資源簡介

(共33張PPT)
普通棉花不抗蟲
蘇云金芽孢桿菌可以合成抗蟲毒素——Bt 蛋白 思考：如何生產抗蟲棉
雜交育種 同種生物之間進行
誘變育種 在原有基因上發生基因突變，
產生新基因——等位基因
不定向
普通棉花
抗蟲棉
第3章基因工程
按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，
創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品，從技術操 作層面看，由于基因工程是在DNA 分子水平上進行設計和施工 的，因此又叫做重組DNA 技術。
原 理 ： 基因重組
操作水平： DNA 分子水平
優 點 ： ①能克服遠緣雜交不親和的障礙；
②定向改造生物的遺傳特性。
編碼區(連續，不間隔)
編碼區—
(間隔，不連續)
外顯子 內含子
非編碼區
啟動子
真核基因：
—非編碼區一
與RNA聚合 酶結合位點
原核基因：
DNA
非編碼區
終止子 基因
非編碼區—
1953年沃森和 克里克建立了 DNA雙螺旋 結構模型并提 出了遺傳物質 自我復制的假 說 。 1967年，科學家 發現，在細菌擬 核DNA 之外的 質粒有自我復制 能力，并可以在 細菌細胞間轉移。 20世紀70年代初，多 種限制酶、DNA 連接 酶和逆轉錄酶被相繼 發現。這些發現為 DNA 的切割、連接以 及功能基因的獲得創 造了條件。 1973年，科學家證明 了質粒可以作為基因 工程的載體，構建重 組DNA, 導入受體細 胞，使外源基因在原 核細胞中成功表達， 并實現了物種間的基 因交流。至此， 基因 工程正式問世。
1985年，
穆里斯等 人發明
PCR ,為獲 取目的基 因提供了 有效手段。
1944年艾弗里等人 通過肺炎鏈球菌的 轉化實驗，不僅證 明了遺傳物質是 DNA, 還證明了 DNA 可以在同種生 物個體間轉移。 1961年尼倫伯格 和馬太破譯了第 一個編碼氨基酸 的密碼子。截至 19666年，64個密 碼子均被破譯成 功 。 1970年科學 家在細菌中 發現了第一 個限制性核 酸內切酶 (簡稱限制 酶 ) 1972年，伯格 首先在體外進 行了DNA的 改造，成功構 建了第一個體 外重組DNA 分 子。
1982年，第一個基 因工程藥物-重組人 胰島素被批準上市。 基因工程藥物成 為 世界各國研究和投 資開發的熱 點。
基因工程發展歷程
基因工程誕生的理論基礎
1、不同生物的基因為什么能拼接
(1)DNA 的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸
(2)雙鏈DNA 分子的空間結構都是 規則的雙螺旋結構
2、外源基因為什么能在受體細胞中表達
(1) 基因 是控制生物性狀的獨立遺傳單位。
(2)遺傳信息的傳遞都遵循 中心法則。
(3)生物界共用一套 遺傳密碼
DNA
大腸桿菌細胞
質粒
抗菌素抗性基因
控制質粒DNA 轉移的基因
3.1重組DNA 技術的基本工具
從社會中來
番木瓜容易受番木瓜環斑病毒的侵害。當
番木瓜受到這種病毒感染后，產量會大大下降。 科學家通過精心設計用“分子工具”培育出了 轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒。
DNA雙螺旋的直徑只有2nm。
科學家用到了哪些“分子工具”
這些“分子工具”各具有什么特征呢
非轉基因番木瓜
轉基因番木瓜
將體外重組好的DNA 分子導入受體細胞
重 組DNA 技術的基本工具
將DNA 片段 連接起來
準確切割 DNA 分子
“分子手術刀”
“分子縫合針”
“分子運輸車”
1、來源： 主要從原核生物中分離純化出來，也有少部分來自真核生物
2、種類： 數千種(限制酶不是一種酶，而是一類酶)
一、限制性內切核酸酶(限制酶)——“分子手術刀”
一 、限制性內切核酸酶(限制酶)—— “分子手術刀”
生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母
的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一 種限制酶是從大腸桿菌 (Escherichia coli) 的R 型菌株分離來的，
就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第 一種限制酶，則進一步表示成EcoRI 。
粘質沙雷氏桿菌 ( Serratia marcesens)中分離的第一種限制酶即 Sma I ;
流感嗜血桿菌的d菌株 (Haemoph ilus influenzaed) 中先后分離到3種
限制酶，則分別命名為： Hind I 、Hind Ⅱ 、HindⅢ O
一 、限制性內切核酸酶(限制酶)—— “分子手術刀”
1、來源： 主要從原核生物中分離純化出來，也有少部分來自真核生物
2、種類： 數 千 種 (限制酶不是一種酶，而是一類酶)
3、 作 用 ：
識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，
并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
3'端 5'端
一 、限制性內切核酸酶(限制酶)—— “分子手術刀”
識別序列：大多數由6個核苷酸組成；少數由4個、8個或其他數量組成。
BamHI Taql
T
T
特點：
1.都可以找到一條中(心)軸線；
兩條鏈5'-3'讀取的堿基
順序是完全一樣的。
EcoRI
HindlII
L
中軸線
一 、限制性內切核酸酶(限制酶)—— “分子手術刀”
4 、結果 實例1——EcoRI 限制酶
識別特定序列為GAATTC ; 切割特定部位為G 、A 之間的磷酸二酯鍵
(1) 黏性末端： 黏性末端
G + --1--+-1 ; I C T T A AG
當限制酶在它識別序列
的中軸線兩側將DNA分 子的兩條鏈分別切開時。
黏性末端
一 、限制性內切核酸酶(限制酶)—— “分子手術刀”
4、結果 實例2——SmaI 限制酶
識別特定序列為CCCGGG; 切割特定部位為C、G 之間的磷酸二酯鍵
(2)平末端：
當限制酶在它識別序列
的中軸線處將DNA 分子 的兩條鏈分別切開時。
C C G
0 一 )
平末端 平末端
指
寫出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH I EcoR I Hind Ⅲ Bgl Ⅱ
山 V
—GGATCC— —GAATTC— —AAGCTT— —AGATCT—
—CCTAGG— —CTTAAG— —TTCGAA— —TCTAGA—
—G -G —A —A
BamH I—CCTAG EcoR ]-CTTAA HindⅢ -TTCGA Bgl I—TCTAG
思考：從中你發現了什么 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
即時訓練
1、你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎
原核生物易受自然界外源DNA 的入侵，但生物在長期的進
化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害 。
限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA 侵入時，
會利用限制酶將外源DNA 切割掉，以保證自身的安全。所以， 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA 、 使之失效，從而 達到保護自身的目的。
一、限制性內切核酸酶(限制酶)——“分子手術刀”
2 、為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA
通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA
分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶 將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。
這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA 被切斷， 并且可以防止外源DNA 的入侵。
一、限制性內切核酸酶(限制酶)——“分子手術刀”
1.要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口
可產生幾個黏性末端
要切兩個切口，產生四個黏性末端。
限 制 酶 切 一 次 可 產 生幺 個 末 端 和 增 加 2 個 游 離 的 磷 酸 基 團
2.如果把兩種來源不同的DNA 用同一種限制酶來切割，會怎樣呢
會產生相同的黏性末端
一、限制性內切核酸酶(限制酶)——“分子手術刀”
A A T T
C T T A A
A A T T
C T T A A
思考：把兩種來源不同的DNA 進行重組，應該怎樣處理
A A T T
G C T
用同種限制酶切割(EcoR
T T
I
4—
6—— (
—— ○
A T
…
G
T
G A A T T C
C T T A A G
A A T T C
C T T A A G
缺口怎么辦
—— 6
E ·coli DNA連接酶
T4 DNA連接酶
來源 大腸桿菌
T4噬菌體
連接的 末端類型 黏性末端和平末端(連接平末 端效率遠低于T4 DNA連接酶)
黏性末端
和平末端
相同點 恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵
二、DNA連接酶 —“分子縫合針”
1.作用：將兩個DNA 片段連接起來，恢復被限制酶切開 的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
注意：不是連接氫鍵! ( 氫鍵的形成不需要酶的催化)
2.種類：
兩DNA 片段要具有互補的黏性末端才能拼起來
A T A
C T T A A
二、DNA連接酶 —“分子縫合針”
3 、E·coli DNA連接酶連接黏性末端
C
G
X
思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎 為什么
二、DNA連接酶 —“分子縫合針”
4 、T4 DNA連接酶連接平末端
o-c
G
C
g
c
DNA DNA DNA DNA DNA
A 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶
A T
T
DNA連接酶
DNA聚合酶
相同點 作用實質 都能催化形成磷酸二酯鍵 化學本質 都是蛋白質 不 同 點 模板 不需要
需要DNA的一條鏈作模板
作用對象 在兩個DNA片段之間 形成磷酸二酯鍵
只能將單個核苷酸連接到已有的 DNA片段上，形成磷酸二酯鍵
作用結果 形成完整的重組DNA分子
形成DNA的一條鏈
用途 基因工程
DNA復制
二、DNA連接酶 —“分子縫合針”
5.DNA連接酶與DNA聚合酶的比較
如圖為DNA分子在不同酶的作用下所發生的變化，
圖中依次表示限制性內切酶、DNA聚合酶、DNA連 接酶、解旋酶作用的正確順序是 ( C )
① → ②
④ < A.①②③④
B.①②④③
C.①④②③
D.①④③②
習題鞏固
1.作用：將外源基因送入受體細胞，在受體細胞內對目的基因進行大量復制。
2.種類：質粒(最常用)、噬菌體、動植物病毒
來源不同，在大小、結構、復制方式以及可以
插入外源DNA 片段的大小也有很大差別。
質粒： 一 中裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞
擬核DNA 之外，并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA 分子。
三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”
便于重組DNA分子的篩選，如四環素抗性基因、
氨芐青霉素抗性基因、產物具有顏色反應的基因
(4 ) 無毒害作用，不影響受體細胞正常生命活動
在基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，
氨芐青霉素 抗性基因
都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。
3、運載體需具備的條件
( 1 ) 能在細胞中進行自我復制或整合到受體DNA
(2) 有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA
(3)常有特殊的標記基因
上，隨受體DNA 同步復制
片段(基因)插入
擬核DNA 質粒
三、基因進入受體細胞的載體— “分子運輸車”
目的基因 插入位點
復制原點
實例：重組DNA分子的模擬操作
...ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC...
...TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG...
...TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC...
...AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG...
…ATAGCATGCTATCCATGAATTCTCGGTATGAATTCGGCATAC...
…TATCGTACGATAGGTACTTAAGAGCCATACTTAAGCCGTATG...
...TCCTAG
...AGGATCTTAA
AATTCCATAC...
GGTATG ...
選擇酶切位點的原則：
1、選目的基因兩端和運載體都有的酶切位點；
2、所選酶切位點不能破壞目的基因以及標記基因
1.用圖中外源DNA 和質粒構建重組質粒，不能使用Sma I 切割，
原因是 Sma I會破壞抗性基因和外源DNA 中的目的基因 O
2.使用BamHI 和Hind Ⅲ兩種限制酶切割，而不用EcoR I 一 種限制酶切
割，是為了防且的基因、質粒自身環化及反向連接 o
抗生素
抗性基因
Sma H 質粒
圖1
EcoR I 目的基因
BamH I Sma I
圖2
下列操作中選用哪種限制酶切割來構建重組質粒 Hind III 和 BamH I
EcoR I
外源DNA
HindI
BamH I
HindII
—EcoR I
來源： 主要來源于原核生物
限制酶 特點： 具有專一性
作用部位：磷酸二酯鍵
結果： 形成黏性末端或平末端
作用： 把兩條雙鏈DNA 片段拼接起來
DNA連接酶 連接部位：磷酸二酯鍵
種類： E.coli DNA連接酶、T4 DNA連接酶
①能自我復制或能整合到宿主D NA 上
作為載體 ②有一個至多個限制酶切割位點
的條件 ③有特殊的標記基因
④對受體細胞無害
種類：質粒、噬菌體、動植物病毒
基因工程的基本工具
課堂小結
載體
人

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