資源簡介

(共35張PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
本節聚焦
1、基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？
2、基因工程操作的每一步涉及的技術和方法有哪些？
第二課時
獲取了足夠量的Bt基因后，下一步就是要讓基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代；同時，使Bt基因能夠表達和發揮作用。
構建基因表達載體（核心工作）
基因表達載體由哪些部分組成
復習提問
目的基因的篩選與獲取
基因表達載體的構建
將目的基因導入受體細胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的檢測與鑒定
基因工程的基本操作程序
自主學習：閱讀課本相關內容（P81），總結將目的基因導入受體細胞的方法有哪些，各個方法的原理是什么？各自適用于什么生物？
溫故知新
將目的基因導入受體細胞的方法
將目的基因導入
植物細胞
將目的基因導入
動物細胞
將目的基因導入
微生物細胞
農桿菌轉化法
花粉管通道法
——顯微注射法
——Ca2+處理法
我國科學家獨創
三、將目的基因導入受體細胞
轉化：指目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程。
三、將目的基因導入受體細胞
（一）導入植物細胞
農桿菌轉化法
花粉管通道法
(最多)
導入方法
1.花粉管通道法：
我國科學家獨創
①用___________將___________________直接注入____中；
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
②在植物受粉后的一定時間內，剪去____，將________滴加在________上，使目的基因借助___________進入_____；
柱頭
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
受體細胞：
受精卵
子房
花粉
柱頭
花粉管
精子
卵細胞
胚囊
目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程
2.農桿菌轉化法
①轉化：
②農桿菌特點：
a.能在自然條件下侵染___________和_________，而對大多數___________沒有侵染能力；
雙子葉植物
裸子植物
單子葉植物
b.農桿菌細胞內含有______，當它侵染植物細胞后，能將______上的______（___________）轉移到被侵染的細胞，并且將其_________________________；
Ti質粒
Ti質粒
T-DNA
可轉移的DNA
整合到該細胞的染色體DNA上
將目的基因插入_____________中，通過農桿菌的_____作用，就可以使目的基因___________
③利用農桿菌進行轉化的思路：
Ti質粒的T-DNA
轉化
進入植物細胞
農桿菌轉化法
插入外源基因的DNA
導入農桿菌
兩次拼接：
第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。
兩次導入：
第一次導入是將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌；
第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞。
⑤轉化的具體方法：
a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片_______________，然后_____________，并__________；
受體細胞為_______
與農桿菌共培養
篩選轉化細胞
再生成植株
體細胞
b.可以將____直接浸沒在________________中一段時間，然后培養植株并獲得____，再進行_____、_____等；
受體細胞為_______
花序
含有農桿菌的溶液
種子
篩選
鑒定
受精卵
1.顯微注射法
操作程序：
取受精卵
顯微注射
胚胎移植
為什么常選用受精卵作為受體細胞呢？
提純基因表達載體
①體積大，易操作。
②全能性高，易培養成完整個體。
將目的基因導入受體細胞
三
將目的基因導入動物細胞
使用Ca2+處理：
可使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。
過程
微生物作為受體細胞的優點：
繁殖快，單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養操作
Ca2+處理細胞
感受態細胞
表達載體與感受態細胞混合
感受態細胞吸收DNA分子
大腸桿菌細胞
將目的基因導入受體細胞
三
將目的基因導入微生物細胞
原核生物作為受體細胞產生的真核生物的蛋白質通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。
生物 種類 植物細胞 動物細胞 微生物細胞
常用 方法 農桿菌轉化法; 花粉管通道法 顯微注 射法 Ca2＋處理法(感受態細胞法)
受體 細胞 體細胞 受精卵 受精卵 原核細胞
小結：將目的基因導入受體細胞
四、目的基因的檢測與鑒定
請大家回顧基因表達的過程，推測可以從哪些方面進行檢測與鑒定？
Bt基因
mRNA
Bt抗蟲蛋白
抗蟲棉
PCR等技術檢測
抗原 — 抗體雜交技術
分子
水平
抗蟲鑒定
（個體水平）
1.檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因
四、目的基因的檢測與鑒定
方法①：PCR擴增
轉基因生物
提取DNA
DNA作為模板
PCR操作
是否擴增出目的基因
電泳操作
M：marker；1-陽性質粒；
2：原始品系；3-9轉Bt品系；
轉Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果
1.檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因
四、目的基因的檢測與鑒定
原因：帶標記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件互補配對，結合成雙鏈，從而出現雜交帶。
方法②：DNA分子雜交技術
標記的基因探針
四、目的基因的檢測與鑒定
2.檢測目的基因是否轉錄出了mRNA
轉基因生物
PCR操作
是否擴增出目的基因
逆轉錄
cDNA
提取RNA
mRNA作為模板
方法①：PCR擴增
RNA分子雜交(Northern Blot)流程圖
提取RNA
轉基因生物
方法②：RNA分子雜交技術
四、目的基因的檢測與鑒定
3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質
方法:
過程:
抗原-抗體雜交技術
若出現雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質。
蘇云金芽孢桿菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠體內
抗體
標記抗體
抗原
抗體
雜交
提取蛋白
電泳分離
轉基因生物
四、目的基因的檢測與鑒定
轉基因生物 鑒定方法 成功標志
抗蟲植物
抗病毒（菌）植物
抗鹽植物
抗除草劑植物
飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）
害蟲死亡
病毒（菌）感染（抗病接種實驗）
未出現病斑
鹽水澆灌
正常生長
噴灑除草劑
正常生長
4.個體水平：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等
類型 步驟 檢測內容 方法
分子檢測 第一步 轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 PCR等技術
第二步 目的基因是否轉錄出mRNA PCR等技術
第三步 目的基因是否翻譯形成蛋白質 抗原-抗體雜交技術
個體水平鑒定 抗蟲或抗病的接種實驗抗性以及抗性程度 抗性檢測； 基因工程產品與天然產品的功能活性比較 功能活性。
目的基因的檢測與鑒定
四
總結
1.目的基因的篩選和獲取-前提
利用PCR獲取和擴增
化學方法人工合成
2.構建基因表達載體-核心
目的基因、啟動子、終止子、標記基因
3.將目的基因導入受體細胞-關鍵
農桿菌轉化法(植物)、顯微注射法(動物) 、
Ca2+處理法(微生物);
4.目的基因的檢測與鑒定-保證
分子檢測：是否插入、轉錄、翻譯
個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等。
基因工程的基本操作程序（4個步驟）
有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。
使目的基因在受體細胞中穩定存在，并可進行遺傳、表達和發揮作用。
載體進入受體細胞穩定表達，才能實現一種生物的基因在另一種生物中的轉化。
才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩定遺傳和正確表達。
探究實踐
——DNA片段的擴增及電泳鑒定
PCR儀
DNA分子電泳
一、實驗原理：
（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。
1、利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理：
（2）PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理。一次PCR一般要經歷30次循環。
變性
90 C
延伸
72 C
退火
50 C
2、DNA片段電泳鑒定的原理：
（1）DNA分子具有________________，在一定的________下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著_______________________的電極移動，這個過程就是_______；
可解離的基團
pH
電泳
與它所帶電荷相反
（2） PCR的產物一般通過__________________來鑒定；
（3） 在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、________________和_____等有關
（4） 凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為________的______下被檢測出來。
瓊脂糖凝膠電泳
凝膠的濃度
DNA分子的大小
構象
染色
300nm
紫外燈
瓊脂糖凝膠電泳
探究實踐
——DNA片段的擴增及電泳鑒定
（二）實驗步驟
移液
用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。
離心
待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）。
反應
參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。
循環程序 變性 復性 延伸
預變性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
預變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合
可根據目的片段長度適當調整延伸時間。
1.DNA片段擴增的具體過程
DNA片段的擴增及電泳鑒定
DNA片段的電泳鑒定
配制瓊脂糖溶液
根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻
制備凝膠
將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜
加樣
將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物
電泳
接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳
觀察記錄
取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相
DNA片段的擴增及電泳鑒定——注意事項
1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。
DNA片段的擴增及電泳鑒定——結果分析與評價
1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？
可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。
探究實踐
——DNA片段的擴增及電泳鑒定
（四）實驗結果
2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。
如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。
如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；復性溫度過低；DNA聚合酶的質量不好，模板DNA出現污染；Mg2＋濃度過高等。
1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？
科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監測，2011年的數據顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數據表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。
到社會中去
2.科研工作者在沒有發現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？
科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。
（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。
（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物（非抗品種）輪作或套種等。
（3）國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區種植管理、加強抗性監測、 進行嚴格的安全生評價等。
到社會中去
1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農桿菌的Ti質粒上，然后用它侵染番茄細胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關表述是否正確。
（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）構建含有afp基因的Ti質粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶（ ）
（3）只要檢測出番茄細胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關PCR的敘述錯誤的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶
B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶
C.復性過程中引物與模板鏈的結合遵循堿基互補配對原則
D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和 4種核糖核苷酸
√
×
×
練習與應用（P83）
一.概念檢測
D
1.研究人員在研究轉基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩定性時，發現44株轉基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規律，在它們的自交后代中出現了較多的沒有卡那霉素抗性的植株。請查找相關資料，嘗試對這個問題作出解釋。
外源基因插入基因組中可能為單位點插入，或者同一染色體多位點插入，或者不同染色體多位點插入。大多數情況下，插入的位點難以做到定點插入；插入的拷貝數也是隨機的。因此，外源基因在轉基因植物中的遺傳是很復雜的。例如，科研人員在對轉GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的煙草進行基因表達分析時，發現部分轉基因植株的染色體DNA中整合了多個拷貝的基因，從而導致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩定性。
練習與應用（P83）
二、拓展應用
2.八氫番茄紅素合酶（其基因用psy表示） 和胡蘿卜素脫飽和酶（其基因用crtⅠ表示）參與β-胡蘿卜素的合成。pmi為磷酸甘露醇異構酶基因，它編碼的蛋白質可使細胞在特殊培養基上生長。科學家將psy和crtⅠ基因轉入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡蘿卜素，由此生產出的大米稱為 “黃金大米”。請根據以上信息回答下列問題。
【這項研究成果發表在《自然 生物技術》（Nature Biotechnology ）雜志上】
練習與應用（P83）
二、拓展應用
（1）科學家在培育“黃金大米”時，將ctrⅠ和psy基因導入含pmi基因的質粒中，構建了質粒pSYN12424。該項研究的目的基因是______ ，標記基因是_____ ，質粒pSYN12424的作用是______ 。
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
將目的基因送入水稻細胞
（2）在構建質粒載體時，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的識別序列？為什么？
不能。
如果目的基因序列中含有用到的限制酶的識別序列，限制酶可能將它切斷。
練習與應用（P83）
二、拓展應用
(3)請查找相關資料，了解科學家為什么 要培育“黃金大米”以及當前關于“是否要推廣 '黃金大米’”的各種爭論。你還可以提出自己的看法，并與同學交流討論。
維生素A在人體內具有非常重要的生理功能，對視力、骨骼生長、免疫功能等都有調節作用。但是，人體不能合成維生素A，需要從食物中攝取。維生素A缺乏癥是南亞地區常見的由營養不良導致的疾病，該地區的居民一般以秈稻作為主食。β-胡蘿ト素是維生素A的前體，在人體內它可以轉化為維生素A。因此，科學家將兩個參與β-胡蘿ト素合成的酶的基因轉入了秈稻中，使其胚乳中富含β-胡蘿ト素，期望讓人們通過日常食用主食就能補充足夠量的維生素A，從而降低維生素A缺乏癥的患病率。關于“是否要推廣'黃金大米'”的爭論主要圍繞其安全性、有效性等方面展開
練習與應用（P83）
二、拓展應用

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