資源簡介

(共34張PPT)
2.2.2
動物細胞融合技術與單克隆抗體
本節(jié)聚焦:
什么是動物細胞融合技術？
單克隆抗體是如何制備的？
單克隆抗體在臨床上有哪些應用？
第2節(jié) 動物細胞工程
植物體細胞雜交技術
植物細胞融合
植物組織培養(yǎng)
溫故而知新
植物體細胞雜交技術打破不同種植物之間生殖隔離的屏障，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育出新的作物類型。有沒有技術讓不同種動物的體細胞雜交，培育出集不同細胞優(yōu)勢于一身的動物細胞呢？
融合細胞
細胞
融合
37℃
40min
正在融合的細胞
紅色熒光染料標記膜蛋白
綠色熒光染料標記膜蛋白
人細胞
小鼠細胞
回顧必修一：細胞膜的結構
1970年 人-鼠細胞融合融合實驗
（1）動物細胞融合技術：指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術
誘導原生質體融合
物理方法：電融合法、離心法
化學方法：聚乙二醇融合法、
高Ca2+-高pH融合法
（2）原理：細胞膜具有流動性
誘導動物細胞融合
物理方法：電融合法
化學方法：聚乙二醇（PEG）融合法
生物方法：滅活的病毒誘導法
動物細胞工程
2.動物細胞融合
病毒的滅活
是指用物理或化學手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結構。
仙臺病毒
紫外線
滅活
喪失感染活性（不感染細胞）
保留融合活性（誘導細胞融合）
滅活病毒誘導細胞融合的原理
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。
動物細胞工程
2.動物細胞融合
1965年，研究證實了滅活的病毒在適當條件下確實可以誘導動物細胞融合。
（3）過程
動物細胞工程
2.動物細胞融合
雜種細胞經(jīng)第一次有絲分裂兩個核才融合
細胞融合完成的標志:
細胞核融合成一個核
(4) 結果：
形成單核細胞，具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息，可表現(xiàn)出兩個或多個親本的特點。
思考：誘導融合后的細胞一定具有雙方的遺傳信息嗎？為什么？
不一定，誘導A、B兩種細胞融合，融合后可能有A、B未融合細胞及AA、AB、BB等多種細胞，因此細胞融合后需要進行篩選。
動物細胞工程
2.動物細胞融合
①突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能。
②成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。
③利用細胞融合技術而發(fā)展起來的雜交瘤技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。
(5)意義：
植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較
比較項目 植物體細胞雜交 動物細胞融合
原理
融合前處理
誘導融合的方法
意義和用途
克服遠源雜交的障礙，
獲得雜種植株
細胞膜的流動性
細胞膜的流動性
植物細胞的全能性
去除細胞壁后誘導原生質體融合
使細胞分散后誘導細胞融合
物理：電融合法、離心法
化學：聚乙二醇融合法、
高Ca2+-高pH融合法
物理：電融合法
化學：PEG融合法
生物方法：滅活的病毒誘導法
制備單克隆抗體
動物細胞工程
2.動物細胞融合
【典例1】如圖為細胞融合的示意圖，下列敘述正確的是( )
A.若a細胞和b細胞是植物細胞，需先去壁再誘導融合
B.若a細胞和b細胞為植物原生質體，則可用滅活的病毒誘導融合
C.c細胞的形成與a、b細胞膜的選擇透過性有關
D.c細胞將同時表達a細胞和b細胞中的所有基因
A
動物細胞工程
2.動物細胞融合
一個捐獻者200~300ml的血漿，如果合格，只能治療2~3個患者，如何大量制備？
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
前段時間，全國在抗擊COVID-19疫情的時候，我們從新聞里看到很多康復者在捐獻血漿，用來治療其他病人。那么，血漿里到底是什么東西能夠治療新型冠狀病毒感染？
能夠引起機體產(chǎn)生特異性免疫應答的物質叫做抗原。
例如花粉、病菌、病毒等。
有時自身的組織或細胞也會成為抗原，如癌細胞等。
★什么是抗原？
★什么是抗體？由何種細胞產(chǎn)生？主要分布在哪里 起何作用？
當機體受到抗原刺激后由漿細胞產(chǎn)生的，并且能與該抗原發(fā)生特異性結合的具有免疫功能的球蛋白——抗體。
抗體主要分布于血漿中，也分布于組織液及外分泌液中。
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
從血清中分離抗體
B細胞
漿細胞
抗原
傳統(tǒng)抗血清
(多克隆抗體)
(一種抗原可存在多種抗原決定簇)
增殖分化
（多種）
反復注射刺激
（多克隆抗體）
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
（1）早期獲得抗體的方法
血清抗體（也稱多克隆抗體）
由血清中提取的抗體是由不同漿細胞產(chǎn)生的多種抗體的混合物，可達百萬種以上。
特點：產(chǎn)量低、純度低、特異性差、
反應不夠靈敏。
（2）一個大膽的設想
將能夠產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。那這樣就能夠提高抗體的產(chǎn)量、同時提高純度和靈敏性。
杰尼 丹麥
科勒 德國
米爾斯坦 英國
創(chuàng)立抗原選擇抗體學說，發(fā)明了單克隆抗體技術，因此獲得了1984年的諾貝爾生理或醫(yī)學獎。
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
①獲得單一的純抗體？
每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體
②大量？
讓B細胞大量繁殖（克?。┚涂梢援a(chǎn)生大量抗體了。
③B細胞不能無限增殖？
癌細胞
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
（2）一個大膽的設想
一種B淋巴細胞（只產(chǎn)生一種特定抗體）
能在體外大量增殖的骨髓瘤細胞
動物細
胞融合
雜交瘤細胞
動物細胞培養(yǎng)
大量的特定抗體
閱讀P48-49圖2-16，思考以下問題：
① 為什么給小鼠注射特定的抗原？
② 會有幾種細胞融合方式（只考慮兩個細胞融合）？
③ 雜交瘤細胞是如何篩選出來的？
④ 是否所有的雜交瘤細胞都能產(chǎn)生專一性抗體？
⑤ 有幾次篩選過程？目的是什么？
⑥如何大規(guī)模進行培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體？
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
（3）單克隆抗體的制備過程
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
注射特定的抗原
培養(yǎng)骨髓瘤細胞
多種B淋巴細胞
骨髓瘤細胞
用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞。
多種雜交細胞
誘導融合
用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選
① 為什么給小鼠注射特定的抗原？
② 會有幾種細胞融合方式（只考慮兩個細胞融合）？
資料：細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑。
B淋巴細胞
骨髓瘤細胞（A）
合成DNA
D途徑
S途徑
D途徑
氨基喋呤
A、AA、B、BB、AB1、AB2、AB3
骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合
多種雜交細胞
篩選雜交瘤細胞
（3）單克隆抗體的制備過程
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
HAT培養(yǎng)基
既能產(chǎn)生抗體，又能大量增殖
③ 雜交瘤細胞是如何篩選出來的？
氨基喋呤
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
對上述經(jīng)選擇培養(yǎng)的雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞。
（3）單克隆抗體的制備過程
【原理】將雜交瘤細胞培養(yǎng)液稀釋后滴入多孔板，如果稀釋度足夠高，多孔板的一個孔里就可能只有1個雜交瘤細胞，培養(yǎng)之后(即克隆化培養(yǎng))，用標記的抗原檢測每個小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體（抗原抗體能結合即為陽性孔）。這樣經(jīng)過多次克隆化培養(yǎng)以及有限稀釋法的篩選，就能選出需要的那種雜交瘤細胞。
多孔細胞培養(yǎng)板
抗體檢測板
陽性孔
④ 是否所有的雜交瘤細胞都能產(chǎn)生專一性抗體？
注射到小鼠腹腔內
體外培養(yǎng)
⑤ 有幾次篩選過程？目的是什么？
⑥如何大規(guī)模進行培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體？
兩次
一篩：篩選出既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞
二篩：篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞
將抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)，或注射到小鼠腹腔內增殖。
從細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲取大量的單克隆抗體。
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
單克隆抗體
二篩
雜交細胞
雜交瘤細胞
體外
細胞培養(yǎng)
小鼠腹腔內增殖
一篩
骨髓瘤細胞
誘導細胞融合
能分泌所需抗體的雜交瘤細胞
培養(yǎng)液中提取
經(jīng)過免疫的B淋巴細胞
動物細胞融合技術
動物細胞培養(yǎng)技術
特點：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖
特點：特異性強靈敏度高可大量制備
注射抗原
免疫
結合課文P53-54頁“單克隆抗體制備”部分和圖2-24，構建單克隆抗體制備過程模型圖：
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
單克隆抗體
腹水中提取
HAT培養(yǎng)基
克隆化培養(yǎng)
抗體檢測
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
（4）單克隆抗體的應用
①作為診斷試劑——最廣泛應用
資料1.用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的"早早孕診斷試劑盒"，在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10 d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。
單克隆抗體能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結合，并且可以大量制備。用于多種疾病的診斷和病原體鑒定。
甲胎蛋白（AFP）是一種特異性較強的腫瘤標志物，用甲胎蛋白作為______免疫小鼠，制備__________________，并與含有放射性同位素的標記物連接，單克隆抗體攜帶放射性標記物通過血液可到達全身幾乎所有組織。由于腫瘤細胞表面的______會和單克隆抗體特異性的結合，所以放射性同位素標記物就不斷積累在______上。通過一定的顯影技術就可以發(fā)現(xiàn)腫瘤所在。
抗原
抗AFP單克隆抗體
AFP
腫瘤
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
（4）單克隆抗體的應用
資料2.使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用。抗體—藥物偶聯(lián)物（ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現(xiàn)了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細胞毒素）三部分組成，它的作用機制如下圖所示。
②用于治療疾病和運載藥物
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
（4）單克隆抗體的應用
1.ADC和抗體和藥物各具有有什么作用？
2.除了細胞毒素，還有那些無知理論可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？
抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物發(fā)揮治療效應，如殺傷靶細胞。
可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療。
一些作用于細胞信號轉導通路的藥物 可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結合進行治療。
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
（4）單克隆抗體的應用
P50 思考與討論
單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應，因此檢測的特異性強和靈敏度高。
ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點。
3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優(yōu)勢？
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
（4）單克隆抗體的應用
P50 思考與討論
A.特異性強、靈敏度高
生物導彈
——單克隆抗體＋抗癌藥物
B.療效高、毒副作用小
動物細胞工程
3.單克隆抗體及其應用
（4）單克隆抗體的應用
②用于治療疾病和運載藥物
本堂小結
一.動物細胞工程
1.下列有關動物細胞融合與植物體細胞雜交比較的敘述，錯誤的是( )
A.它們的原理都涉及細胞膜的流動性
B.都可以用電融合法或PEG融合法誘導融合
C.融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細胞
D.前者主要是為了獲得細胞產(chǎn)品，后者主要是為了獲得雜種植株
c
一.概念檢測
練習與應用
2.科學家以SARS病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關敘述正確的是( )
A.利用該單克隆抗體可以診斷是否感染SARS病毒
B.體外培養(yǎng)單個B淋巴細胞可以獲得針對SARS病毒的單克隆抗體
C.將等量B淋巴細胞和骨髓瘤細胞混合，經(jīng)誘導后融合的細胞即為雜交瘤細胞
D.將純化的核衣殼蛋白反復注射到小鼠體內，從小鼠血清中分離出的抗體為單克隆抗體
A
假如你掌握了動物細胞融合技術，你想用這種技術來解決哪些問題？解決這些問題的大致思路是怎樣的？這樣做會有什么風險？請查閱相關資料，完善自己的思路，并形成文字報告，與同學交流。
可以利用動物細胞融合技術培育多倍體胚胎，研究其發(fā)育機制，甚至可能培育出新的物種。但是，目前相關技術還不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等問題，并且還可能帶來一些倫理方面的問題。
二、拓展應用
練習與應用
概述
應用
動物細胞融合
技術
過程
結果
意義
原理
融合方法
原理
應用
單克隆抗體的制備
免疫處理
第一次篩選
誘導融合
第二次篩選
大規(guī)模培養(yǎng)
診斷試劑
運載藥物
治療疾病
克隆化培養(yǎng)
抗體檢測
體外培養(yǎng)
小鼠腹腔
課堂小結
①未融合的細胞②多種雜交細胞
雜交瘤細胞
抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞（能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞）
用特定的選擇培養(yǎng)基
第一次篩選
克隆化培養(yǎng)、抗體檢測
第二次篩選（可進行多次）
注射到小鼠腹腔內
體外培養(yǎng)
獲取單克隆抗體
從小鼠腹水中
從細胞培養(yǎng)液中
注射特定的抗原
多種B淋巴細胞
骨髓瘤細胞
誘導融合
動物細胞融合
動物細胞培養(yǎng)
補充了解——克隆化培養(yǎng)和抗體檢測
★
有限稀釋法
每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞
側面模擬圖
克隆化培養(yǎng)一段時間
取上清液進行抗體檢測
補充了解——不同水平的克隆及實例
分子水平
細胞水平
個體水平
DNA復制、PCR技術
動物細胞培養(yǎng)
植物組織培養(yǎng)、動物細胞核移植
細胞水平
單克隆抗體的制備涉及什么水平的克隆？
思考
補充了解——不同水平的克隆及實例
分子水平
細胞水平
個體水平
DNA復制、PCR技術
動物細胞培養(yǎng)
植物組織培養(yǎng)、動物細胞核移植
細胞水平
單克隆抗體的制備涉及什么水平的克??？
思考

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