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第二節 發酵工程的無菌技術
第一章 發酵工程
積極思維：肉湯腐敗與微生物有什么關系？
19世紀中期以前，人們普遍相信生命現象是自然發生的。19世紀60年代，法國科學家巴斯德通過實驗證明了微生物不是自然發生的。
煮沸肉湯，殺滅其中的細菌
肉湯仍澄清，沒有細菌繁殖
打斷瓶頸
肉湯變混濁，細菌在肉湯中繁殖
日常生活中，我們會用碘伏消毒液擦拭受傷破損的皮膚，從而殺滅傷口部位的部分微生物。那么，在發酵工程實踐中無菌操作是如何開展的呢？
巴斯德在實驗
一、發酵工程的滅菌方法和滅菌設備
1、無菌技術：
2、無菌技術應圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括消毒和滅菌。
注：
獲得純凈的微生物培養物的關鍵是防止雜菌污染；
是指在操作過程中，保持物品與操作區域無菌的狀態并不被微生物污染的技術，其核心是滅菌；
①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；
②用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等進行滅菌；
③為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行；
④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸；
（1）消毒
①概念：
②常用的消毒方法
a、煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min，可以殺死微生物的營養細胞和一部分芽孢。
b、巴氏消毒法：
62～65℃下消毒30min或80～90℃處理30s～1min，適合一些不耐高溫的液體，如牛奶?？梢詺⑺琅Ｄ讨械慕^大多數微生物，并且不破壞牛奶的營養成分。
指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物。
c、化學藥劑消毒法：用70%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。
思考：利用酒精消毒時，酒精濃度是不是越高越好？
析：高濃度酒精能將細菌表面的蛋白質凝固，并形成一層保護膜，阻止酒精進入細菌體內，因而不能將細菌徹底殺死。酒精濃度低于70%，雖可進入細菌體內，但不能將細菌徹底殺死。
④紫外線消毒法：接種室、接種箱或超凈工作臺在使用前可用紫外線照射30min。在照射前，適量噴灑石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加強消毒效果。
（2）滅菌
附：芽孢和孢子的相關知識
芽孢：有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。
孢子：細菌、原生動物、真菌和植物等產生的一種有繁殖作用的無性生殖細胞。能直接發育成新個體。
①概念：
指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
②常用滅菌的方法：
a、干熱滅菌法
耐高溫，需保持干燥的物品，適用于
玻璃器皿 (如試管、培養皿、移液管、注射器)、金屬器具 (如針頭、 鑷子、剪刀等)的滅菌；
器具：
電熱鼓風干燥箱（干熱滅菌箱）；
條件：
140~160℃下加熱2~3h；
原理：
使微生物細胞質膜破壞、蛋白質變性和原生質干燥等；
對象：
使滅菌器皿保持干燥；
帶有膠皮或塑料的物品、液體及固體培養基一般不能采用電熱鼓風干燥箱干熱滅菌；
優點：
缺點:
電熱鼓風干燥箱：
采用電熱鼓風干燥箱干熱滅菌時，一般以能否殺死細菌的芽孢作為徹底滅菌的標準。
b、灼燒滅菌法
接種工具如接種環、接種針，以及接種過程中的試管口或瓶口等易被污染部位；
器具：
酒精燈；
條件：
酒精燈外焰灼燒；
效果：
最徹底；
原理：
使微生物燃燒；
對象：
c、濕熱滅菌法：高壓蒸汽滅菌
器具：
高壓蒸汽滅菌鍋
條件：
100kPa、121 ℃下維持15-20min；
原理：
高溫蒸汽破壞蛋白質、核酸等結構使其變性；
培養基、多種器材、物品等；
優點：
操作簡便，效果可靠，可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體。基本保持培養基的營養成分不被破壞；
對象：
高壓蒸汽滅菌鍋的使用：
加水→裝鍋→加熱→排空冷空氣→保溫保壓→出鍋
加水：
水量達到水位標記線即可；
↓
裝鍋：
將待滅菌物品放在滅菌桶中，至少留1/3空間，蓋好鍋蓋，對稱旋緊鍋蓋四周的固定螺栓；
↓
加熱：
出鍋：
接通電源，打開開關，開始加熱；
↓
排空冷空氣：
打開排氣閥，排出鍋內殘留的冷空氣。當壓力表指針回降到“0”時，關閉氣閥，繼續加熱；
高壓蒸汽滅菌鍋的使用：
鍋內壓力升至約103 kPa、溫度達到121℃時控制熱源，保持壓力，維持15～20 min 后，再關閉電源；
當壓力表指針降至“0”點，待溫度下降后，打開排氣閥，旋開固定螺栓，開蓋，取出滅菌物品
保溫保壓：
↓
↓
滅菌完畢取出物品后，將鍋內余水倒出，保持滅菌鍋內壁及內膽干燥，并蓋好鍋蓋。
視頻：高壓蒸汽滅菌鍋使用
思考：
高壓蒸汽滅菌開始之前，為什么要將鍋內的冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么要待壓力降到“0”時才能打開排氣閥？
析：在同一溫度下，濕熱的滅菌能力比熱大，在使用高壓蒸汽滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排出是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。
如果在壓力未降到“0”時打開排氣閥，會導致鍋內壓力突然下降，使器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾培養基而發生污染。
1、培養基滅菌為什么采用高壓蒸汽滅菌而不采用干熱滅菌？
析：干熱滅菌箱內的高溫會導致培養基的水分散失，而高壓蒸汽鍋內的濕度較大，不會導致培養基的水分散失。
2、如何制備一瓶無菌水？
析：對一瓶有菌水進行高壓蒸汽滅菌處理。
3、某同學在使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設定要求，而鍋內并沒有達到相應溫度，最可能的原因是什么？
析：未將鍋內冷空氣排盡。
思考并回答：
4、某同學從高壓蒸汽滅菌鍋內拿出培養基后發現，培養基已經濺滿了錐形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？
析：高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表指針還未降至“0”點，就提前打開了高壓蒸汽滅菌鍋。
在工業生產上制備無菌空氣，用于好氧微生物的發酵；
在產品提取過程中，也可以利用過濾除菌法處理料液，以獲得無菌產品。
d、過濾除菌法
概念：
通過濾膜過濾阻留微生物從而達到除菌目的的方法；
器具：
空氣除菌設備；
對象：
空氣、料液，及在高溫下不穩定的物質（大于濾膜孔徑的細菌等微生物顆粒阻留）
應用：
空氣除菌設備：
許多微生物產品是通過培養好氧微生物獲得的。通常在空氣中含有灰塵顆粒和各種雜菌， 在陰雨天氣或環境污染比較嚴重的情況下，空氣中會懸浮大量的微生物。這些微生物一旦進入營養豐富的培養基中，會很快繁殖，影響發酵過程。 讓含菌空氣通過無菌干燥的過濾介質，以阻截空氣中所含微生物。空氣除菌設備不是滅菌，而是濾除了空氣中的各種雜菌。通過過濾除菌處理的空氣可達到幾乎無菌的程度，并有足夠的壓力和適宜的溫度，以滿足好氧微生物純培養的需要。
二、發酵工程的無菌操作器具
1、接種器具
①接種：在無菌條件下將微生物接入培養基的操作過程；
②常用接種器具包括玻璃涂布器、接種針、接種環等；
③應用：玻璃涂布器常用于平板稀釋涂布接種，接種針用于穿刺接種，接種環用于斜面接種或在平板培養基上劃線接種；
平板劃線接種
2、轉移器具
①移液管的應用：一般用于轉移部分液體培養物、系列稀釋微生物或分裝化學試劑；
②刻度移液管：具有刻度的直形玻璃管，在需要控制試劑加入量時使用。
視頻：移液管的潤洗及溶液的移取
③微量取液器：當取液量很少時（如0.1 mL），常采用微量取液器。微量取液器可分為固定容量的和可調容量的兩種；
視頻：微量移液器的使用
3、超凈工作臺
是利用工作臺內紫外線燈的殺菌作用，并通過空氣過濾器過濾確保工作臺內空氣的無菌、無污染。
①概念：
超凈工作臺是一種經過空氣凈化而形成高潔凈操作環境的設備。
②凈化原理：
三、微生物接種和傳代的無菌技術
1、微生物保存的生理狀態
在人工創造的條件下，降低細胞的代謝水平，使細胞基本處于休眠狀態，即微生物的生長繁殖受到抑制但又不至于死亡。
3、菌種保存的方法：
①厭氧微生物接觸氧氣會受到抑制、損傷甚至死亡，常采用穿刺接種；
②斜面接種是常用的菌種傳代和低溫下保存菌種的方法。
2、菌種保存的條件：
低溫、干燥、真空；
穿刺接種示意圖：
斜面接種和培養酵母菌：
準備
接種
接種環滅菌
試管口滅菌
挑取少量菌體
劃線
接種
培養酵母菌
①點燃酒精燈，取兩支盛有培養基的試管，其中一支內有菌種，另一支為無菌的斜面培養基；
（1）準備接種
②用一只手的拇指和其他四指夾住試管，使管口齊平，管內培養基斜面向上；
將接種環的環端和接種時可能進入試管的部分放在酒精燈火焰上，來回灼燒多次，以達到迅速徹底滅菌的目的。
（2）接種環滅菌
在火焰附近用握有接種環的手的小拇指、無名指、中指和掌心拔去兩支試管上的試管塞，迅速將試管口通過火焰2~3次，以殺滅試管口上的微生物。
（3）試管口滅菌
“拔塞過火
”
將滅過菌的接種環伸入菌種管，先將環部接觸培養基斜面頂端或其他無菌體的培養基部位使其冷卻，再輕輕挑取少許菌體。
（4）挑取菌體
注：
在抽出接種環時，注意其帶菌部位不要觸及管壁或通過火焰；
迅速將上述帶菌的接種環伸入待接種的試管中， 在培養基斜面上由底部向上輕輕劃“Z”型折線，將菌種接種到培養基上。
（5）接種
注：
劃線時注意不要將培養基的表面劃破；
（6）培養
將試管口與試管塞分別通過火焰2~3次，迅速塞緊試管。多次灼燒接種環確保無菌，冷卻后，放回原處。將接種過菌種的試管放在恒溫箱中（溫度調至28℃） 培養24 h。
視頻：斜面培養基微生物接種
4、菌種保存的方法
挑選典型菌落
接種到斜面培養基，培養
4℃左右的冰箱保藏
2~3個月重新接種
①短期保存：
甘油管藏（一般可保存2~4年）
-20℃以下的甘油管在冷凍箱中保藏；
②長期保存：
(1)培養微生物的試劑和器具都要進行高壓蒸汽滅菌 (　　)
(2)斜面培養基中含有大量營養物，可在常溫下長期保存菌株 (　　)
(3)某研究小組從有機廢水中分離微生物用于廢水處理，培養過程中每隔一周觀察一次 (　　)
(4)為了防止污染，接種環經火焰滅菌后應趁熱快速挑取菌落(　　)
(5)穿刺接種可用于保藏厭氧菌種或研究微生物的運動 (　　)
(6)菌體蛋白質的變性溫度與含水量相關，一般來說含水量越低，變性溫度越高(　　)
(7)一般以能否殺死細菌的芽孢作為徹底滅菌的標準(　　)
×
×
×
×
√
習題鞏固：
√
√
(8)使用高壓蒸汽滅菌鍋時，為充分利用空間，裝得越滿越好(　　)
(9)當高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表指針降至“0”點時，即可出鍋(　　)
(10)制備氨基酸、抗生素等的發酵過程，所需的微生物對空氣無菌的要求較低(　　)
(11)將移液管移入準備接受溶液的容器時，為避免污染，移液管不能接觸器壁(　　)
(12)低溫、干燥、高氧是菌種保存的重要條件(　　)
(13)厭氧微生物常采用穿刺接種的方法將其保護在培養基中(　　)
(14)將含有新鮮菌種的試管放在－4 ℃的冰箱中保存有利于延長保存時間(　　)
×
×
×
×
×
√
×
2.下列關于滅菌和消毒的說法，錯誤的是
A．滅菌是指殺死環境中的所有微生物，包括芽孢和孢子
B．滅菌和消毒實質上是相同的
C．接種環用灼燒法滅菌
D．常用的滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌等
3．下列關于高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法中，錯誤的是
A．使用高壓蒸汽滅菌鍋時，需等鍋內的冷空氣排盡后再關閉排氣閥
B．培養基常用高壓蒸汽滅菌法處理
C．滅菌結束后，需迅速將排氣閥打開，等壓力表降為“0”時再取出培養基
D．滅菌前一般需要將錐形瓶的棉塞用牛皮紙或報紙包扎好
B
C
4．下列操作能達到滅菌目的的是
A．用免洗酒精凝膠擦手
B．制作泡菜前用開水燙洗容器
C．在火焰上灼燒接種環
D．防疫期間用石炭酸噴灑教室
5．下列哪項不屬于無菌技術？
A．將培養皿、接種工具和培養基進行滅菌
B．實驗操作應在酒精燈火焰附近進行
C．避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸
D．操作者的衣著和手用純凈水洗干凈
C
D
6．培養基、培養皿、接種環、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌或消毒方法依次是
①化學消毒?、谧茻郎缇、鄹蔁釡缇?br/>④紫外線消毒?、莞邏赫羝麥缇、薨褪舷痉?br/>A.⑤③②①④⑥ B.①②③④⑤⑥
C.⑥②③④①⑤ D.③④②①⑥⑤
A
7.高壓蒸汽滅菌的操作順序應該是
①加水?、谂爬錃狻、垩b置滅菌物品　
④約103 kPa下滅菌?、菁由w
⑥ 0 kPa下排氣，打開滅菌鍋
A.①③⑤②④⑥ B.②③⑤①⑥④
C.①②④⑤③⑥ D.②⑤①⑥④③
A
8.下列關于斜面接種和培養酵母菌的敘述，錯誤的是
A.接種環滅菌時，只需將其環端進行滅菌
B.接種時，應在培養基斜面上由底部向上輕輕劃“Z”型折線
C.挑取菌體時應先將接種環的環部接觸培養基斜面頂端或其他無菌體的
培養基部位使其冷卻
D.將菌種置于4 ℃左右的冰箱中保藏即有利于減緩培養基的水分蒸發，
又有利于延長保存時間
A
9.下列關于微生物接種和傳代的無菌技術的敘述，錯誤的是
A.菌種的傳代和保存要考慮菌種的生理、生化特性
B.低溫、干燥、缺氧、缺乏營養等環境條件都有抑制微生物生長和代謝
的作用
C.破傷風芽孢桿菌可在培養基深處的厭氧環境下生長
D.在培養基斜面上接種時應由上部向底部輕輕劃“Z”型折線
D
10．為了保持菌種的純凈需要進行菌種的保存，下列有關敘述錯誤的是
A．對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保存的方法
B．甘油管藏法保存菌種時使用的甘油需滅菌
C．臨時保藏菌種容易被污染或產生變異
D．對于需要長期保存的菌種，可以采用低溫－4℃保藏的方法
D
11．將酵母菌菌種從菌種試管接種到另一支試管的操作，下列說法有誤的一項是
A．整個接種過程都要在酒精燈的火焰附近進行
B．接種環放在酒精燈火焰上灼燒之后即可伸入菌種試管挑取少許菌種
C．菌種試管口和待接種的試管口接種前后都要通過酒精燈火焰2～3次
D．帶菌的接種環應在培養基斜面上由底部向上輕輕劃“Z”型折線
B
12．下列關于無菌操作的敘述，正確的是
A．接種時超凈臺內同時打開紫外燈和過濾風
B．斜面接種時，含菌種的試管口和不含菌種的試管口都要通過酒精燈火焰滅菌
C．用脫脂棉制成的棉塞塞住試管口，用牛皮紙包扎，放入滅菌鍋內滅菌
D．接種環滅菌后迅速挑取少量菌種進行接種
B
13．下列有關消毒和滅菌的說法，錯誤的是
A．水廠供應的自來水通常是經過氯氣消毒
B．使用高壓蒸汽滅菌鍋時，若壓力達到設定要求，而鍋內并沒有達到相應溫度，最可能的原因是未將鍋內冷空氣排盡
C．玻璃和金屬材質的實驗器具不可以放入干熱滅菌箱中進行干熱滅菌
D．牛奶的消毒常采用巴氏消毒法，不僅可以達到消毒目的，同時營養物質損失較少
C
三、平板劃線法分離和純化微生物
1、平板劃線法定義:
把含有多種微生物的雜菌樣品，通過在特定的瓊脂平板表面劃線稀釋，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面，從而獲得單個菌落的方法。
將微生物樣品在瓊脂平板表面多次做“由點到線”的稀釋劃線，經過這樣的操作可得到較多獨立分布的單個微生物。經過平板培養后，會形成部分由單個微生物生長、繁殖而成的純種菌落。
2、平板劃線法的做法:
由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養物，獲得純培養物的過程就是純培養。
3、微生物的純培養：
酵母菌
①酵母菌是兼性厭氧型單細胞真菌，可以進行出芽生殖，也可以進孢子生殖；
②培養的最適pH為4.5～5.0，最適生長溫度為28～30 ℃；
4、平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落（視頻）
③可以用液體培養基培養，也可以用固體培養基培養，但要獲得純化的酵母菌菌落，則需要通過固體培養基培養。
4、通過平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落
嘗試通過平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落。
（1）實驗目的
（2）實驗原理
平板劃線法是實驗室中進行微生物分離和純化的常用方法之一。在制作好的酵母菌培養基平板上，采用無菌操作技術及平板劃線法能夠獲得純化的酵母菌菌落。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基能滿足酵母菌生長、繁殖的營養需要，利用前面實驗中配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基制作平板。
酵母菌樣本（菌種）；接種環、酒精燈、恒溫培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基。
（3）實驗器材和試劑
（4）實驗步驟
②培養基和培養皿滅菌
用牛皮紙包扎已配制的培養基
已包好的培養皿
高壓蒸汽滅菌鍋滅菌
①配制馬鈴薯葡糖糖瓊脂培養基并調pH
＋
→
將滅好菌的培養基和培養皿取出，置于操作臺上，待培養基冷卻到50℃左右時（可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可），在酒精燈火焰附近倒平板。
③倒平板
倒平板操作步驟：
拔出錐形瓶的棉塞
將瓶口迅速通過火焰：轉動瓶口，確保瓶口被滅菌；
倒培養基：在火焰旁用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基（10~20 mL）倒入培養皿，立即蓋上皿蓋；
等培養基冷卻凝固后，將培養皿倒過來放置
注：
①平板冷凝后倒置的原因：
將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染；
②如何確定所倒平板是否被雜菌污染：
將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底；
判斷：倒平板時應該將皿蓋打開放到一邊，然后再倒培養基（ ）
×
④平板劃線和培養（人教版）
將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環燒紅
在火焰旁冷卻接種環，并拔出裝有酵母菌的棉塞
將試管口通過火焰
將已冷卻的接種環伸入菌液中，蘸取一環菌液
將試管通過火焰，并塞上棉塞
左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養基
灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區域內劃線。注意不要將最后一區的劃線與第一區相連
將平板倒置放入28℃恒溫培養箱中培養24～48h。
提醒：為什么要同時放入未接種的平板？
作對照，該培養皿無菌落說明培養基沒有污染
完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右(培養溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異)的恒溫培養箱中培養24-48 h。
分區劃線法：
1
2
3
4
5
平板劃線法注意事項:
第1區劃線
接種環滅菌
第2區劃線
接種環滅菌
第3區劃線
接種環滅菌
接種環滅菌
①接種環只蘸一次菌液,但要在培養基不同位置連續劃線多次；
②劃線首尾不能相接；
③每次劃線前接種環進行滅菌；
④劃線后,培養皿倒置培養；
注：每次劃線前后灼燒接種環的目的是什么？
灼燒時間 目的
第一次劃線前
每次劃線前
劃線結束后
殺死接種環上可能存在的微生物，防止外來微生物干擾
殺死上一次劃線結束后接種環殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端
殺死接種環上殘存的菌種，避免菌種污染環境和感染操作者
④平板劃線和培養（蘇教版）
在一個倒有培養基的培養皿的皿底外側面中央用記號筆畫一直線，再在此線中間處畫一垂直線，將培養皿分成三個區域：第1區域、第2區域、第3區域，分別標上“1”“2”“3”字樣。
1
2
3
接種劃線時，將帶有酵母菌樣品的接種環，在培養皿內培養基的第1區域劃線，然后再從第1區域劃到第2區域，從第2區域劃到第3區域（在第2次、第3次劃線前，接種環需過火滅菌）。在固體培養基表面完成多次“由點到線”的逐步稀釋。劃完線后蓋上皿蓋，倒置培養。
接種和劃線操作需要在酒精燈火焰附近進行。
通過培養可以得到由單個酵母菌增殖而形成的菌落。
四、稀釋涂布平板法分離和純化微生物
1、稀釋涂布平板法：
將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，使其中的微生物充分分散，培養后在平板培養基表面形成多個單菌落。
2、稀釋涂布平板法應用：
既可用于菌種的分離和純化，也可以用于微生物的計數。
101
102
103
104
105
106
（1）將分別盛有9mL無菌水的試管滅菌并編號；
（2）用移液管吸取1mL培養的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻；
（3）從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入102倍稀釋的試管中，重復步驟2，直到第六支試管；
3、稀釋涂布平板法的操作過程——系列稀釋操作
4、稀釋涂布平板法的操作過程——涂布平板操作
將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中
取0.1mL菌液，滴加到培養基表面
將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。
用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻
待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，培養
選擇30-300個菌落的平板進行計數；每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；
5、稀釋涂布平板法計數原則:
稀釋103倍
稀釋104倍
稀釋105倍
空白對照
稀釋106倍
注：平板劃線法不能對菌種進行計數；而稀釋涂布平板法可以計數，但計數值會比實際值偏小，因為一個菌落有可能是由兩個或者多個的菌體一起形成的；
①利用選擇培養基可以篩選和分離某種微生物。
②在高度稀釋的條件下，于固體培養基上培養該微生物，形成單個菌落。單個菌落即為純化培養物，通過對菌落數量的統計，可以計算出樣品中的含菌數。
6、實驗：分離土壤中分解尿素的細菌并進行計數（視頻）
（1）實驗目的
（2）實驗原理
①學會配制選擇培養基，以分離出能分解尿素的細菌。
②學會采用稀釋涂布平板法分離和培養分解尿素的細菌，并進行計數。
（3）實驗器材和試劑
①土壤樣品。
②滅菌處理過的各種工具。
③配制以尿素為氮源的1000mL選擇培養基的試劑以及調節pH的相關試劑。
（4）實驗步驟
鏟取土壤，將樣品裝入紙袋中
注：取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌；
1×10
90mL無菌水
10g
將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻
取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋
1 mL
1×102
9mL無菌水
①制備土壤懸液
1×102
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
每個試管中均有9 mL 無菌水
②配置培養基及制作平板
設置一組不加氮源的平板，作為空白對照。
在大燒杯加入培養基的成分，并加瓊脂煮沸溶解，定容，調節pH為7.2～7.4，裝入錐形瓶，滅菌，冷卻至50℃，倒平板。
③涂布
從濃度最低的土壤懸液開始，每個濃度設置3個重復。
④培養與觀察
另設一組對照，用等體積無菌水代替土壤懸液，用來判斷平板在實驗前或實驗過程中是否被污染。
倒置于37℃恒溫箱中培養1~2d，每24h觀察一次；
計算時，選取菌落數為30~300的一組為樣本進行統計。
公式:每克土壤樣品的細菌數=某一稀釋度幾次重復培養后的菌落平均數×稀釋倍數÷涂布所用稀釋液體積數
⑤計數菌落
稀釋105倍
稀釋106倍
稀釋107倍
空白對照
例：
甲同學做此實驗在稀釋倍數105獲得3個平板，菌落數分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數目？
每克土壤中細菌數目＝
（90× 105 ）÷0.1=9 ×107個
解：
每個平板中平均菌落數＝（80+90+100）÷3＝90個
(1)倒平板后，待平板冷凝之后需將其倒置(　　)
(2)若皿蓋和皿底之間濺上培養基，這個培養基不可再用(　　)
(3)平板劃線法接種時，每一次劃線前都要挑取菌體(　　)
(4)培養微生物的溫度因菌種不同而稍有差異(　　)
(5)倒平板后需間歇晃動，以保證表面平整( )
(6)如果不能確定某菌落是否由單個細胞繁殖而來，可通過反復多次進行平板劃線進行培養分離純化 (　　)
(7)在平板3個區域劃線時，要按照順序不間斷進行劃線快速完成 (　　)
(8)經滅菌的培養基冷卻到50 ℃左右進行倒平板并將平板倒置備用 (　　)
√
√
×
√
×
×
×
√
習題鞏固：
(9)稀釋涂布平板法可用于菌種的分離和純化，還可以用于微生物計數(　　)
(10)測定不同微生物數量時，接種的土壤懸液的稀釋度相同(　　)
(11)采用稀釋涂布平板法培養和計算得到的微生物的數量一般比稀釋液中實際微生物的數量要少(　　)
(12)分離土壤中分解尿素的細菌配制培養基時要用尿素作為唯一碳源 (　　)
√
×
√
×
2．平板劃線法是微生物培養中常用的接種方法。下列敘述錯誤的
A．在酒精燈的火焰旁操作可以避免周圍環境中微生物的污染
B．第二次及以后劃線均要從上次劃線末端開始以達到分離單菌落的目的
C．劃線用力大小要適當防止劃破培養基，最后一區域要與第一區域相連
D．接種后需將平板倒置培養，防止冷凝水落入培養基造成污染
C
3．下列關于平板劃線法原理的敘述，錯誤的是
A．劃線過程中，接種環上的菌液逐漸減少
B．劃線最后部分的細菌間的距離加大
C．在適宜條件下，由多個細胞分裂繁殖產生的新細胞聚集成為單菌落
D．將單菌落接種到試管斜面上，培養后形成的菌群就是由一個細菌產生的后代
C
4.下圖為實驗室培養和純化大腸桿菌過程中的部分操作步驟，下列說法錯誤的是
A．①②③步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行
B．步驟①中待倒入的培養基冷卻后蓋上培養皿的皿蓋
C．步驟③中，每次劃線前后都需對接種環進行滅菌處理
D．劃線接種結束后，將圖④平板倒置后放入培養箱中培養
B
5．在分離、純化大腸桿菌實驗中，劃線接種(甲)、培養結果(乙)如下圖。下列有關敘述錯誤的是
A．甲中a區域為劃線的起始位置
B．接種前應對培養基進行高壓蒸汽滅菌
C．連續劃線的目的是獲得單個細菌形成的菌落
D．接種過程中至少需要對接種環灼燒5次
A
6．如圖為“土壤中分解尿素的細菌的分離和計數”實驗中樣品稀釋示意圖。據圖分析正確的是
A．3號試管的稀釋倍數為103倍
B．5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為1.7×109個
C．5號試管中稀釋液進行平板培養得到的菌落平均數恰為4號試管的10倍
D．該方法和平板劃線法都可對微生物進行準確計數
B
7.用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為106的培養基中得到以下幾種統計結果，其中正確的是
A.涂布了1個平板，統計的菌落數是230
B.涂布了2個平板，統計的菌落數是215和260，取平均值238
C.涂布了3個平板，統計的菌落數分別是13、234和254，取平均值167
D.涂布了3個平板，統計的菌落數分別為210、240和250，取平均值233
D
8.下列關于稀釋涂布平板法的敘述，錯誤的是
A．用移液管稀釋菌液時，吹吸三次的目的是使菌液與水充分混勻
B．涂布時取菌液不超過1 mL，涂布均勻后在培養基表面都能形成單個的菌落
C．一般選擇三個不同稀釋度的菌液分別涂布到三組固體培養基的表面
D．在酒精燈火焰旁先將菌液進行系列梯度稀釋，然后進行涂布平板操作
B
9．用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落數就能推測出樣品中的活菌數，原因是
A．平板上的一個菌落就是一個細菌
B．平板中的細菌數目是固定的
C．平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌
D．通過此方法統計的菌落數與活菌的實際數目相同
C
10．下圖所示為分離某種以尿素為氮源的細菌實驗過程，下列敘述錯誤的是
A．土樣從有哺乳動物尿液的地方取，獲得目的菌種的幾率很高
B．為驗證尿素固體培養基具有選擇作用，可用牛肉膏蛋白胨固體培養基做對照
C．將實驗組和對照組37 ℃ 恒溫培養24至48 h時，需將平板倒置
D．在尿素固體培養基上生長的細菌都是以尿素為氮源的細菌
D
11．下列關于稀釋涂布平板法和平板劃線法的操作過程的敘述，錯誤的是
A．稀釋涂布平板法中涂布前要將涂布器灼燒，冷卻后才能蘸取菌液
B．為保證結果準確，每個稀釋度的菌液一般涂布3個平板
C．采用平板劃線法的培養皿中所得的菌落都符合要求
D．平板劃線法中的連續劃線的起點是上一次劃線的末端
C
12．圖甲是稀釋涂布平板法中的部分操作，圖乙是平板劃線法的操作結果。下列敘述錯誤的是
A．圖甲中在涂布前要將沾有少量酒精的涂布器引燃，冷卻后才能涂布菌液
B．稀釋涂布平板法是將不同稀釋度的菌液倒入液體培養基中進行培養
C．圖乙中培養皿所得的菌落不都符合要求
D．圖乙中的連續劃線的起點是上一次劃線的末端
B

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