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第一節 基因工程及其技術
第三章 基因工程
普通小鼠和巨型小鼠
積極思維： 巨型小鼠是怎樣培育的？
事實：
1.1982 年，美國科學家帕米特1942— ）等人采用顯微注射法，將帶有大鼠生長激素基因的重組DNA 分子導入小鼠受精卵內，將其培育成早期胚胎后再植入代孕小鼠體內繼續發育。
2.小鼠妊娠并成功分娩出攜帶有大鼠生長激素基因的小鼠。在同樣生長條件下，這種轉入大鼠生長激素基因的小鼠生長快、體型大，成鼠的體重是同一胎中普通小鼠的1.8倍，有“巨型小鼠”之稱。
小鼠受精卵
帶有大鼠生長激素基因的重組DNA分子
早期胚胎
代孕小鼠
巨型小鼠
胚胎移植
培育
顯微注射法
妊娠、分娩
巨型小鼠的基因組比普通小鼠多了大鼠生長激素基因；
巨型小鼠只是基因工程中的案例之一，那么基因工程是如何快速發展的呢？
巨型小鼠培育過程：
一、基因工程是在多學科基礎上發展而來的
基因工程是在生物化學、分子生物學和微生物學等學科的基礎上發展起來的，正是這些學科的基礎理論和相關技術的發展催生了基因工程。
1、1957年,科恩伯格在大腸桿菌中發現了DNA聚合酶，這種可以在體內外催化合成 DNA 的酶是研究DNA 合成的必備工具。
2、1967 年，羅思和海林斯基發現，細菌除擬核外還有一種具有自我復制能力的環狀DNA分子，即質粒，它們能在細菌細胞之間轉移。這一發現為基因轉移找到了一種轉運工具。同年，科學家在大腸桿菌細胞中又發現了DNA 連接酶。
3、1970 年，特明和巴爾的摩兩位科學家各自在RNA“腫瘤”病毒中發現了逆轉錄酶。 同年，史密斯等又從流感嗜血桿菌中分離到一種特異性很強的限制性內切核酸酶。
4、1972年，伯格領導的研究小組完成了世界上首次 DNA分子體外重組。他們使用同一種限制性內切核酸酶，在體外對猿猴病毒的DNA和噬菌體的DNA分別進行酶切，再用DNA連接酶將兩者的酶切片段連接起來，獲得了重組的DNA分子。
5、1973 年，科恩領導的研究小組成功地利用大腸桿菌質粒進行了另一個體外重組DNA分子實驗。他們將一種含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌質粒和另一種含有四環素抗性基因的大腸桿菌質粒混合后，加入同一種限制性內切核酸酶，對DNA分子進行切割，用DNA連接酶將酶切片段連接起來形成重組DNA分子。這種重組質粒轉化大腸桿菌獲得成功。
接著，科恩和美國科學家博耶合作，將非洲爪蟾核糖體蛋白基因的DNA片段與大腸桿菌的質粒進行重組，再用重組質粒轉化大腸桿菌，成功轉錄出相應的mRNA。 這說明真核生物的基因可以在原核生物中進行表達。
6、1976 年，科學家用質粒為載體，將生長激素釋放抑制因子基因轉入大腸桿菌，并于1977年首次生產出治療肢端肥大癥、巨人癥的生長激素釋放抑制因子。 在這之前，生長激素釋放抑制因子是從動物的下丘腦中提取的，10萬只羊的下丘腦僅能提取出1mg。通過基因工程制備的工程菌來生產這種激素只需不到 2L 的培養液便可獲得1mg 激素。
肢端肥大癥和巨人癥都是由生長激素釋放過多造成的，因此可以用生長激素釋放抑制因子治療。
7、1977 年，英國科學家桑格測定了一種噬菌體的基因組序列，這是人類首次對完整基因組的核苷酸排列順序進行測定。
積極思維：我國是棉花的生產和消費大國。棉花在種植過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。如何能培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種呢？
（已知：蘇云金芽孢桿菌含有一種抗蟲基因）
普通棉花
轉基因抗蟲棉
普通棉花
“分子黏合劑”
“分子搬運工”
＋
如何獲取目的基因？“分子搬運工”“分子黏合劑”是什么？為什么不能把目的基因直接送進相應細胞里？如何檢測目的基因是否表達……
基因工程又稱為DNA重組技術，是指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，將外源目的基因與載體DNA進行組合形成重組DNA，然后導入受體細胞，并使其在受體細胞中表達，產生人類需要的基因產物的技術。
二、基因工程的基本工具
1、基因工程定義：
①操作環境：
②原理：
③操作對象：
④操作水平：
⑤結果：
體外環境；
基因；
DNA分子水平；
基因重組；
賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品；
定向改造生物性狀；克服遠緣雜交不親和障礙；
⑥意義：
2、基因工程操作的理論基礎：
①基本組成單位相同：
②雙鏈DNA分子的空間結構相同：
③DNA堿基對之間的關系相同：
①基因的功能特點：
②遺傳信息的傳遞方向都遵循中心法則；
③生物界共用一套遺傳密碼；
(1)不同生物的DNA分子能拼接起來的原因：
都是四種脫氧核苷酸；
都是規則的雙螺旋結構；
均遵循嚴格的堿基互補配對原則；
(2)外源基因能夠在受體內表達，并使受體表現出相應性狀的原因：
控制生物體性狀的結構和功能單位，具有相對獨立性；
（一）“分子剪刀”——限制性內切核酸酶
1、來源：
主要來自原核生物；
2、種類：
數千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）
3、作用：
能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開；
（具有專一性）
（簡記：識別并切割）
4、切割方式：
（1）錯位切
錯位切是在DNA分子兩條鏈的不同部位進行切割，切割后形成的兩個DNA分子片段的末端均留下一段游離的單鏈，這種單鏈稱為黏性末端。
例：限制酶EcoRI的錯位切，產生由4個脫氧核苷酸組成的黏性末端；
5'
5'
3'
3'
黏性末端
黏性末端
錯位切和平切；
（2）平切
平切是在DNA分子兩條鏈上相同的部位進行切割，切割后形成平末端。
例：限制酶HaeⅢ的平切結果；
5'
5'
3'
3'
平末端
5、限制酶的識別序列的特點：
大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成
①能被限制酶特異性識別的序列，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基反向互補對稱的，即回文序列；
②回文序列：在切割部位，一條鏈從5’往3’讀的堿基順序與另一條鏈5’往3’讀的順序完全一致；
注：
①同一種限制酶切割形成的黏性末端相同；
②不同的限制酶切割形成的黏性末端也可能相同：同尾酶；例：SpeⅠ和 XbaⅠ；
SpeⅠ
XbaⅠ
6、限制酶作用結果：
產生黏性末端或平末端；
③限制酶不能切開RNA分子的磷酸二酯鍵；
④要獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切兩個切口，產生四個黏性(平)末端；
限制酶是原核生物的一種防御工具，用來切割侵入細胞的外源DNA，以保證自身安全。
限制酶不切割細菌本身的DNA分子的原因：
細菌的DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。
小知識：
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
同種限制酶切割(EcoRⅠ)
積極思維：
把兩種來源不同的DNA進行重組，應該怎樣處理？
缺口怎么辦？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
（二）“分子黏合劑”——DNA連接酶
1、作用
形成磷酸二酯鍵，把互補黏性末端或平末端的連接起來形成重組DNA分子；
2、種類
種類
來源
特點
E.coli DNA連接酶
T4 DNA連接酶
只能連接黏性末端
既可以連接黏性末端也可以連接平末端（效率低）
大腸桿菌
T4 噬菌體
限制酶和DNA連接酶的作用示意圖：
自連
自連
注：DNA連接酶與DNA聚合酶的區別：
項目 DNA連接酶 DNA聚合酶
相同點
不同點 模板
作用過程
作用結果
催化形成磷酸二酯鍵
不需要模板
需要以DNA的一條鏈為模板
形成完整的DNA分子
形成DNA的一條鏈
只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵
在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵
（三）“分子搬運工”——載體
1、載體作用：
將外源基因導入受體細胞，并使其在受體細胞中穩定遺傳和表達；
2、種類：
質粒、λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。質粒是最早被應用的載體。
注：質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。
注：基因工程中需要3種工具，但工具酶只有2種；
3、質粒載體需要滿足的條件
①復制原點，保證在受體細胞中進行獨立復制；
②適合的標記基因，用于鑒定和篩選重組DNA分子，如四環素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因；
③有一個或多個限制酶切割位點，便于目的基因（外源基因）的插入；
④對受體細胞無害；
小知識：標記基因的篩選原理
載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性。在含有該抗生素的培養基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞。如圖所示：
2.作為基因的運輸工具——載體，必須具備的條件之一及理由是
A.能夠在宿主細胞中穩定地保存下來并大量復制，以便提供大量的目的基因
B.具有多個限制酶切點，以便于目的基因的表達
C.具有某些標記基因，以使目的基因能夠與其結合
D.對宿主細胞無傷害，以便于重組DNA分子的鑒定和選擇
A
習題鞏固：
1.下列說法中不正確的有
①限制酶主要是從真核生物中分離純化出來的　
②DNA連接酶都是從原核生物中分離得到的　
③所有限制酶識別的核苷酸序列均由6個核苷酸組成　
④不同限制酶的識別序列不同　
⑤T4DNA連接酶可以連接平末端，且連接效率較高
A.①②④⑤ B.①②③⑤ C.②③④⑤ D.①③④⑤
B
3．下列關于DNA連接酶的敘述，正確的是
A.DNA連接酶連接的是兩個DNA片段堿基對之間的氫鍵
B.DNA連接酶連接的是DNA單鏈上的磷酸和脫氧核糖
C.DNA連接酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端
D.E.coli DNA連接酶能將雙鏈DNA片段互補的平末端連接起來
B
4、人們常選用的細菌質粒分子往往帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因的主要作用是
A.提高受體細胞在自然環境中的耐藥性
B.有利于對目的基因是否導入受體細胞進行檢測
C.增加質粒分子的分子量
D.便于與外源基因連接
B
5.（多選）下列有關限制性內切核酸酶的敘述，錯誤的是
A．用限制酶切割一個目的基因兩端時，被水解的磷酸二酯鍵有2個
B．限制酶識別序列越短，則該序列在DNA中出現的概率就越大
C．5′—↓ CATG—3′和5′—G↓CATGC—3′序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA連接酶連接
D．只有用相同的限制酶處理含有目的基因的片段和質粒，才能形成重組質粒
AD
6.下面是四種不同質粒的示意圖,其中ori為復制必需的序列,AmpR為氨芐青霉素抗性基因,Tetr為四環素抗性基因,箭頭表示同一種限制酶的酶切位點。下列有關敘述正確的是 　A.基因AmpR和Tetr是一對等位基因,常作為基因工程中的標記基因
B.質粒指細菌細胞中能自我復制的小型環狀的DNA和動植物病毒的DNA
C.限制酶的作用部位是DNA分子中特定的兩個核苷酸之間的氫鍵
D.用質粒4將目的基因導入大腸桿菌,該菌不能在含四環素的培養基上生長
D
培育轉基因抗蟲棉的具體操作步驟:
與載體拼接
普通棉花
棉花細胞
抗蟲棉 （有抗蟲特性）
導入
抗蟲基因
重組DNA分子
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達載體的構建
3.將目的基因導入受體細胞
4.目的基因的 檢測與鑒定
核 心
基因工程的一般操作程序主要包括四個步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。
1、目的基因的篩選與獲取
4、目的基因的檢測與鑒定
2、基因表達載體的構建
3、將目的基因導入受體細胞
基因工程的基本操作程序
三、基因工程的基本操作程序
（一）目的基因的篩選與獲取
1、目的基因：主要是指編碼蛋白質的基因，如與生物抗逆性、優良品質、生產藥物、毒物降解和工業用酶等相關的基因。
抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白基因
轉基因魚中的熒光蛋白基因
如何獲取目的基因呢？
非編碼區
非編碼區
啟動子：RNA聚合酶的識別和結合位點，開始轉錄
編碼區
終止子：終止轉錄
原核生物基因：
真核生物基因：
啟動子
終止子
能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子；
不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子；
內含子：
外顯子：
連續
不連續
2、獲取目的基因的方法
（1）化學方法直接人工合成目的基因
①DNA合成儀人工合成：
對于比較小的目的基因，在明確脫氧核苷酸序列后，可以通過DNA合成儀人工合成。
DNA合成儀
②半合成法
a、適用對象：全基因或較大基因。采用全部化學合成成本昂貴，使用半合成法可以降低成本。
在dNTP存在的條件下，通過Klenow酶合成相應的互補鏈
在適當條件下退火得到模板——引物復合體
合成基因的部分寡核苷酸片段（3′末端具有10~14個互補堿基）
b、半合成法過程：
用相應的DNA連接酶修復缺口，獲得兩條完整的互補雙鏈
是能將雙鏈DNA的突出5′端補平的DNA聚合酶
（1）基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，每個受體菌可能分別含有該種生物的不同基因，稱為基因文庫。包括基因組文庫和cDNA文庫。
2、通過基因文庫獲取目的基因
①基因組文庫：是指含有某種生物體全部基因片段的重組DNA的克隆群體；
限制酶
DNA連接酶
體外包裝、轉染
a、基因組文庫構建過程
b、從基因組文庫篩選目的基因方法：一般采用核酸探針雜交的方法，將某基因的已知片段作為篩選的探針，在基因組文庫中篩選含有目的基因的菌落，進行擴增、分離回收而獲得目的基因。
②cDNA文庫：包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。
a、 cDNA文庫構建過程
注：cDNA文庫的基因中不含有啟動子、終止子、內含子等結構。
3、利用PCR獲取和擴增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年發明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學獎。
① PCR含義：
聚合酶鏈式反應簡稱PCR，是目的DNA片段(目的基因)的體外擴增技術。
通過這項技術可在短時間內大量擴增目的基因。
整個過程是在體外進行，故又叫做體外DNA擴增技術。
②PCR的原理：
DNA半保留復制；
PCR儀
③反應條件
條件 作用
一定量的模板DNA
引物對
4種脫氧核苷酸dNTP
緩沖液
熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）
Mg2+
作為DNA復制的模板
使DNA聚合酶能從引物3′端開始連接脫氧核苷酸（ 5 ′→3′延伸 ）
作為合成DNA子鏈的原料，還可以水解為PCR反應提供能量
提供相對穩定的pH環境
催化合成DNA子鏈
真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活
引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。
3’
5’
DNA母鏈1
3’
5’
DNA母鏈2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
小知識：①什么是引物？
3’
5’
DNA母鏈1
3’
5’
DNA母鏈2
引物可以是DNA單鏈，細胞外（PCR）一般以DNA單鏈為引物；
也可以為RNA單鏈，細胞內的DNA復制通常以RNA單鏈為引物；
用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。
引物結合在模板鏈的3’端
注：進行PCR的前提條件是：已知目的基因兩端的核苷酸序列以便合成一對引物。
小知識：② 什么是dNTP ？
dNTP是脫氧核苷三磷酸的縮寫，N是指A、T、G、C四種含氮堿基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它們是由兩個磷酸分子和一個脫氧核苷酸組成的，其結構簡式如下：
A
T
C
G
P ~ P ~ P
脫氧核糖
含氮堿基
磷酐鍵
脫氧核苷酸
③PCR過程
待擴增的DNA片段
第一步：變性
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
變性
在約94℃高溫下，作為模板的雙鏈DNA解旋（變性）為兩條單鏈DNA；
第二步：復性
引物1
引物2
3’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
反應體系的溫度降至約55℃，2條引物分別與對應單鏈DNA上的特定部位配對。
第三步：延伸
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
3’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
反應體系的溫度回升到約72℃（Taq酶催化作用的最適反應溫度），4種脫氧核苷三磷酸根據堿基互補配對原則，在Taq酶的作用下連接到引物3′端之后，使引物鏈延伸，并形成互補的DNA雙鏈。
思考：PCR一輪后獲得的兩個DNA分子的兩條鏈等長嗎？若不等長，那么在第幾輪會出現兩條鏈等長的DNA分子？
思考：下圖是某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)，都不合理，請分別說明理由。
第1組： ；
第2組： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ會因局部發生堿基互補配對而失效
引物Ⅰ′自身折疊后會因出現局部堿基互補配對而失效
注：
①PCR中兩種引物都結合在DNA模板鏈的3’端，使用的兩種引物的序列不相同；引物自身不應存在互補序列；兩條引物之間不應存在互補序列；
③需在引物的5’端加上限制酶的酶切位點；
② PCR復制n次，產生的DNA分子數 ； 含引物的DNA分子數 ；
只含一種引物的DNA分子數 ；
同時含兩種引物的DNA分子數 ；
共消耗引物的對數 ；
含脫氧核苷酸鏈等長的DNA分子數 ；
2n
2n
2
2n－2
2n－1
2n－2n
比較項目 PCR 細胞核內DNA復制
場所 試管中 細胞內
方式 半保留全連續局部區域復制 半保留半不連續全鏈復制
起始位點 引物3'端 復制起始位點
酶 僅一種DNA聚合酶（Taq酶） 多種酶
反應條件 溫度變幅大 溫和
解旋 高溫解旋 解旋酶解旋
引物 DNA片段，保留在復制的子鏈中 RNA 片段，不保留在復制的子鏈中
產物 引物界定的片段 核基因組
循環次數 人為設置 與細胞分裂同步
總結：PCR與細胞內DNA復制的比較
④PCR技術的應用
(1)廣泛應用于醫學及分子生物學領域，如：病原體鑒定、遺傳病診斷、免疫學研究、癌基因探索及某些疾病治療等。
(2)在古生物學、法醫學等方面也有廣泛的應用。
判斷：
(1)PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(　　)
(2)用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列(　　)
(3)PCR技術中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高(　　)
×
√
√
1.下列有關PCR技術的說法，錯誤的是
A.PCR是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術
B.PCR技術的原理是DNA分子半保留復制
C.退火過程中引物與模板鏈的結合遵循堿基互補配對原則
D.PCR過程中只需要用到模板DNA、兩種引物分子、4種脫氧核苷三磷酸原料
D
2.下列關于基因工程及應用的敘述，正確的是
A.從cDNA文庫中能獲取某種生物的全部基因
B.一種核酸探針能從基因組文庫中篩選出多種基因
C.利用半合成法合成全基因時只需要DNA連接酶的作用
D.構建cDNA文庫需要用到逆轉錄酶
D
3.聚合酶鏈式反應(PCR)被廣泛用于遺傳疾病的診斷、刑事偵查、古生物學和基因工程等領域。利用PCR技術可快速擴增目的基因。下列有關敘述錯誤的是
A.擴增目的基因的前提條件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
B.PCR技術需要使用Taq酶的原因是其耐高溫
C.PCR技術擴增時，兩種引物的堿基序列要盡可能互補
D.若目的基因擴增5次，則需要消耗62個引物分子
C
4.甲、乙兩圖表示從細菌細胞中獲取目的基因的兩種方法，以下說法中錯誤的是
A.甲方法可建立該細菌的基因組文庫
B.乙方法可建立該細菌的cDNA文庫
C.甲方法中的b過程要以脫氧核苷酸為原料
D.乙方法需要逆轉錄酶參與
C
思考：能不能直接將目的基因導入受體細胞，為什么？如果不能，如何避免該結果的發生呢？
析：游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，且游離的DNA片段不能穩定遺傳。
構建基因表達載體（核心工作）
（二）基因表達載體的構建（核心步驟）
1、構建基因表達載體的目的：
（1）使目的基因在受體細胞中穩定存在，且可以遺傳給下一代；
（2）使目的基因能夠在受體細胞中表達和發揮作用。
2、基因表達載體組成：
①目的基因：
控制特定性狀或表達特定產物；
②啟動子：
功能：是RNA聚合酶識別、結合的部位，始驅動基因轉錄出mRNA；
位置：位于目的基因的上游；
③終止子：
④標記基因：
位置：位于目的基因的下游；
功能：終止轉錄；
檢測并篩選含目的基因的受體細胞；
⑤復制原點：
要能與特定的受體細胞相匹配，使外源基因在受體細胞中能穩定復制并遺傳；
注：
①目的基因應該插入啟動子和終止子之間；
②載體與表達載體區別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。
③啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的比較：
啟動子：位于DNA上，是RNA聚合酶的結合位點，轉錄
的起始點；
起始密碼子：位于mRNA上，是翻譯的起始點（AUG：甲
硫氨酸））
終止子：位于DNA上，是轉錄的終點；
終止密碼子：位于mRNA上，翻譯的終點（有UAA、UGA、
UAG三種，不編碼氨基酸)
3、基因表達載體的構建過程
3、基因表達載體的構建過程
載體
（質粒）
DNA分子
（含目的基因）
同一種限制酶（或能產生相同黏性末端的限制酶）處理
帶有黏性末端或平末端的切口
帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA連接酶
重組DNA分子（重組質粒）
積極思維：請結合下圖，回答問題：
（1）構建基因表達載體時，能否用SmaⅠ限制酶切割質粒？為什么？
不能，
因為SmaⅠ切割會破壞質粒的抗生素抗性基因；
質粒上的抗性基因是標記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進一步篩選。
（2）只使用EcoRⅠ分別切割質粒和外源DNA，能否構建基因表達載體？
如果能，有何弊端？
能
單酶切產生的黏性末端相同，所以可能會產生以下幾種連接方式:
①質粒重新環化；
②目的基因自身環化；
③質粒與目的基因反向連接；
例：質粒與目的基因正向連接：
質粒與目的基因反向連接：
（3）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優點是什么？
①可以防止質粒、目的基因的自身環化連接；
②還可以防止目的基因與載體的反向連接。
注：在基因工程實際操作中，可利用產生不同黏性末端的的限制酶切割質粒和含目的基因的外源DNA，以防止質粒和含目的基因的外源DNA自身環化或反向連接；
1．下列有關體內DNA復制與PCR技術比較的敘述，錯誤的是
A．二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端
B．二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實現解旋
C．體內DNA復制需要能量，PCR反應也需要能量
D．二者遵循的堿基互補配對原則相同
B
習題鞏固：
2.下列有關基因表達載體的敘述，不正確的是
A.具有復制原點，使目的基因能在受體細胞內擴增
B.具有啟動子，作為核糖體識別、結合的部位
C.具有標記基因，有利于重組DNA的鑒定和選擇
D.具有目的基因，以獲得特定的基因表達產物
B
3．圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內切核酸酶的酶切位點，Amp R表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯誤的是
A．在構建重組質粒時，可用PstⅠ和HindⅢ切割質粒和外源DNA
B．在酶切過程中，不能破壞質粒中全部的標記基因
C．若只用PstⅠ處理質粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環化和反向連接
D．導入重組質粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養基中生長
D
由于不同轉基因產品所需要的目的基因不同，受體細胞又有植物、動物、微生物之分，因此基因表達載體的構建方法不是千篇一律的,將目的基因導入受體細胞的方法也不是完全相同的。
構建好的重組表達載體要如何導入受體細胞？
（三）將目的基因導入受體細胞
轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程，稱為轉化。
(2)農桿菌
①感染對象：能在自然條件下感染雙子葉植物或裸子植物，但不會感染大多數單子葉植物。
②感染原因：當雙子葉植物或裸子植物受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農桿菌向傷口處移動。
③特點：農桿菌含有Ti質粒，上面有一段轉移DNA(T－DNA)，能進入受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。
(1)主要方法：
1、將目的基因導入植物細胞
農桿菌轉化法；
T-DNA
Ti質粒
大型環狀DNA
農桿菌
將目的基因插到農桿菌Ti質粒的T－DNA特定區段上，再通過T－DNA將其插入植物細胞染色體的DNA上，使目的基因得到穩定的遺傳和表達；
(3)農桿菌轉化法的原理：
(3)農桿菌轉化法過程：
注：農桿菌轉化法中有兩次拼接和兩次導入:
第一次拼接: 將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作): 插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上。
第一次導入: 是將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌；
第二次導入(非人工操作):是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞。
用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
補充：將目的導入植物細胞的方法-----花粉管通道法
操作方式：
在植物受粉后一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。
花粉管通道法是我國科學家周光宇在1987年獨創的。將重組DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道內，進入卵細胞、合子或早期胚胎細胞中。此方法直接、簡便且經濟，已應用于水稻、小麥、棉花、大豆等多種植物中。
2、將目的基因導入哺乳動物細胞
構建基因表達載體并提純
利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中
胚胎移植（移植到同期發情的母畜子宮內）
獲得具有新性狀的動物
（1）
顯微注射法；
（2）病毒感染法
用病毒DNA與目的基因一起構建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因導入動物細胞內。
普通鼠與生長速度加快的轉基因鼠
①受體細胞：
微生物（常用大腸桿菌）
優點：
繁殖周期短
體積小易于培養操作
多為單細胞
遺傳物質相對較少
（3）將目的基因導入微生物細胞：
大腸桿菌細胞
②感受態細胞
經過適當的處理，如用Ca2+（CaCl2）處理后，細胞質膜對DNA的通透性會發生改變，細胞變得容易接受外來的DNA，處于這種狀態的細胞稱為感受態細胞。
Ca2+處理法
Ca2+處理微生物細胞
感受態細胞
將重組的基因表達載體與感受態細胞混合在緩沖液中
在適當的條件下完成轉化
培養基上篩選帶目的基因的微生物
③過程：
種類項目 　　 植物細胞 動物細胞 微生物細胞
常用方法
受體細胞
轉化過程 目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達 目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物 Ca2＋處理細胞→感受態細胞→表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸DNA分子
小結：
農桿菌轉化法；
花粉管通道法
顯微注射法
Ca2＋處理法
體細胞或受精卵
受精卵
原核細胞
（四）目的基因的檢測與鑒定
1、分子水平的檢測（人教版）
如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因
——通過PCR等技術檢測
PCR操作
是否擴增出目的基因
M：marker； 1-陽性質粒；
2：原始品系； 3-9轉Bt品系；
PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果
電泳操作
① 檢測目的基因是否導入
提取DNA
如：檢測Bt基因是否翻譯出mRNA
——通過PCR等技術檢測
10個PCR陽性棉花植株中，有四株Bt基因發生轉錄
② 檢測目的基因是否轉錄
（四）目的基因的檢測與鑒定
(1)從DNA方面進行檢測
①檢測方法：
②檢測原理：具有一定同源性的兩條DNA單鏈，在一定條件下(適宜的溫度等)可以按照堿基互補配對原則形成雙鏈；
1、分子水平的檢測（蘇教版）
③基因探針：用放射性同位素或熒光標記的已知DNA片段；
④結果分析：若待測DNA中有能與基因探針互補的特異性DNA片段，用于示蹤的放射性同位素標記或熒光標記會指示出其所在的位置（形成雜交帶），表明目的基因已經插入轉基因生物的DNA分子中。
DNA分子雜交法；
⑤檢測過程
形成雜交帶
(2)從RNA方面進行檢測
①檢測目的：檢測目的基因是否能發揮其功能，即是否轉錄出相應的mRNA分子；
②檢測方法：
③檢測過程：
從待測轉基因生物細胞中提取mRNA分子，用已標記的目的基因片段作為探針與mRNA雜交，如果有雜交帶出現，表明目的基因轉錄出相應的mRNA分子；（Northern印跡）
分子雜交技術；
(3)從蛋白質方面進行檢測：
①檢測方法：
②檢測過程：
從待測轉基因生物中提取蛋白質，再用相應的
抗體進行抗原—抗體雜交；
③結果分析：
如果有雜交帶出現，說明目的基因已經表達出相應的蛋白質。
檢測目的基因是否翻譯成相應的蛋白質；
抗原—抗體雜交法；
2、個體水平的檢測
(1)檢測目的：
(2)實例：
①對于導入某種魚的抗凍蛋白基因的轉基因番茄進行個體檢測，需要栽培轉基因番茄獲得果實后，再與天然產品比較，確定其是否具有了抗凍性狀；
②抗蟲棉的培育成功與否可以直接接種棉鈴蟲，和普通棉花進行對照，以確定棉花是否真的具有了抗蟲特性；
對生物的某些特定性狀進行鑒定；
轉基因生物 檢測方法 成功標志
抗蟲植物
抗病毒(菌)植物
抗鹽植物
抗除草劑植物
獲取目的基因產物的轉基因生物
常見轉基因生物在個體水平上鑒定、檢測的方法（列舉如下表）
飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）
害蟲死亡
病毒（菌）感染（抗病接種實驗）
未出現病斑
鹽水澆灌
正常生長
噴灑除草劑
正常生長
提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較
功能、活性正常
檢測水平 檢測內容 方法 結果顯示
分子水平的檢測 DNA
RNA
蛋白質
個體水平的檢測
小結：
檢測轉基因生物的染色體上是否插入了目的基因
DNA分子雜交法（基因探針+待測轉基因生物的DNA）
是否顯示出雜交帶
檢測目的基因是否轉錄
分子雜交技術（基因探針+待測轉基因生物的mRNA）
檢測目的基因是否翻譯成蛋白質
抗原—抗體雜交
包括抗蟲、抗病的接種試驗，抗凍的耐寒試驗，以確定是否有抗性及抗性程度；基因工程產品需要與天然產品進行活性比較等
1.下列關于將目的基因導入受體細胞的說法中，正確的是(多選)
A.農桿菌在自然條件下不侵染單子葉植物的原因是單子葉植物產生的酚類化合物有刺激性
B.將目的基因導入動物細胞采用最多的方法是顯微注射法
C.為使大腸桿菌易吸收DNA分子，應先用一定濃度的CaCl2溶液進行處理
D.在顯微注射法中，不需要先構建基因表達載體
BC
習題鞏固：
2．運用轉基因技術，將奶牛細胞中編碼凝乳酶的基因轉移到大腸桿菌細胞中，達到大規模生產凝乳酶的目的。下圖表示用作運載體的質粒和目的基因所在DNA片段。下列操作與實驗目的不符的是
B
A．用限制酶BamH Ⅰ、Pst Ⅰ和DNA連接酶構建基因的表達載體
B．用含氨芐青霉素的培養基篩選出的即為導入目的基因的細菌
C．可用PCR技術大量擴增目的基因
D．用Ca2+處理大腸桿菌使其易于轉化
3.下圖為科學家通過基因工程培育抗蟲棉時，從蘇云金桿菌中提取抗蟲基因“放入”棉花細胞中，與棉花的DNA分子“結合起來”而發揮作用的過程示意圖。以下相關說法不正確的是
A.圖中Ⅰ是質粒，步驟①需要用到限制酶和DNA連接酶
B.圖中Ⅱ是含目的基因的重組質粒，步驟②是將重組質粒導入棉花細胞
C.圖中Ⅲ是農桿菌，通過步驟③將目的基因導入植物細胞
D.剔除培育成功的抗蟲棉體內的四環素抗性基因不會影響抗蟲基因的表達
B
4．為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質粒（圖2）重組，再借助農桿菌導入菊花中。下列操作與實驗目的不符的是
A．用限制性核酸內切酶EcoR Ⅰ和連接酶構建重組質粒
B．用含C基因的農桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因導入細胞
C．在培養基中添加卡那霉素，篩選被轉化的菊花細胞
D．用DNA分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上
C
5．下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述正確的是
A．②的構建需要限制性內切核酸酶和DNA聚合酶參與
B．③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④染色體上
C．④染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現出抗蟲性狀
D．⑤只要表現出抗蟲性狀就表明植株發生了可遺傳變異
D
實驗：DNA的粗提取和鑒定
不同生物、不同組織細胞的DNA提取方法不同。提取DNA也應考慮對DNA純度的要求和實驗條件選擇不同的方法。例如，提取質粒DNA常用堿裂解法獲取質粒再提取DNA。
（一）實驗原理
1、提取DNA
利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分；
（1）DNA在NaCl溶液中的溶解性：
DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，0.14mol/L時，DNA溶解度最小；高于或低于這一濃度，DNA的溶解度都會逐漸增大。
DNA不溶于酒精溶液，但細胞中某些蛋白質則溶于酒精。利用這一原理，可初步分離DNA與蛋白質。
（2）DNA不溶于酒精溶液
2、DNA的鑒定
在酸性條件下，DNA與二苯胺發生反應，溶液呈藍色。
（二）實驗材料的選取
原則上，凡是含有DNA的生物材料都可以考慮；選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。
一般選取雞血來提取DNA，雞血中血細胞含量高，DNA含量豐富，材料易得，細胞易吸水漲破。也可以選用植物細胞如洋蔥等，只是破碎植物細胞比較麻煩，提取洋蔥DNA時，需先將洋蔥切碎，然后加入一定量的洗滌劑（洗滌劑溶解或破壞細胞膜，有利于DNA的釋放）和食鹽（利用鹽析法去除蛋白質，有利于獲取較純凈的DNA），進行充分攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。
注：該實驗中不能選用豬血等哺乳動物的血，因為哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核和各種細胞器。
燒杯、量筒、玻璃棒、研缽、紗布、漏斗、試管、試管架、試管夾、酒精燈、石棉網、三腳架、火柴、刀片和天平等。
1、制備雞血細胞液
（四）實驗步驟
取質量濃度為0.1ｇ/mL的檸檬酸鈉溶液（防止血液凝固）100ｍＬ和新鮮雞血180ｍＬ，注入500ｍL燒杯中，充分攪拌。將混合均勻的雞血細胞液置于４ ℃冰箱內，靜置１天（或離心），使血細胞沉淀，去除上清液。
（三）實驗用具
2、破碎細胞
取出準備好的雞血細胞液５～10ｍL，注入50ｍL燒杯中，并向燒杯中加入20ｍL蒸餾水，攪拌 5min。用墊有紗布的漏斗過濾，取其濾液。
3、獲取含DNA的濾液
取物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液40 mL加入濾液中，用玻璃棒沿同一方向輕輕攪拌，使其混合均勻，使濾液中的DNA充分溶解。
4、析出DNA
取適量蒸餾水沿燒杯內壁緩緩加入，同時用玻璃棒沿同一方向輕輕攪拌（防止DNA發生斷裂）。隨蒸餾水的不斷加入，NaCl溶液濃度會降低，DNA的溶解度會降低，燒杯中會有絲（絮）狀物（含有一定雜質的DNA）出現。當絲狀物含量不再增加時，停止加入蒸餾水。
5、提純DNA
將分離的絲狀物放入物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液中，使其溶解，再加入適量冷卻的、體積分數為95%的乙醇溶液時，DNA的絮狀物會從濾液中析出。
析出DNA
注：冷卻的酒精溶液(體積分數95％)作用：
①進一步提純DNA；
②抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
③低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。
6、DNA的鑒定
將分離的絲狀物放入物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液中，使其溶解，利用二苯胺、冰醋酸、濃硫酸配制二苯胺試劑。向上述溶液中加入二苯胺試劑，沸水浴加熱數分鐘，溶液出現藍色。（對照組除了不加絲狀物，其他條件與實驗組相同）
總結：不同試劑的作用
試劑 作用
蒸餾水
NaCl溶液
乙醇
二苯胺
檸檬酸鈉
加到雞血細胞液中，使血細胞吸水漲破
加到含DNA的2 mol·L-1的NaCl溶液中，使其濃度下降析出DNA
2 mol·L-1的NaCl溶液可以溶解DNA
冷卻的、體積分數為95%的乙醇可以除去雜質以提純DNA
鑒定DNA的試劑
抗凝劑，防止血液凝固
0.14 mol·L-1的NaCl溶液可以析出DNA
1.在“DNA的粗提取和鑒定”實驗中，實驗原理是DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同。DNA的溶解和析出與圖中所示曲線的對應點符合的是
A.a點濃度最適合析出DNA
B.b點濃度最適合析出DNA
C.c點濃度最適合溶解DNA
D.d點濃度最適合析出DNA
B
習題鞏固：
2.下列有關“DNA的粗提取和鑒定”實驗原理的敘述，正確的是
A.DNA在NaCl溶液中的溶解度隨NaCl溶液濃度的升高而減小
B.利用DNA不溶于乙醇的性質，可除去細胞中溶于乙醇的物質而得到較
純的DNA
C.DNA是大分子有機物，易溶于水也溶于某些有機溶劑
D.在沸水浴中，DNA遇二苯胺試劑會出現紫色反應
B
3．圖1、2分別為“DNA的粗提取和鑒定”實驗中部分操作示意圖，下列敘述不正確的是
A．圖1中完成過濾后應向濾液中加入一定量的檸檬酸鈉溶液
B．圖2完成后要將玻璃棒上絲狀物重新溶解到2 mol/L的NaCl溶液中進行后續鑒定
C．圖1、2中加入蒸餾水的目的不同
D．圖1、2中攪拌的目的不同
A
4．（多選）提取生物大分子的基本思路是選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子，如提取DNA就要利用它與RNA、蛋白質等在物理和化學性質方面的差異，去除其他成分。下列有關DNA的粗提取與鑒定的敘述，錯誤的是
A．可用新鮮豬血代替雞血做實驗材料
B．鑒定DNA時將絲狀物直接加入到二苯胺試劑中并沸水浴加熱
C．收集、保存好剩余的二苯胺試劑，以備以后實驗時繼續使用
D．純化提取DNA時，要控制NaCl溶液的濃度，以溶解和析出DNA
ABC
實驗：利用PCR技術擴增DNA片段并完成電泳鑒定
一、實驗目的
1、嘗試運用PCR儀擴增DNA片段；
2、關注PCR技術的應用；
3、學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的方法和技術；
二、實驗原理
（1）擴增DNA片段的過程包括變性、退火和延伸等步驟的多次循環。理論上，每經過一個循環，樣本中DNA片段的數量增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過n個循環后，DNA片段數量可擴增至原來的2n倍。
（2）PCR反應體系包括：DNA模板、反應緩沖液、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的DNA引物對、Taq酶等。在不同階段，還需要控制PCR儀反應系統的不同溫度。
1、利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理
2、DNA片段電泳鑒定的原理
（1）DNA分子具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
（2）PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。
（3）在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小（DNA分子量越大，遷移的越慢）和構像等有關。
（4）凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。
三、實驗器材和試劑
1、儀器
2、試劑
PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳系統、凝膠成像儀或紫外透射儀、微孔加熱器(微量恒溫儀)等。
DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、雙蒸水、10×PCR緩沖液等。
PCR儀
微量離心管
微量移液器
電泳裝置
1、PCR擴增目的基因
（1）配制反應體系：
四、實驗步驟
用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分：
待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）；
參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。
（2）按程序進行擴增。
①94 ℃預變性5 min
②94 ℃變性1 min
③55 ℃退火1 min
④72 ℃延伸2 min
⑤重復②～④,30個循環
⑥72 ℃延伸7～10 min；
注：
預變性作用：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合；
（1）配制瓊脂糖溶液
根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻；
（2）制備凝膠
①將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔；
③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜；
②待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內；
2、DNA片段的電泳鑒定
（3）加樣
將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物（Marker）；
（4）電泳
接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1-5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳；
（5）觀察記錄
取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相；
注：
①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理；
②該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化；
③在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換；
④在進行操作時，一定要戴好一次性手套；
⑤PCR擴增不能隨意加大試劑用量；
思考：你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？
轉Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果
(M：marker；1-陽性質粒；2：原始品系；3-9轉Bt品系；)
DNA標準樣液
(Marker)
陽性
對照
陰性
對照
待測樣品
注：
陰性對照作用：用于檢測是否存在含有其他序列的DNA污染；
注：
（1）未出現擴增條帶的原因主要有：
①Taq酶失活； ②引物出現質量問題；
③Mg2＋濃度過低； ④變性時的溫度低，變性時間短。
（2）出現非特異性擴增條帶的原因主要有：
①模板DNA出現污染。
②引物特異性不強或形成引物二聚體。
③Mg2＋濃度過高。
④退火時的溫度過低等。
（3）若PCR反應中變性時溫度低、時間短可能導致未出現擴增條帶；
（4）退火時的溫度過低對可能導致出現非特異性擴增條帶；
1.下列有關體內DNA復制與PCR技術比較的敘述，錯誤的是
A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實現解旋
C.體內DNA復制需要能量，PCR反應也需要能量
D.二者遵循的堿基互補配對方式相同
B
習題鞏固：
2.用PCR方法檢測轉基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水，PCR時加入的模板DNA如圖所示。據此作出的分析，不合理的是
A.PCR產物的分子大小在250～500 bp之間
B.3號樣品為不含目的基因的載體DNA
C.9號樣品對應植株不是所需的轉基因植株
D.10號確定反應體系等對結果沒有干擾
B
3．PCR是一種體外擴增DNA的技術，模擬了體內的DNA復制過程。下圖為PCR技術的原理示意圖，對于圖中物質和過程的說明，錯誤的是
A．物質a：游離的dNTP
B．過程①：氫鍵斷裂
C．過程②：邊解旋邊復制
D．過程③：遵循堿基互補配對原則

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