因
b
學以致用4
耐鹽基因
d
a
篩選合適的目的基因
利 用PCR技術擴增目的基因
組成：啟動子、目的基因、 終止子、標記基因等
構建：限制酶切割、 DNA 連接酶連接
植物細胞：花粉管通道法、
農桿菌轉化法
動物細胞：顯微注射法
原核生物細胞： Ca +處理法等
目的基因的
篩選與獲取「
基因表達載
體的構建
基因工
程的基
本操作
程序
將目的基因導 入受體細胞
分子水平的檢測
個體生物學水平的鑒定
整體建構
DNA
片段 的擴 增及 電泳 鑒定
目的基因的 檢測與鑒定

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