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(共33張PPT)
生物學（新人教版）
生物技術與工程
第三章 基因工程
第 1 節
重組DNA技術的基本工具
Biology
　　指按照人們的愿望,進行嚴格的設計并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性,創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。
【歸納定義】工程別名：
操作對象：
操作水平：
工程實質：
什么是基因工程？
重組DNA技術
基因
DNA分子水平
基因重組
從社會中來
番木瓜容易受番木瓜環斑病毒的侵襲。當番木瓜被這種病毒感染后，產量會大大下降。科學家通過精心設計，用“分子工具”培育出了轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。
轉基因番木瓜（左）與非轉基因番木瓜（右）
三種“分子工具”
“分子手術刀”
“分子縫合針”
“分子運輸車”
準確切割DNA分子
將DNA片段連接起來
將體外重組好的DNA分子導入受體細胞
一、限制性內切核酸酶（限制酶） ——分子手術刀
1、來源：
主要是從原核生物中分離純化出來的。
2、種類：
數千種
（限制酶不是一種酶，而是一類酶）
3、作用：
識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。（專一性）
1’
2’
3’
4’
5’
G
限制酶
1’
2’
3’
4’
5’
A
磷酸二酯鍵
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
一、限制性內切核酸酶（限制酶） ——分子手術刀
EcoR I
(在G與A之間切割)
Sma I
(在G與C之間切割)
5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
4、識別序列：
大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。
5、切割結果：
產生黏性末端或平末端
一、限制性內切核酸酶（限制酶） ——分子手術刀
黏性末端　　　　
黏性末端
只能識別GAATTC序列,并在G和A之間切開。
EcoRI 限制酶的切割：
一、限制性內切核酸酶（限制酶） ——分子手術刀
平末端　　　平末端
只能識別CCCGGG序列,并在C和G之間切開
Sma I限制酶的切割：
課堂練習：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ ______ EcoRⅠ_____
HindⅢ _____ BglⅡ _____
GATC
AATT
AGCT
GATC
思考：你從中發現什么現象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
根據你所掌握的知識你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
旁欄思考
限制酶就是細菌的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。
【反饋練習】
1.下面哪項不具有限制酶識別序列的特征（ ）
A．GAATTC B．GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C．CTGCAG D．CTAAATC
GACGTC GATTTAG
D
二、DNA連接酶 ——分子縫合針
1、作用：
將雙鏈 DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵 。
2、種類：
種類 E·coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來源
功能特性
相同點 大腸桿菌
T4噬菌體
只能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段
既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對較低）
恢復的都是磷酸二酯鍵
兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來
可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，
注意: DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA；也不能連接RNA！
二、DNA連接酶 ——分子縫合針
T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低
二、DNA連接酶 ——分子縫合針
DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
相同點：都是催化磷酸二酯鍵形成的酶。
不同點：DNA聚合酶連接的是游離的脫氧核苷酸，需要模板；
DNA連接酶連接的是DNA片段。
3.幾種相關酶的比較
名稱 作用部位 作用結果
限制酶
DNA連接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯鍵
堿基對之間的氫鍵
將DNA切成兩個片段
磷酸二酯鍵
將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
磷酸二酯鍵
將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端
磷酸二酯鍵
將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈
二、DNA連接酶 ——分子縫合針
根據所學知識，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA連接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切斷a處的酶為_______
B.連接a處的酶為_______
C.切斷b處的酶為_______
①
③④
②
a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵
【反饋練習】
二、DNA連接酶 ——分子縫合針
質粒
將外源基因送入受體細胞, 在受體細胞內對目的基因進行大量復制.
1.作用：
動植物病毒
噬菌體
2.種類：
質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。
三、基因進入細胞的載體——分子運輸車
大腸桿菌及質粒結構模式圖
3、運載體需具備的條件
（1）有復制原點能夠在宿主細胞中復制并穩定地保存
（2）有一個至多個限制酶切點
（3）有某些標記基因
（4）對受體細胞無害、易分離
能進入受體細胞并在受體細胞內復制并表達；
便于與不同目的基因結合
便于鑒定和篩選
三、基因進入細胞的載體——分子運輸車
重組DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
重組DNA分子
1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。
2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？
不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。
限制酶
DNA連接酶
載體
①對受體細胞無害；
②有一個至多個限制酶切割位點；
③有特殊的標記基因；
④能自我復制或能整合到宿主DNA上。
質粒、λ噬菌體衍生物 、動植物病毒
基因工程的基本工具
作為載體的條件
種類：
磷酸二酯鍵
來源：
主要來源于原核生物
特點：
作用部位：
具有專一性
結果：
形成黏性末端或平末端
連接部位：磷酸二酯鍵
種類： E.coliDNA連接酶、T4 DNA連接酶
作用： 把兩條雙鏈DNA片段拼接起來
課堂小結
　　思考：
　　如何將DNA提取出來，并進行鑒定呢
四、DNA的粗提取與鑒定
1、基本思路
2、提取DNA的方法
選用一定的物理或化學方法，分離具有不同物理或化學性質的生物大分子
利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
四、DNA的粗提取與鑒定
3、實驗原理
DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精
DNA能溶于物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液
在一定溫度下，DNA被二苯胺試劑染成藍色
初步分離DNA和蛋白質
溶解DNA
鑒定DNA
0
0.14
NaCI濃度（mol/L）
四、DNA的粗提取與鑒定
4、材料用具
DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。
（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）
（1）選材：
（2）試劑：
①研磨液
②體積分數為95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺試劑
⑤蒸餾水
——溶解并提取DNA
——析出DNA
——溶解DNA
——鑒定DNA，要現配現用
四、DNA的粗提取與鑒定
稱取 ，切碎，放入研缽，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取 ；或將研磨液倒入塑料離心管中離心，取 。
在上清液中加入體積相等的、 溶液, 靜置2~3min，溶液中出現的 就是粗提取的DNA 。
（2）去除雜質——
（3）DNA的析出——
（1）破碎細胞——
洋蔥
研磨液
上清液
上清液
預冷的酒精
白色絲狀物
思考：如何評價結果？
——看提取物顏色
——看與二苯胺反應顏色的深淺
DNA純度
DNA的量
用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物；或將溶液倒入塑料離心管中離心，取沉淀物晾干。
析出DNA
四、DNA的粗提取與鑒定
5、方法步驟
將絲狀物或沉淀物溶于 溶液中，加入
試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min
（4）DNA的鑒定——
二苯胺
2mol/L的NaCl
空白對照組：
在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。
四、DNA的粗提取與鑒定
5、方法步驟
四、DNA的粗提取與鑒定
思考討論
1、選什么樣的材料實驗更易成功？用洋蔥做材料，為什么要充分研磨？
含DNA的生物材料都可以，選取DNA含量相對較高的生物組織，成功率更大。
充分研磨，可以破壞細胞壁，裂解細胞，釋放DNA。
四、DNA的粗提取與鑒定
2、豬血和雞血，哪個適合用作提取DNA的材料？操作時如何防止血液凝固？
思考討論
豬血（哺乳動物的成熟紅細胞）無細胞核，不適合；
雞血中紅細胞有核DNA，且核DNA的量較多，適合。
雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。
3、如果用雞血動物細胞做材料，也需要研磨裂解釋放細胞中的DNA嗎？
加入清水，讓細胞吸水脹破，釋放DNA。
如果是豬肝呢？
謝謝觀看

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