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第二章 第2節 動物細胞工程
第1課時：動物細胞培養
小面積燒傷：患者通過切除 + 植皮(自身)后恢復。
大面積燒傷？
皮膚的自體移植
使用他人皮膚如何？
患者自身的不夠用，如何解決？
培養自身細胞？
目前，科學家還在研究對皮膚干細胞進行培養，以獲得適合臨床上使用的人造皮膚。
通過細胞培養構建的人造皮膚
從社會中來
一、動物細胞培養的條件
動物細胞培養
1.概念
2.原理
從動物體中取出 ，將它分散成 ，然后在適宜的培養條件下，讓這些細胞 的技術。
相關的組織
單個細胞
生長和增殖
動物體
組織
單個細胞
細胞生長和增殖
取出
分散成
適宜條件
有絲分裂（細胞增殖）
培育的終點：細胞
將組織塊分散成單個細胞后，細胞所需的營養易供應，其代謝廢物易排出
3.目的
獲得細胞或者細胞產物，不能獲得完整動物個體
4.培養對象選擇
幼齡動物or老齡動物？Why
一、動物細胞培養的條件
動物細胞培養
幼齡個體細胞分化程度低、分裂能力強、容易培養
4.培養對象選擇
胚胎或幼齡動物的細胞
思考：體外培育皮膚細胞實際上是在體外模擬體內的生理條件進行的培養。你還記得為了維持正常的生命活動，機體給細胞提供了哪些適宜的條件嗎？
充足的營養
穩定的內環境
一、動物細胞培養的條件
動物細胞培養
5.培養條件
營養條件
其他條件
<
<
糖類
氨基酸
無機鹽
維生素
無菌、無毒的環境
適宜溫度、pH和滲透壓
適宜的氣體環境
動物細胞培養基本條件
不能以淀粉、蔗糖為碳源
一、動物細胞培養的條件
動物細胞培養
營養
直接用合成然培養基嗎？ Why？
合成培養基 + 血清等天然成分
含人類未知、細胞生長增殖所必需的物質，滿足細胞對未知營養成分的需求。
血清等天然成分
將細胞所需的營養物質按種類和所需量嚴格配制而成的培養基。
合成培養基
一般使用液體培養基也稱培養液。
培養瓶
培養皿
一、動物細胞培養的條件
動物細胞培養
無菌、無毒的環境
無毒
無菌
防止微生物污染
清除代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害。
目的：
定期更換培養液
①對培養液和所有培養用具進行滅菌處理
②在無菌環境下進行操作
③添加一定量的 抗生素
如何維持無菌、無毒的環境？
一、動物細胞培養的條件
動物細胞培養
溫度、pH、滲透壓
與相應動物內環境的理化性質保持一致。
①人體細胞外液的溫度一般維持在：
36.5±0.5℃
②正常人的血漿近中性，pH約為：
7.35~7.45
③滲透壓：
在37℃時，人的血漿滲透壓約為：
770 kPa
人體？
（1）哺乳動物細胞培養的溫度多以 為宜
36.5±0.5℃
（2）多數動物細胞生存的適宜pH為 ；
7.2-7.4
目的
維持細胞正常的形態和功能
指溶液中溶質微粒對水的吸引力。
（3）適宜的滲透壓：
一、動物細胞培養的條件
動物細胞培養
氣體環境
動物細胞培養所需氣體主要有_____和______
用培養皿或松蓋培養瓶,
在含有___________和____ __的混合氣體的________
O2
CO2
細胞代謝所必需的
維持培養液的pH
95%空氣
5%CO2
CO2培養箱
①組成
不同氣體的作用是什么？
②培養儀器
（95%）O2:
（5%）CO2：
液體培養基
松蓋培養瓶
2、用動植物成體的體細胞進行離體培養，下列敘述正確的是(　　)
A.都需要用含95%空氣和5%CO2的混合氣體的培養箱
B.都需要用液體培養基
C.都要在無菌條件下進行
D.都可體現細胞的全能性
C
1、下列關于動物細胞培養條件的敘述，錯誤的是(　　)
A.體外培養動物細胞時，培養環境必須保證無菌、無毒
B.在使用合成培養基時，通常還需要加入血清等天然成分
C.細胞培養液需要定時更換，以便清除其中的代謝廢物
D.可使用培養皿或松蓋培養瓶在25 ℃和純氧條件下培養
趁熱打鐵
D
二、動物細胞培養的過程
思考：在適宜的體外培養皮膚細胞培養條件下，怎么培養健皮膚細胞？能直接培養皮膚組織嗎？
不能，組織中的細胞與細胞緊密接觸在一起，會限制細胞生長和增殖。
怎樣解決這一問題？
放入CO2培養箱中培養
二、動物細胞培養的過程
傳代培養
放入CO2培養箱中培養
取動物組織
制成細胞懸液
轉入培養液進行原代培養
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
二、動物細胞培養的過程
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
1.取動物組織
取材對象:
取材原因:
動物胚胎或幼齡動物的組織、器官。
細胞分化程度低，增殖能力強易培養
2.分散成單個細胞
原因：
①從動物體取出的成塊組織中，細胞與細胞靠在一起，彼此限制了生長和增殖。
②利于細胞與培養液充分接觸，保證O2與營養供應和有害代謝物的及時排出，更易進行物質交換。
制成細胞懸液
取動物組織
二、動物細胞培養的過程
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
2.分散成單個細胞
蛋白質
不可以，因為胃蛋白酶的最適PH為1.5左右
細胞膜也含蛋白質，長時間會分解細胞膜蛋白，破壞細胞結構，把細胞消化掉。注意控制時間和酶用量。
①說明動物細胞間的物質主要是什么成分？
②用胃蛋白酶可以嗎？
③胰蛋白酶真的不會把細胞消化掉嗎，為什么？
機械的方法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間
方法:
纖維蛋白、膠原蛋白等
二、動物細胞培養的過程
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
3.制備細胞懸液
用培養液將細胞制成細胞懸液。
制成細胞懸液
取動物組織
放入CO2培養箱中培養
轉入培養瓶或培養皿進行原代培養
將細胞懸液放入培養皿或培養瓶內，置于適宜環境中進行原代培養。
概念:
二、動物細胞培養的過程
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
4.原代培養
制成細胞懸液
取動物組織
放入CO2培養箱中培養
轉入培養瓶或培養皿進行原代培養
懸浮生長類：
貼壁生長類：
培養細胞類型
能夠懸浮在培養液中生長增殖。
需要貼附于某些基質表面才能生長增殖。
往往貼附在培養瓶的瓶壁上。
——細胞貼壁
指動物組織經處理后的初次培養。
懸浮生長
細胞貼壁
二、動物細胞培養的過程
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
4.原代培養
懸浮生長類：
貼壁生長類：
培養細胞類型
能夠懸浮在培養液中生長增殖（血細胞、淋巴細胞）
需要貼附于某些基質表面才能生長增殖（多數細胞上皮、纖維、神經細胞等）
指動物組織經處理后的初次培養。
要求：培養瓶或培養皿的內表面光滑、無毒、易于貼附。
細胞貼壁過程
（大多數細胞屬于這種類型）
二、動物細胞培養的過程
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
4.原代培養
指動物組織經處理后的初次培養。
當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞通常會停止分裂增殖
懸浮生長類：
貼壁生長類：
培養細胞類型
會因細胞密度過大、有害代謝物積累和培養液中營養物質缺乏等因素而分裂受阻。
除受以上因素影響外，還會發生接觸抑制現象
思考：細胞培養一段時間，分裂會受阻，為什么？怎樣解決？
貼壁生長與接觸抑制
二、動物細胞培養的過程
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
4.原代培養
指動物組織經處理后的初次培養。
圓球形細胞剛開始鋪展貼壁生長（100×）
培養的動物細胞貼壁生長并進行有絲分裂（100×）
細胞單層貼壁生長鋪滿瓶壁后接觸抑制（100×）
二、動物細胞培養的過程
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
4.原代培養
指動物組織經處理后的初次培養。
正常細胞增殖到相互接觸的時，糖蛋白識別了這種信息，會使細胞停止繼續增殖，出現接觸抑制現象。某些異常細胞能解除這種現象
腫瘤細胞
正常細胞
瓶壁上的細胞層數是
一層（或單層）
失去接觸抑制，可以形成多層細胞
癌細胞的細胞膜上糖蛋白等物質減少
適宜條件下在培養液可以無限增殖下去
二、動物細胞培養的過程
4.原代培養
體外動物細胞培養如何解決細胞分裂受阻的問題呢？
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
指動物組織經處理后的初次培養。
制成細胞懸液
取動物組織
放入CO2培養箱中培養
轉入培養液進行原代培養
放入CO2培養箱中培養
傳代培養
需要對細胞進行分瓶培養，讓細胞繼續增殖。
——傳代培養
二、動物細胞培養的過程
5.傳代培養
體外動物細胞培養如何解決細胞分裂受阻的問題呢？
需要對細胞進行分瓶培養，讓細胞繼續增殖。
——傳代培養
即分瓶后的細胞培養。（細胞由原代培養瓶中分離稀釋后，轉到新的培養瓶中繼續培養的過程）
概念:
收集細胞
將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養
過程:
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
二、動物細胞培養的過程
5.傳代培養
分瓶
取動物組織
分散成單個細胞
制成細胞懸液
原代培養
傳代培養
收集細胞
懸浮生長類：
直接用離心法收集
貼壁生長類：
將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養
過程:
重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細胞，然后再用離心法收集
判斷依據：是否分瓶！
動物細胞的整個培養過程中可能多次用到胰蛋白酶或膠原蛋白酶：
第一次:
貼壁細胞傳代培養時：
使組織細胞分散開
使細胞從瓶壁上脫離下來，分散成單個細胞，便于分瓶后繼續培養。
二、動物細胞培養的過程
動物組織塊
分散成單個細胞
解決
懸浮生長
貼壁生長
(大多數）
細胞密度過大、有害代謝物積累、營養物質缺乏等
接觸抑制
傳代培養
用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理
制成細胞懸液
原代培養
分瓶
培養
①原代培養：指動物組織經處理后的初次培養。
②細胞貼壁：某些細胞需要貼附于某些基質表面才能增殖，這類細胞往往貼附在培養瓶的瓶壁上。
③接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞停止分裂增殖的現象。
④傳代培養：分瓶后的細胞培養。
加培養液
在培養皿或培養瓶內
細胞分裂受阻
②制成細胞懸液，分瓶培養
①收集細胞
注意：相關酶可使細胞裂解，應注意用量和時間
二、動物細胞培養的過程
比較項目 植物組織培養 動物細胞培養
原理
培養基性質
培養基特有成分
培養結果
是否體現全能性
相同點 植物組織培養和動物細胞培養的比較
否
常用固體培養基
完整的植株
葡萄糖、動物血清
常用液體培養基
細胞增殖
細胞的全能性
許多細胞
是
蔗糖、植物激素
1.培養過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數分裂
2.均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件
二、干細胞培養及應用
干細胞
1.概念
2.分布
3.分類
動物和人體內仍保留的少數具有分裂和分化能力的細胞。
在一定條件下，干細胞可以分化成其他類型的細胞。
干細胞存在于 、 和 等多種組織和器官中。
早期胚胎
骨髓
臍帶血
胚胎干細胞
成體干細胞
受精卵
原始胚胎干細胞
囊胚
胎兒
成人
胚胎干細胞
成體干細胞
二、干細胞培養及應用
1.胚胎干細胞(簡稱ES細胞)
1.分布
2.特點
3.應用實例
4.局限性
早期胚胎中
目前科學家已分離出了小鼠、兔、牛、猴和人等的ES細胞，在體外培養可分化分化成心肌細胞、神經元細胞和造血干細胞等
必須從胚胎中獲取，涉及倫理問題；因而限制了在醫學上的應用。
(1)形態上：
(2)功能上：
具有分化為成年動物體內的 類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至 的潛能。
任何一種
個體
體積小、細胞核大、核仁明顯。
具有發育的全能性。
二、干細胞培養及應用
2.成體干細胞
1.分布
2.常見類型
3.特點
5.應用實例
成體組織或器官內
造血干細胞（骨髓、外周血和臍帶血中）
神經干細胞（神經系統中）
精原干細胞（睪丸中）
具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發育成完整個體的能力
治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）
治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統、免疫系統功能障礙等疾病
造血干細胞
神經干細胞
發現最早、研究最多、應用最成熟
4.作用
有著自我更新能力 及分化潛能的干細胞，與組織、器官的 、 和
等密切相關。
發育
再生
修復
二、干細胞培養及應用
3.誘導多能干細胞(iPS細胞)
1.概念
2.制備方法
3.優點
4.應用
通過體外誘導小鼠成纖維細胞得到的類似胚胎干細胞的一種細胞
②用小分子化合物誘導形成。
①誘導過程無須破壞胚胎；
②iPS細胞可取自病人的體細胞，理論上可以避免免疫排斥反應。
可治療鐮狀細胞貧血癥；
在治療阿爾茲海默病、心血管疾病等領域的研究也取得新進展。
所以，科學家普遍認為iPS細胞的應用前景優于胚胎干細胞。
①將特定基因或蛋白導入細胞（成纖維細胞、已分化的T細胞、B細胞）。
二、干細胞培養及應用
iPS細胞應用
移植
取成纖維細胞等
iPS細胞
轉入相關因子
細胞發生轉化
分化
胰島細胞
神經元
血細胞
腸上皮細胞
心肌細胞
肝細胞
病人
iPS細胞用于治療人類疾病示意圖
取成纖維細胞
轉入相關因子
轉化為iPS細胞
誘導iPS細胞定向分化為多種組織細胞
移植回病人體內
二、干細胞培養及應用
干細胞將在再生醫學、藥物安全性與有效性檢測等領域發揮大作用。
面臨的問題：存在導致腫瘤發生的風險。
應用展望：
面臨的問題及展望
二、干細胞培養及應用
來源或存在 功能、特點 局限性
胚胎干細胞(ES細胞)
成體干細胞
誘導多能干細胞(iPS細胞)
早期胚胎
能夠分化成為動物體內的任何細胞，并進一步形成組織、器官甚至生物個體
成體組織或器官，如造血干細胞、神經干細胞和精原干細胞等
體外誘導體細胞產生
能分化成為具有特定功能的細胞來治療疾病。無須破壞胚胎，且避免免疫排斥反應。
具有組織特異性，能分化成特定的細胞或組織
不具有發育成完整個體的能力
需從胚胎中獲取，涉及倫理問題，限制了它在醫學上的應用
技術不成熟。
三種干細胞的比較
總結
動物細胞培養
動物細胞培養的概念和原理
動物細胞培養的條件
動物細胞培養的過程
原理：細胞的增殖
在適當的培養條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術
(1)營養條件
(2)無菌、無毒的環境
(3)溫度、pH和滲透壓
(4)氣體環境
取動物組織
單個細胞
細胞懸液
原代培養
傳代培養
干細胞培養及其應用
干細胞的分布
干細胞的類型
干細胞的應用
胚胎干細胞（ ES細胞）
成體干細胞
早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中
主要應用在醫學上
1.判斷下列有關動物細胞培養的表述是否正確。
(1)培養環境中需要O ，不需要CO 。 ( )
(2)細胞要經過脫分化形成愈傷組織。 ( )
(3)培養液中通常含有糖類、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清。 ( )
(4)培養瓶中的細胞需定期用胰蛋白酶處理，分瓶后才能繼續增殖。 ( )
×
√
×
×
教材課后習題·概念檢測
2.干細胞有著廣泛的應用前景。下列相關敘述錯誤的是 ( )
A.干細胞是從胚胎中分離提取的細胞
B、造血干細胞可以分化為各種血細胞
C.不同類型的干細胞，它們的分化潛能是有差別的
D.由iPS細胞產生的特定細胞，可以在新藥的測試中發揮重要作用
A
教材課后習題·概念檢測
現在關于iPS細胞的研究正在不斷深人。請你從以下兩個方面來查閱資料進行思考。
(1)由于誘導產生iPS細胞、促使其分化都需要時間，因此用某人特異的iPS細胞進行醫療只限于時間比較充裕的情形。從實際事故、疾病發生的不可預測性方面考慮，如果要將這些細胞用于緊急情況，應該提前采取什么措施
建立iPS細胞庫（HLA多態性豐富的iPS細胞庫），
可以為需要的人找到HLA匹配度較高的iPS細胞
教材課后習題·拓展應用
(2)如果誘導iPS細胞定向分化為生殖細胞的技術發展成熟，該技術可能會有哪些應用 又可能帶來哪些問題
可以用來治療不孕癥；可以用來進行瀕危物種的克隆；
可以對獲得的生殖細胞進行轉基因操作，再經過受精、胚胎發育等過程來獲得轉基因動物；
可能會帶來一系列的倫理問題，例如用同一個人的iPS細胞分別誘導形成精子和卵子，兩者受精可能培育出“單親”嬰兒，有的人還可能有目的地選擇iPS細胞，從而”設計”嬰兒
教材課后習題·拓展應用

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