資源簡介

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第1章 發酵工程
第2節 微生物的培養技術及應用
—微生物的選擇培養和計數
本節聚焦
問題一
問題二
問題三
怎樣運用生物與環境相適應的觀點來理解選擇培養的原理？
如何通過調整培養基的配方來有目的培養某種微生物？
測定微生物數量的常用方法？
純培養
純培養物
配制培養基
滅菌
接種
分離
培養
由單一個體繁殖所獲得的微生物群體
提出問題
如何從自然界中分離出需要的特定微生物？
自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合的菌群中不是優勢種群時，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布法很難實現。該怎么辦？
課程導入
1. 微生物分離的實例
水生棲熱菌的篩選
水生
棲熱菌
提取
耐高溫
DNA聚合酶
用于
PCR
① 水生棲熱菌的應用
② 篩選原理
水生棲熱菌能在70~80℃高溫條件下生存，絕大多數微生物在此條件下不能生存。
一、選擇培養基
2. 篩選原則
耐熱微生物
根據微生物對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。
一、選擇培養基
篩選
耐寒微生物
篩選
石油分解菌
篩選
有利于目的菌生長的條件有哪些？
營養、溫度和pH等
3. 實驗室微生物的篩選
人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養、溫度和pH等），同時抑制或阻止其他微生物的生長。
營養
以尿素為唯一
碳源的培養基
以淀粉為唯一
碳源的培養基
以石蠟油為唯一
碳源的培養基
篩選出能分解尿素的細菌
篩選出能分解淀粉的細菌
篩選出能分解石油的細菌
一、選擇培養基
3. 實驗室微生物的篩選
人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養、溫度和pH等），同時抑制或阻止其他微生物的生長。
溫度
高溫
篩選出耐高溫的細菌
pH
高pH
篩選出耐pH的細菌
無氧
篩選出厭氧細菌
高鹽
篩選出耐高濃度鹽的細菌
一、選擇培養基
4. 選擇培養基的定義
① 加富性選擇培養基
在微生物中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類的微生物生長的培養基，稱為選擇培養基（Selective medium）
在培養基中加入分離對象“嗜好”的營養物質。
② 抑制性選擇培養基
在培養基中加入分離對象對能夠抵抗的某種抗菌物質。
一、選擇培養基
思考·討論
選擇培養基配方的設計
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化學性質相對穩定，是現代農業生產中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細菌分解成NH3，NH3再轉化成NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，脲酶催化尿素分解產生NH3，NH3可作為細菌生長的氮源。
CO(NH2)2
+ H2O
CO2
+ 2NH3
NO3-
NH4+
脲酶
轉化
一、選擇培養基
1. 如果讓你配制一種培養基，讓土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出
來，培養基的配方該如何設計？
設計一種選擇培養基，用尿素作為唯一氮源，可以將分解尿素的細菌分離出來。
一、選擇培養基
討論
尿素
一、選擇培養基
討論
尿素
2. 該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？
這種培養基與普通培養基相比，只是用尿素作為唯一氮源，培養基的其他營養成分基本相同。
二、微生物的選擇培養
1. 選擇培養基的作用
分離并計數某種微生物的數量（例如，能分解尿素的細菌）。
2. 微生物選擇培養獲取純培養物的方法
由于土壤中細菌的數量龐大，要想得到能分解尿素的細菌的純培養物，必須要對土樣進行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的培養基上，也就是要采用稀釋涂布平板法。
選擇培養基
+
稀釋涂布平板
單菌落
第1步：
取樣并稀釋10倍
10 g
鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。
1
將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶，充分搖勻。
2
90 mL的無菌水
3. 稀釋涂布平板操作過程
二、微生物的選擇培養
3. 稀釋涂布平板操作過程
第2步：
梯度稀釋
取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
3
1 10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 103
1 104
1 105
1 106
1 107
1 102
9mL無菌水
二、微生物的選擇培養
3. 稀釋涂布平板操作過程
1 107
取0.1mL菌液，
滴加到培養基表面
4
將涂布浸入再盛有
酒精的燒杯中
5
將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。
6
用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。
7
第3步：
涂布平板
二、微生物的選擇培養
4. 微生物培養
待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30~37℃的恒溫培養箱中培養1~2d。
在涂有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。
稀釋涂布平板操作后分裂得到的單菌落
二、微生物的選擇培養
5. 結果評價
① 培養基的制作是否合格
如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫1~2d后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的，否則需要重新制備。
空白對照
稀釋104倍
稀釋105倍
稀釋106倍
二、微生物的選擇培養
5. 結果評價
② 接種操作是否符合無菌要求
如果培養基上生長的菌落的顏色、性狀、大小基本一致，并符合目的菌的菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的，如果培養基上出現了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。
二、微生物的選擇培養
1. 稀釋涂布平板計數法計數（活菌計數）
原理
當樣品的稀釋足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測除樣品中大約含有多少活菌。
原則
一般選擇菌落數在30~300的平板就行計數。
同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數，然后求平均值。
三、微生物的數量測定
1. 稀釋涂布平板計數法計數（活菌計數）
缺點
統計的菌落數往往比活菌的實際數目低。這是因為當兩個或多個細胞連在一起，平板上觀察到的只是一個菌落。
因此，統計結果一般用菌落數而不用活菌數來表示。
三、微生物的數量測定
1. 稀釋涂布平板計數法計數（活菌計數）
計算公式
每g樣品中的菌落數 = ( C ÷ V ) M
代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數
代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（mL）
代表稀釋倍數
某同學再稀釋倍數為106的培養基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每g樣品中的菌落數時（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL）（ ）
A. 2.34 108 B. 2.34 108 C. 234 D. 23.4
例
三、微生物的數量測定
2. 顯微鏡直接計數（細菌總數計數）
原理
利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量，統計的結果一般是活菌數和死菌數的總和。
原則
快速、直觀、設備簡單
能觀察微生物的形態特征。
缺點
不能區分死菌和活菌，統計結果會偏大；
為了避免上述缺點，可以染色后進行顯微鏡計數。
三、微生物的數量測定
探究·實踐
土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
提出問題
① 如何分離土壤中能分解尿素的細菌？
② 如何計算每克土壤樣品中有多少分解尿素的細菌？
三、微生物的數量測定
探究·實踐
土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
基礎知識
絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
利用尿素作為唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。
組分 含量
KH2PO4 1.4
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
瓊脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
三、微生物的數量測定
實驗設計
土壤取樣
樣品的稀釋與涂布
微生物的培養
觀察并記錄結果
菌落計數
三、微生物的數量測定
探究·實踐
土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
① 土壤取樣
細菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大多數分布在距地表3~8cm的土壤層。取樣時，一般要鏟去表層土。
取樣時用的鐵鏟和取樣紙袋在使用前都需要滅菌，操作完整后，一定要洗手。
公園里、街道旁、花盆中
城市：
農田里、菜園里
農村：
三、微生物的數量測定
探究·實踐
土壤中分解尿素的細菌的分離與計數
② 樣品系列稀釋與涂布
9 mL無菌水
0.1mL
0.1mL
0.1mL
測定土壤中細菌的數量，一般選用1 104、 1 105、 1 106倍稀釋倍數進行平板培養。
三、微生物的數量測定
② 樣品系列稀釋與涂布
不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數在30～300之間，適于計數的平板。
選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數。
在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？
三、微生物的數量測定
③ 微生物的培養與觀察
每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。
不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌一般在30-37℃的溫度下培養1-2d。
一般來說，在相同的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等
三、微生物的數量測定
將涂布器從酒精中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。
操作提示
三、微生物的數量測定
取土樣時用的鐵鏟和取樣紙袋再使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。
④ 操作提示
三、微生物的數量測定
本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好再使用前做好標記。
④ 操作提示
例如：在標記培養皿時應該注明組別，培養日期和平板上培養樣品的稀釋度。
三、微生物的數量測定
如果1個平板的計數結果與另2個相差太遠（不在30~300范圍內），說明在操作過程中可能出現了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數值用來求平均值。
0.1mL
0.1mL
0.1mL
1 104
1 105
1 106
④ 操作提示
三、微生物的數量測定
0.1mL
0.1mL
0.1mL
1 104
1 105
1 106
空白對照設置：
將未接種的培養基同時進行培養，以判斷培養基是否有雜菌污染。
④ 操作提示
三、微生物的數量測定
完全培養基對照設置：接種在完全培養基上同時進行培養，以判斷選擇培養基是否具有篩選作用。
0.1mL
0.1mL
0.1mL
1 104
1 105
1 106
④ 操作提示
三、微生物的數量測定
結果分析與評價
1. 結合對照組，分析培養物中是否有雜菌污染以及選擇培養基是否篩選
出一些菌落？
如果沒有接種的培養基上沒有菌落生長，說明培養基沒有被雜菌污染。
如果接種后的完全培養基上的菌落明顯多于選擇培養基的菌落數，說明培養基篩選除了一些尿素分解菌。
三、微生物的數量測定
結果分析與評價
2. 你是否獲得了某一稀釋度下菌落數為30~300的平板？在這一稀釋度下，
是否至少有2個平板的菌落數接近？
如果得到了兩個或多個菌落數為30~300的平板，說明稀釋度合格，操作比較成功，能夠進行菌落的計數。
三、微生物的數量測定
結果分析與評價
3. 你統計的每克土樣中能分解尿素的細菌的菌落是多少？與其他同學統
計的結果接近嗎？如果差異大，可能是什么原因引起的？
如果用同一土樣進行操作，數據應該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規范、培養基配制是否合理等方面查找原因。
三、微生物的數量測定
進一步探究
本活動只是初步篩選了能分解尿素的細菌，對分離的菌種進行鑒定還需要借助生物化學的方法。
鑒定培養基
土壤中分解尿素的細菌的鑒定
三、微生物的數量測定
活菌計數技術廣泛應用于食品衛生、水源污染度的檢驗和土壤含菌量的測定等方面。如果你感興趣，可以從下列項目中選做一個，并走訪相關部門或企業，了解它們是如何進行檢測的。
到社會中去
1. 空氣中微生物總數的檢測
2. 水中細菌的分離與計數
3. 牛奶中細菌的分離與計數
4. 土壤中真菌（或放線菌）的分離與計數
一、檢測檢測
練習與應用
1. 研究人員用無機鹽、瓊脂和石油配制的培養基從被石油污染的土壤中
篩選出了一種石油降解菌。判斷下列相關表述是否正確。
(1) 這種培養基是一種選擇培養基 （ ）
(2) 利用這種石油降解菌可以降解石油，修復土壤 （ ）
(3) 相對于未被污染的土壤，從被石油污染的土壤中更容易分離到
石油降解菌 （ ）
√
√
√
一、檢測檢測
練習與應用
2. 用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落
數就能推測出樣品中的活菌數，原因是 （ ）
A. 菌落中的細菌數目是恒定的
B. 平板上的一個菌落就是一個細菌
C. 通過此方法統計的菌落數與活菌的實際數目相同
D. 平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌
D
二、拓展應用
練習與應用
1. 反芻動物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活著多
種微生物，其中許多微生物能分解尿素。請你設計一個實驗，從瘤胃
中分離出能夠分解尿素的微生物。
反芻動物的瘤胃中有大量的微生物,其中就有分解尿素的微生物。由于痛胃中的微生物多為厭氧菌,接觸空氣后會死亡,因此外離其中能分解尿素的微生物除了需要準備選擇培養基、還應該參照厭氧菌的培養方法進行實驗設計。
練習與應用
2. 地球上的植物每年產生的纖維素超過70億噸,其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用,這是因為它們能夠產生纖維素酶。對這些微生物的研究與應用,使人們能夠利用秸稈等生產酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。已知剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不
與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發生這種反應。
當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，
剛果紅與纖維素形成紅色復合物;；而當纖維素
被纖維素分解菌分解后，復合物就無法形成，
培養基中會出現以這些菌為中心的透明卷(如
下圖所示)。請回答下列問題。
幾種纖維素分解菌在剛果紅培養基上形成的透明圈
練習與應用
(1) 現在要從土壤中分離纖維素分解菌，請你給出詳細的實驗方案。
①土壤取樣
②樣品系列稀釋與涂布(培養基以纖維素為唯一碳源，并加入剛果紅)③培養
④觀察并記錄結果
練習與應用
(2) 你打算到什么環境中去尋找纖維素分解菌 為什么
纖維素分解菌大多分布在富含纖維素的環境中，采集土樣時，可以選擇纖維素豐富的環境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土等。
(3) 有同學說,可以把濾紙埋在土壤中,經過一段時間后,再從已腐爛的濾紙
上篩選纖維素分解菌。請你評價這一做法。
這是人工設置適合纖維素分解菌生存的環境,腐爛的濾紙上很可能有纖維素分解菌。

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