資源簡介

(共25張PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
本節(jié)聚焦
1、基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？
2、基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？
第一課時
1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。
你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？
培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？
例如：培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程
提取
棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)
蘇云金芽孢桿菌
抗蟲基因
與運(yùn)載體DNA拼接
導(dǎo)入
普通棉花(無抗蟲特性)
棉花植株(有抗蟲特性)
基因工程的基本操作程序：
獲：目的基因的篩選與獲取
構(gòu)：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
導(dǎo)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
檢：目的基因的檢測和鑒定
（核心）
從社會中來
一、目的基因的篩選與獲取
1、目的基因的概念：
在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等相關(guān)的基因。
根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。
如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。
資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt 抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。
科學(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt 抗蟲蛋白抵抗蟲害。
目的基因
2. 篩選合適的目的基因（1）
已知結(jié)構(gòu)和功能清晰
（2）利用測序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列對比工具（如BLAST）等，找到合適的目的基因。
測定：核酸和蛋白質(zhì)序列
查找：存儲和共享在序列數(shù)據(jù)庫中的堿基順序或氨基酸殘基順序及其注釋信息。
比對：查詢核酸序列（氨基酸序列）與數(shù)據(jù)庫中的相似序列。
提取
蘇云金芽孢桿菌
抗蟲基因
？
快速獲得大量抗蟲基因
明確了目的基因后，該怎么獲得它？
3. 目的基因的獲取方法
PCR
基因文庫
適用于：較小且全部序列已知的目的基因。
例：我國首批轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育使用
PCR基因擴(kuò)增儀
PCR技術(shù)由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。
什么是PCR？
4. 利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
（1）PCR: ①原理、②操作環(huán)境、③目的
①原理
②操作環(huán)境
③目的
④優(yōu)點：
可以在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因
⑤實質(zhì)：
在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程
p77
耐高溫的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2種）
穩(wěn)定的緩沖溶液
（一般添加Mg2+）
②PCR條件:
一.目的基因的篩選與獲取
四種脫氧核苷酸(dNTP)
激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶
3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因
什么是引物？引物的作用是什么？
思考討論
定義：引物是一小段能與DNA母鏈的一小段堿基序列互補(bǔ)配對的短單
鏈核酸。（長度通常為20-30個核苷酸）
作用：引物為DNA聚合酶提供了游離的3’端，使DNA聚合酶從3’端開
始拼接單個的核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
什么是引物？引物的作用是什么？
（2）PCR擴(kuò)增過程
待擴(kuò)增的DNA片段
引物
耐高溫的DNA聚合酶
4種脫氧核苷酸
變性
溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解旋為單鏈
復(fù)性
當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。
延伸
當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。
（2）PCR擴(kuò)增過程
第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。
第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。
（3）PCR小結(jié)
變性
復(fù)性
延伸
溫度：90℃以上
過程：目的基因DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃院蠼饩蹫閱捂?br/>溫度：50℃左右
過程：兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合
溫度：72℃左右
過程：4種脫氧核苷酸在耐高溫DNA聚合酶的催化下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，添加在引物的3’端，合成新的DNA鏈。
反復(fù)循環(huán)
結(jié)果：
1個模板DNA分子經(jīng)過n輪PCR，以指數(shù)方式擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出2n個DNA片段。
（2）PCR擴(kuò)增過程
【典例】下圖表示PCR的前三個循環(huán)，目的基因位于模板DNA分子中與兩種引物所對應(yīng)的位置之間，請據(jù)圖回答下列問題：
(1)經(jīng)過第幾輪擴(kuò)增后，擴(kuò)增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端？比例是多少？
第3輪；1/4。
(2)PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？
不是，PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對應(yīng)的特定DNA片段。
(3)如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？
根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計引物。
習(xí)題鞏固
1.下列有關(guān)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較的敘述，錯誤的是
A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實現(xiàn)解旋
C.體內(nèi)DNA復(fù)制需要能量，PCR反應(yīng)也需要能量
D.二者遵循的堿基互補(bǔ)配對原則相同
√
如何對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？
思考討論
瓊脂糖凝膠電泳
原理：
DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。
較小的DNA片段在凝膠中的移動相對容易，較大的DNA片段移動難。通過比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(標(biāo)準(zhǔn))，這些已知大小的片段稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣。
－
最短
最長
Bt基因
導(dǎo)入
棉花細(xì)胞
若將Bt基因直接導(dǎo)入棉花細(xì)胞不是更簡便嘛？那么能否這么做？這么做會導(dǎo)致什么結(jié)果？？？
游離的DNA進(jìn)入細(xì)胞體,一般會直接被分解,就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄——翻譯成蛋白,游離DNA也無法跟著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制,導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因
能夠直接導(dǎo)入
基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心
二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建
1.基因表達(dá)載體的目的
（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；
（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。
2.基因表達(dá)載體的組成
位置：
功能：
RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。
基因的首端（一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段）
人們所需要的基因
位置：
功能：
基因的尾端（一段特殊的DNA片斷）
終止mRNA的轉(zhuǎn)錄
用來鑒別或篩選含有重組DNA分子的細(xì)胞
基因表達(dá)載體的構(gòu)建
二
啟動子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別
總結(jié)
項目 啟動子 終止子 起始密碼 終止密碼
化學(xué)成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三個相鄰堿基 mRNA上三個相鄰堿基
位置 目的基因首端 目的基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端
作用 RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出RNA 決定轉(zhuǎn)錄 的結(jié)束 翻譯的 起始信號 決定翻譯過程的結(jié)束
3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程
基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖
載體
（質(zhì)粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶處理
帶有黏性末端或平末端的切口
帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA連接酶
重組DNA分子
（重組質(zhì)粒）
同一種
基因表達(dá)載體的構(gòu)建
二
培育抗蟲棉的簡要過程
使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，共有幾種連接情況？
選擇2種不同的限制酶同時對目的基因和質(zhì)粒切割，減少自連情況出現(xiàn)；
載體
目的基因
自連
片段間的連接
目的基因自連
質(zhì)粒自連
目的基因與質(zhì)粒連接
目的基因與目的基因連接
質(zhì)粒與質(zhì)粒連接
正向連接 反向連接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何解決這一問題？
二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建
二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建
②雙酶切的優(yōu)點
A、防止質(zhì)粒重新環(huán)化
B、防止質(zhì)粒與目的基因反向連接
C、防止目的基因自身環(huán)化
1.如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內(nèi)切核酸酶。下列說法錯誤的是(　　 )
B
A.卡那霉素抗性、基因的存在有利于將含有抗原基因的細(xì)胞篩選出來
B.表達(dá)載體構(gòu)建時需要用到限制酶SmaⅠ
C.圖示過程是基因工程的核心步驟
D.除圖示組成外，表達(dá)載體中還應(yīng)該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu)

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