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選擇性必修三《生物技術與工程》
第2章 細胞工程
第2節 動物細胞工程
（動物細胞培養）
1890年，希普（W. Heape，1855-1929）將安哥拉兔的胚胎移入比利時兔的輸卵管內，得到了兩只安哥拉兔，這是世界上胚胎移植成功的首例。
1907年，哈里森（R. G. Harrion，1870-1959）用一滴淋巴液成功培養了蝌蚪的神經元，首創了動物組織體外培養法。
1951年，張明覺（1908-1991）等發現哺乳動物精子的獲能現象。
1958年，格登（J. Gurdon，1933-）用非洲爪蟾進行體細胞核移植，成功培育出性成熟個體。同一時期，童弟周（1902-1979）等開展了魚類細胞核移植工作。
1959年試管兔誕生，之后多種試管動物相繼出生。
1975年，米爾斯坦（C. Milstein，1927-2002）和科勒（G. K hler，1946-1995）等創立了單克隆抗體技術。
1978年，小鼠桑葚胚被成功分割。次年，科學家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊。
1981年，埃文斯（M. J. Evans，1941-）等成功分離和培養小鼠的胚胎干細胞。
1996年，世界上第一只細胞克隆羊多莉在英國誕生。隨后多種克隆動物相繼問世。
2006年，山中伸彌（S. Yamanaka，1962-）等獲得了誘導多能干細胞。我國科學家利用這種細胞培育出了 小鼠。
2014年，世界上第一個用單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國誕生。
2017年，我國科學家首次培育出體細胞克隆猴。
動物細胞工程（含胚胎工程）
一、動物細胞培養
（一）概念：
從動物體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后在適當的培養條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術。
目的：
獲得細胞或細胞產物；不能獲得完整動物個體。
原理：
細胞增殖（有絲分裂）
動物細胞培養需要哪些條件？
動物細胞培養的基本操作過程是怎樣的？
怎樣客觀分析干細胞在臨床上的應用所產生的效益與風險？
（二）動物細胞培養的條件
動物細胞培養所需的基本條件
營養條件
其他條件
糖類、
氨基酸、
無機鹽、
維生素等
無菌、無毒的環境
適宜的溫度、PH和滲透壓
適宜的氣體環境
(1)合成培養基:將細胞所需的營養物質按_____________嚴格配制而成。
(2)在使用合成培養基時，通常需要加入 等一些天然成分
(3)培養動物細胞一般使用_____培養基,即培養液
1.營養:營養物質主要包括：糖類、氨基酸、無機鹽、維生素、促生長因子、微量元素等。
種類和所需量
血清
液體
由于人們對細胞所需的營養物質尚未全部研究清楚，因此在使用合成培養基時，通常需要加血清等一些天然成分。
注意：這里的糖類不能是淀粉、蔗糖
為什么對動物細胞進行培養時通常要添加血清？
2.無菌、無毒的環境
(1)培養液和培養用具_____處理，_____環境下操作。
(2)定期更換培養液
原因: 。
滅菌
無菌
清除代謝物,防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害
4.氣體環境:動物細胞培養所需氣體主要是O2和CO2
(1)O2作用:_________________。
(2)CO2的主要作用: 。
3.溫度、pH和滲透壓:
(1)適宜的溫度:哺乳動物動物細胞培養的溫度多以__________ ℃為宜。
(2)適宜的pH:多數細胞生存的適宜pH為_________。
(3)適宜的滲透壓。
36.5±0.5
7.2～7.4
細胞代謝所必需的
維持培養液的pH
進行動物細胞培養時，通常采用培養皿或松蓋培養瓶，置于95%空氣和5%CO2的CO2培養箱中進行培養。
制成細胞懸液
接觸抑制
機械法、胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理，將組織分散成單個細胞
轉入培養液中進行原代培養
放入CO2培養箱中培養
取動物組織
動物胚胎或幼齡動物的組織、器官
（三）動物細胞培養過程
傳代培養
機械法、胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理，將組織分散成單個細胞
傳代
培養
1、體外培養的細胞有兩類：
一類：細胞能夠懸浮在培養液中生長增殖；
另一類：是需要貼附于某些基質表面才能生長增殖，大多數細胞屬于這種類型，這類細胞往往貼附在培養瓶的瓶壁生長，這種現象叫 細胞貼壁。
培養過程中相關知識
要求：（培養瓶（皿）內表面光滑、無毒、易于貼附）
細胞貼壁—
懸液中分散的細胞貼附在瓶壁生長的現象；
①懸浮培養的細胞會因細胞密度過大、有害代謝物積累和培養液中營養物質缺乏等因素而分裂受阻。
②貼壁細胞在生長增殖時，除受上述因素的影響外，還會發生接觸抑制現象
2、培養過程中細胞不能繼續增殖的原因（原代培養到什么狀態時，需要傳代培養？）
細胞的接觸抑制
接觸抑制—
當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖的現象（長成單層細胞,有接觸抑制現象）
因此動物細胞培養過程中會出現細胞貼壁和接觸抑制的特點
人們通常將分瓶之前的細胞培養，即動物組織處理后的初次培養。
4、原代培養：
在進行傳代培養時，懸浮培養的細胞直接用離心法收集；貼壁細胞需用胰蛋白酶處理分散成單個細胞后，再用離心法收集。之后，將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養。
分瓶后的培養稱為傳代培養
5、傳代培養：
當原代培養的細胞貼滿瓶壁時，重新用胰蛋白酶處理，使細胞從瓶壁脫落，加培養液制成細胞懸液，分裝到2個或2個以上的培養瓶中繼續培養，叫傳代培養
思考討論
動物細胞培養的過程
取動物組織（動物胚胎或幼齡動物）
用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理
單個細胞
加培養液
細胞懸液
原代培養
在培養皿或培養瓶中
傳代培養
懸浮培養的細胞直接用離心法收集；貼壁細胞需用胰蛋白酶處理分散成單個細胞后，再用離心法收集
思考2.培養前為什么分散成單個細胞？
①成塊組織中細胞與細胞靠在一起，彼此限制了生長與增殖；②利于與培養液充分接觸，保證O2與營養供應和代謝物及時排出。
幼齡動物的細胞更易于培養，原因：幼齡動物的細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛
分化程度低的細胞更易于培養，原因：分化程度低的細胞增殖能力強，易于培養
思考1.幼齡動物的細胞與老齡動物的細胞比較，分化程度低的細胞與分化程度高的細胞比較，那個更易于培養？
取動物組織（動物胚胎或幼齡動物）
用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理
單個細胞
加培養液
細胞懸液
原代培養
在培養皿或培養瓶中
傳代培養
懸浮培養的細胞直接用離心法收集；貼壁細胞需用胰蛋白酶處理分散成單個細胞后，在離心法收集
思考3.將組織分散成單個細胞時為什么要用胰蛋白酶（或膠原蛋白酶）處理？胃蛋白酶可以嗎？
胰蛋白酶可以將動物組織細胞間的蛋白質分解，將組織分散成單個細胞。
不能用胃蛋白酶處理，原因：pH不適宜。胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性。多數動物細胞培養的適宜pH為7.2~ 7.4,胃蛋白酶在此環境中沒有活性，所以胃蛋白酶不行
思考4：用胰蛋白酶兩次處理的目的分別是什么？
第一次使用的目的是使組織細胞分散開；第二次使用的目的是使細胞從瓶壁上脫離下來，便于分散后繼續培養。
纖維蛋白、膠原蛋白等
細胞膜含有蛋白質，長時間處理會損傷細胞，要控制好時間。
思考5.在用胰蛋白酶處理組織時應注意什么？
5.動物細胞培養的過程跟蹤練習
1.過程①處理方法有:_____________________。
2.過程②為_____________________________
3.培養的動物細胞有兩類:
①懸浮在_______中生長增殖;
②___________________生長增殖。
4.過程③為_____培養,進行過程③的原因主要有:細胞密度過大、 積累、 缺乏和接觸抑制等。
5.進行過程③時,懸浮培養的細胞直接用_______收集;貼壁細胞需要使用_____________________等處理,然后用_______收集。
機械法或胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理的方法
轉入培養液中進行原代培養
培養液
貼附于某些基質表面
離心法
胰蛋白酶或膠原蛋白酶
離心法
傳代
有害代謝物
營養物質
動物胚胎或幼齡動物的組織、器官
細胞懸浮液
胰蛋白酶
原代培養
傳代培養
大量細胞
單個細胞
加培養液
離體的植物器官、組織或細胞
愈傷組織
根、芽
植物體
脫分化
再分化
接種至培養基
動物細胞培養
植物組織培養
思考5：動物細胞培養與植物組織培養有什么相同和不同之處？
過程不同
比較項目 植物組織培養 動物細胞培養
原理
培養基性質
培養基特有成分
培養結果
培養目的
獲得細胞及代謝產物
細胞的全能性
大量細胞
植物體
快速繁殖、作物脫毒等
葡萄糖、動物血清
蔗糖、植物激素
液體培養基
固體培養基
細胞增殖
相同點①都需要人工條件下的無菌操作，無菌培養；②都需要配制合成培養基；③都需要適宜的溫度、pH等條件
（四）干細胞培養及其應用
3.干細胞類型_____________________________________
2.干細胞存在于____________________________________________
早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中
（1）胚胎干細胞（ ES細胞）
①分布：
②功能：
③成功案例：
胚胎干細胞（ ES細胞）和成體干細胞
早期胚胎
具有分化成為成年動物體內任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。
ES細胞可以在體外分化成心肌細胞、
神經元和造血干細胞等細胞
1、干細胞是動物和人體內少數具有 的細胞，在一定條件下干細胞可以分化成 的細胞
分裂和分化能力
其他類型
（2）成體干細胞：
①分布：
②包括 骨髓中的造血干細胞、神經系統中的神經干細胞、睪丸中的精原干細胞等
③特點：
成體組織或器官內
具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發育成完整個體的潛能。
造血干細胞是發現最早、研究最多、應用也最為成熟的一類成體干細胞，主要存在于成體的骨髓、外周血和臍帶血
是成體組織或器官內的干細胞
誘導多能干細胞 來源：體外誘導體細胞產生
（iPS細胞） 應用：分化形成各種功能細胞，用于治療疾病
應用優點：
避免發生免疫排斥反應
胚胎干細胞必須從胚胎中獲得，這涉及到倫理問題因而限制了它的應用。
于是科學家通過體外誘導小鼠成纖維細胞，獲得了類似胚胎干細胞的誘導多能干細胞
體外誘導小鼠成纖維細胞
誘導多能干細胞
iPS細胞
臨床治療人類疾病 如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
多種體細胞
定向誘導分化
誘導多能干細胞（iPS細胞）的應用
3.干細胞的應用
（1）在醫學上有著廣泛應用。原因是
干細胞有著自我更新能力及分化潛能，與組織、器官的發育、再生和修復等密切相關。
（2）實例
類型 應用 優點
造血干細胞
神經干細胞 誘導多能干細胞 （iPS細胞） 治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統、免疫系統功能障礙等疾病
治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）
可治療小鼠的鐮狀細胞貧血癥，在治療阿爾茲海默病、心血管疾病等領域的研究也取得了新進展
來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內后，理論上可以避免免疫排斥反應
人的核移植胚胎干細胞經誘導分化，形成相應的組織、器官后，可用于組織器官的移植。（見右圖）
干細胞將在再生醫學、藥物安全性與有效性檢測等領域發揮大作用。
思考2：干細胞用于臨床治療面臨的問題有什么？
如存在導致腫瘤發生的風險
人的核移植胚胎干細胞的應用
判一判:基于干細胞的類型和應用,判斷下列說法的正誤。
(1)胚胎干細胞和成體干細胞都具有形成機體的所有組織和器官,甚至個體的
潛能( )
(2)造血干細胞是發現最早、研究最多、應用最為成熟的一種成體干細胞( )
(3)iPS細胞稱為誘導多能干細胞,與胚胎干細胞類似,也需從胚胎中獲取( )
(4)不同類型的干細胞分化能力不同,胚胎干細胞的分化能力最強( )
(5)干細胞將在再生醫學、藥物安全性、有效性檢測、疾病治療等領域發揮重
要作用( )
提示:成體干細胞具有組織特異性,只能分化成特定的細胞或組織,不具有發育成完整個體的能力。
提示:iPS細胞來源于自身的體細胞誘導,無須從胚胎中獲取。
√
×
√
√
×
一、概念檢測
1.判斷下列有關動物細胞培養的表述是否正確。
(1)培養環境中需要O2, 不需要CO2。（ ）
(2)細胞要經過脫分化形成愈傷組織。（ ）
(3)培養液中通常含有糖類、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清。（ ）
(4)培養瓶中的細胞需定期用胰蛋白酶處理，分瓶后才能繼續增殖。（ ）
練習與應用
√
×
×
×
2.干細胞有著廣泛的應用前景。下列相關敘述錯誤的是（ ）
A.干細胞是從胚胎中分離提取的細胞
B.造血干細胞可以分化為各種血細胞
C.不同類型的干細胞，它們的分化潛能是有差別的
D.由iPS細胞產生的特定細胞，可以在新藥的測試中發揮重要作用
A
二、拓展應用
現在關于iPS細胞的研究正在不斷深人。請你從以下兩個方面來查閱資料進行思考。
(2)如果誘導iPS細胞定向分化為生殖細胞的技術發展成熟，該技術可能會有哪些應用 又可能帶來哪些問題
(1)由于誘導產生iPS細胞、促使其分化都需要時間，因此用某人特異的iPS細胞進行醫療只限于時間比較充裕的情形。從實際事故、疾病發生的不可預測性方面考慮，如果要將這些細胞用于緊急情況，應該提前采取什么措施
提示：像建立骨髓庫一樣， 有研究團隊正在嘗試建立HLA( human leucocyte antigen,人類白細胞抗原)多態性豐富的iPS細胞庫，可以為需要的人找到HLA匹配度較高的iPS細胞，這樣不僅可以節省時間、成本，還能減輕異體干細胞移植后發生的免疫排斥反應。
提示：該技術可能被用于治療不孕癥;獲得足夠量的生殖細胞來進行瀕危物種的克隆研究;獲得生殖細胞進行轉基因操作，再經過受精、胚胎發育等過程來獲得轉基因動物。
該技術可能帶來一系列的倫理問題。例如，如果用同一個人的iPS細胞分別誘導形成精子和卵子，兩者受精可能培育出“單親”嬰兒；有的人還可嫩有目的地選擇iPS細胞，從而“設計”嬰兒
動物細胞培養
課堂小結
動物細胞培養的概念和原理
干細胞培養及其應用
營養條件；無菌、無毒的環境；溫度、pH和滲透壓；氣體環境
原理：細胞增殖
在適當的培養條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術
干細胞的分布
干細胞的類型
干細胞的應用
胚胎干細胞（ ES細胞）
成體干細胞
動物細胞培養的條件
動物細胞培養的過程
取動物組織
單個細胞
細胞懸液
原代培養
傳代培養
早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中
主要應用在醫學上
為什么對動物細胞進行培養時通常要添加血清？
1、血清中含有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素等，
2、氨基酸有多種，是細胞合成蛋白質的基本成分，其中有些氨基酸動物
細胞本身不能合成（稱為必需氨基酸），必須由培養液提供。
3、血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子；血清還含有多種未
知的促細胞生長因子、 促貼附因子及其他活性物質，能促進細胞的
生長、增殖和貼附。
4、因此，細胞培養時，要保證細胞能夠順利生長和增殖，一般需添加
10%～20%的血清。
血清中含有多種未知的促細胞生長因子等營養物質，這是細胞生長和增殖所必需的。
補充資料
（四）干細胞培養及其應用
3、干細胞類型：
1、胚胎干細胞：
存在于早期胚胎中，具有分化成為成年動物體內任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。
2、干細胞分布：
早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中
胚胎干細胞
（ ES細胞）
成體干細胞
全能干細胞
多能干細胞
專能干細胞
干細胞培養培養

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