資源簡(jiǎn)介

(共24張PPT)
第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程
動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體
本節(jié)主要解決的困惑
1.動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)
★ 2. 設(shè)計(jì)單克隆抗體制備的實(shí)驗(yàn)方案
比較項(xiàng)目 植物體細(xì)胞雜交技術(shù)
動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)
原理 細(xì)胞膜的流動(dòng)性 植物細(xì)胞的全能性
細(xì)胞膜的流動(dòng)性 細(xì)胞增殖
融合前處理 去除細(xì)胞壁
使細(xì)胞分散
誘導(dǎo)融合的 方法 物理(離心、振蕩、電 激)化學(xué)(PEG)
物理、化學(xué)方法(
PEG)、滅活的病毒
用途 雜種植株
制備單克隆抗體
意義 突破遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，打破生殖隔離
困惑點(diǎn)一：動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)
合作探究要求：
1.請(qǐng)對(duì)比植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)，嘗試比較兩者之間的異同點(diǎn)
2.先獨(dú)立思考，然后小組合作，派代表分享，時(shí)間2min。
技術(shù)
過程
方法
原理
應(yīng)用
滅活的病毒顆粒黏附于 細(xì)胞表面
病毒表面糖蛋白和細(xì)胞 膜上的糖蛋白發(fā)生作用
蛋白質(zhì)、脂質(zhì)分子重排， 細(xì)胞膜打開
細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞
為什么植物體細(xì)胞雜交技術(shù)不能用滅活的病毒作誘導(dǎo)劑
點(diǎn)撥提升1
1、 下列關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞融合的說法，錯(cuò)誤的是( D )
A.細(xì)胞融合前要用酶解法將組織分散成單個(gè)細(xì)胞
B.細(xì)胞融合的原理是細(xì)胞膜的流動(dòng)性
C.融合后得到的雜交細(xì)胞具有兩個(gè)或多個(gè)親本細(xì)胞的遺傳信息
D.融合后得到的雜交細(xì)胞具有兩個(gè)細(xì)胞核
學(xué)以致用1
2. (2018江蘇單科，22,3分)如圖為細(xì)胞融合的示意圖，下列敘述
正確的是(不定項(xiàng)) ( BC)
A. 若a細(xì)胞和b細(xì)胞是植物細(xì)胞，需先去分化再誘導(dǎo)融合 O )a
B.a細(xì)胞和b細(xì)胞之間的融合需要促融處理后才能實(shí)現(xiàn)
C.c細(xì)胞的形成與a、b細(xì)胞膜的流動(dòng)性都有關(guān)
D.c細(xì)胞將同時(shí)表達(dá)a細(xì)胞和b細(xì)胞中的所有基因
◎b
)c
學(xué)以致用1
1.閱讀以下資料，設(shè)計(jì)制備治療新冠的單克隆抗體實(shí)驗(yàn)方案，可用簡(jiǎn)單文字和 箭頭表示，完成后拍照上傳，小組長(zhǎng)上傳即可。
2. 請(qǐng)先獨(dú)立思考，然后小組合作交流，派代表展示成果，時(shí)間4min。
資料：人們發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物發(fā)生免疫反應(yīng)的過程中，體內(nèi)的B細(xì)胞可以產(chǎn)生多
達(dá)百萬種以上的特異性抗體，但是每個(gè)B細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異 性強(qiáng)的抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，即 克 隆 。
骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖。
困惑點(diǎn)二：設(shè)計(jì)制備單克隆抗體的方案
合作探究要求：
獲得產(chǎn)生抗新冠 病毒抗體的B淋 巴細(xì)胞
( 一 篩):利用 選擇培養(yǎng)基獲得
雜交瘤細(xì)胞
腹腔中有易于培 養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的
條件
7 篩選雜交細(xì)胞
人
8 克隆能產(chǎn)生抗體
的陽性細(xì)胞
10 再克隆
1 注射小鼠陽性細(xì)胞
BB 、B瘤 、瘤瘤
雜交細(xì)胞
(二篩):獲得能產(chǎn)生所 需專一抗體的雜交瘤細(xì)胞
單克隆抗體的制備過程
雜交瘤細(xì)胞
抗體檢驗(yàn) 9
11 體外培養(yǎng)
培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞 滅活新冠病毒
融合
B淋巴細(xì)胞
單克隆抗體 單克隆抗體
骨髓瘤細(xì)胞
免疫小鼠
單克隆抗體
未融合 B-B融 B-骨髓瘤 骨髓瘤-骨髓 未融合的骨
的 B細(xì) 胞 合細(xì)胞 融合細(xì)胞 瘤融合細(xì)胞 髓瘤細(xì)胞
用HAT選擇培養(yǎng)基 將其他類型細(xì)胞淘汰，只保留
進(jìn)行第一次篩選 B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞
多孔板進(jìn)行第二次篩選
性質(zhì)不穩(wěn)定，在培養(yǎng)過程中會(huì)有染色 體丟失現(xiàn)象，直到細(xì)胞呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)
為止。因此在建立雜交瘤細(xì)胞系過程
給小鼠注射特定抗原的目的是獲得能產(chǎn)生相應(yīng)抗體白 中要經(jīng)常檢查抗體效價(jià)。
骨髓瘤細(xì)胞
物理方法
化學(xué)方法
生物方法
知識(shí)拓展：HAT 培養(yǎng)基原理
多種B淋巴細(xì)胞
誘導(dǎo)原生 質(zhì)體融合
從小鼠腹
水中獲取
體內(nèi)培養(yǎng)。
不同類型的B細(xì)胞與骨髓瘤 細(xì)胞融合形成的融合細(xì)胞
只保留能產(chǎn)生特定抗體 的雜交瘤細(xì)胞
培養(yǎng)液 中獲取
體外培養(yǎng)
雜交瘤細(xì)胞是異源四倍體細(xì)胞，遺傳
能產(chǎn)生特定抗體 的雜交瘤細(xì)胞
圖23 .5 單克隆抗體
須 知
酶解分散
第一次篩選的內(nèi)容如下。
① 誘導(dǎo)融合后，融合體系中有多種細(xì)胞：B 細(xì) 胞 -B 細(xì)胞形成的融合細(xì)胞、〈 B 細(xì)胞一骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞一骨髓瘤細(xì)胞形成的融合細(xì) 胞。另外，還會(huì)有更多類型的三細(xì)胞融合細(xì)胞甚至四細(xì)胞融合細(xì)胞，這些細(xì)胞大 多不穩(wěn)定，很快會(huì)死掉。當(dāng)然，還有未融合的B 細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。
② 我們需要的只是B 細(xì)胞一骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞，此時(shí)可以通過 HAT 選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。 DNA 合成時(shí)所需的脫氧核苷酸有兩種來源：從頭合 成途徑和補(bǔ)救途徑。從頭合成途徑又稱D 途 徑 ，D 是 de～novo 的縮寫，指的 是細(xì)胞利用甘氨酸、甲酸、谷氨酰酸、天冬氨酸等合成嘌呤以及利用谷氨酰胺、 CO 、 天冬氨酸合成嘧啶。而補(bǔ)救途徑又稱S 途徑，S 是 salvage 的縮寫，即細(xì) 胞利用外源的或分解代謝產(chǎn)生的堿基和核苷重新合成核苷一磷酸，再形成核苷二 磷酸、核苷三磷酸的過程。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候就考慮到了篩選的穩(wěn)態(tài)，選用的骨 髓瘤細(xì)胞是一種代謝缺陷型的株系：只有D 途徑，沒有S 途徑。
③ HAT 培養(yǎng)基中的H 表示次黃嘌呤，A 表示氨基蝶呤(aminopterin),T 表 示胸腺嘧啶脫氧核苷，即在正常動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中添加有這三種物質(zhì)，其中氨基 蝶呤可以通過抑制D 途徑抑制DNA 的合成，抑制細(xì)胞分裂，是常用的抑癌藥物， 對(duì)應(yīng)的藥物稱為癌得寧。而次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷是S 途徑所需要的。
③ HAT 培養(yǎng)基中的H 表示次黃嘌呤， A 表示氨基蝶呤(aminopterin),T 表
示胸腺嘧啶脫氧核苷，即在正常動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中添加有這三種物質(zhì)，其中氨基< 蝶呤可以通過抑制D 途徑抑制DNA 的合成，抑制細(xì)胞分裂，是常用的抑癌藥物，
對(duì)應(yīng)的藥物稱為癌得寧。而次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷是S 途徑所需要的。
④ 在 HAT 選擇培養(yǎng)基上各細(xì)胞的生長(zhǎng)情況如下。
·B 細(xì)胞、B 細(xì)胞—B 細(xì)胞融合細(xì)胞：理論上可以生長(zhǎng)，但它們本身不能 增殖分化，因此無法生長(zhǎng)。
·B 細(xì)胞—骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞：具有S 途徑，又具有分裂能力，因此可 以分裂生長(zhǎng)。
●骨髓瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞—骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞：僅有的D 途徑被氨基 蝶呤抑制了，因此無法生長(zhǎng)。
第二次篩選的內(nèi)容如下。
① 小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，即B 細(xì)胞本身就是混雜的B 細(xì)胞， 因此，我們得到的雜交瘤細(xì)胞，有的能產(chǎn)生針對(duì)我們注射的特定抗原的抗體，有 的能產(chǎn)生針對(duì)其他抗原的抗體。我們需要進(jìn)行第二次篩選，用多孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)。
② 將第一次篩選得到的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行足夠的稀釋，稀釋至7個(gè)/mL 以下。
③將稀釋液分裝在96孔板或384孔板(見圖23.6)上，每個(gè)孔的體積為0.1mL;
圖23.6 96孔板和384孔板
④ 理論上講，每個(gè)孔中的細(xì)胞為0.7個(gè)，即每個(gè)孔要么沒有細(xì)胞，要么只 有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞。
⑤ 將這些多孔板進(jìn)行培養(yǎng)，獲得的細(xì)胞都是單個(gè)細(xì)胞的子細(xì)胞，即單克隆 培 養(yǎng) 。
⑥ 向生長(zhǎng)有細(xì)胞的孔中添加最初的抗原，如果該孔中的細(xì)胞能夠產(chǎn)生相應(yīng) 的抗體，則可以觀察到抗原—抗體聚集沉淀現(xiàn)象。
⑦ 經(jīng)多次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞群。
1.細(xì)胞合成DNA 通常有2條途徑：第1條途徑是利用糖和氨基酸合成核苷酸，
進(jìn)而合成DNA; 第2條途徑是通過HGPRT 利用核苷酸的前體合成核苷酸，進(jìn)
而合成DNA,HAT 培養(yǎng)基是基本培養(yǎng)基添加了次黃嘌呤(H) 、甲氨蝶呤(A)和 胸腺嘧啶核苷(T),A 可以阻斷DNA合成的第1條途徑，H和T則是第2條途徑中 合成核苷酸的原料。HAT 培養(yǎng)基可以用于單克隆抗體制備雜交瘤細(xì)胞的選擇， 小鼠骨髓瘤細(xì)胞是一類HGPRT 代謝缺陷型細(xì)胞。說法正確的是( )B
A.小鼠免疫B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后，培養(yǎng)基上會(huì)有3種類型的細(xì)胞
B.HAT培養(yǎng)基中未融合的骨髓瘤細(xì)胞在A的阻遏下因不能合成DNA而死亡 C.HAT培養(yǎng)基中未融合的免疫B細(xì)胞仍具有增殖能力而持續(xù)進(jìn)行細(xì)胞分裂 D.HAT培養(yǎng)基中選擇出的雜交瘤細(xì)胞都能無限增殖和產(chǎn)生所需抗體
學(xué)以致用2
能正常合成DNA, 無法生長(zhǎng)。下列敘述正確的是 ( C ) 免疫B 細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞
HGPRT+ HGPRT
細(xì)胞融合
A.骨髓瘤細(xì)胞和免疫B細(xì)胞可用仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)融合 HAT 培養(yǎng)波
B. 骨髓瘤細(xì)胞在HAT篩選培養(yǎng)液中能正常增殖 融合的細(xì)胞 培 死亡
C. 免疫B細(xì)胞的種類不唯一，所以雜交瘤細(xì)胞仍需進(jìn)一步篩選
D.篩選出的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)需添加抗生素防止真菌污染
養(yǎng)液中
在HAT
培養(yǎng)中死亡
體外長(zhǎng)期
2. (2019 ·江蘇卷)如圖為雜交瘤細(xì)胞制備示意圖。骨髓瘤細(xì)胞
由于缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT-), 在HAT篩選培養(yǎng)液中不
學(xué)以致用2
3. (2021泰安期中)為了解決雜交瘤細(xì)胞在傳代培養(yǎng)中出現(xiàn)來自B淋巴細(xì)胞染
色體丟失的問題，研究者在單克隆抗體的制備過程中增加了一個(gè)步驟，如下圖 所示。除了抗原刺激之外，用EBV (一種病毒顆粒)感染動(dòng)物B淋巴細(xì)胞，并使 之成為“染色體核型穩(wěn)定”的細(xì)胞株。這樣的細(xì)胞株能夠在HAT培養(yǎng)基中存活 ,但對(duì)烏本苷 (Oua) 敏感。下列相關(guān)分析不合理的是 D )
A.雜交瘤細(xì)胞染色體丟失可能導(dǎo)致抗體產(chǎn)生能力下降
B. 雜交瘤細(xì)胞還需要經(jīng)過克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)， 經(jīng)過多次篩選，才能獲得所需細(xì)胞
C. 骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)該無法在HAT選擇培養(yǎng)基中存活
D.雜交瘤細(xì)胞具有持續(xù)產(chǎn)生抗EBV抗體的能力
EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞 PEG 融合
HAT培養(yǎng)基+Oua篩選
學(xué)以致用2
雜交
瘤細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 死亡
抗原 刺激 動(dòng)物 B細(xì)胞
EBV 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 死亡
◎ EBV
骨髓瘤細(xì)胞
嵌合抗體：1984年，科學(xué)家將鼠抗體的可變區(qū)基因片段與人抗體的恒定區(qū)基因片段融
合，獲得了人一鼠嵌合抗體。嵌合抗體保留了小鼠抗體的可變區(qū)，既保留了其與抗原結(jié)合 的親和力和特異性，又降低了異源性，提高了使用的安全性。但嵌合抗體中仍存在鼠源性 成分，在人體內(nèi)仍有誘發(fā)HAMA 反應(yīng)的可能性，因此其不是我們的終極目標(biāo)。
人源化單克隆抗體：抗體的可變區(qū)又可分為高變區(qū)和骨架區(qū)，高變區(qū)即互補(bǔ)決定區(qū) compementrity detemining region,CDR),是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位；可變區(qū)除
高變區(qū)之外的其他部位稱為骨架區(qū)，主要起維持CDR 構(gòu)象的作用。如果我們進(jìn)一步把除
注射到病人體內(nèi)后，病人體內(nèi)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了針對(duì)這
些抗體的抗體(抗抗體，或稱為人抗鼠抗體， human
anti-mouse antibody,HAMA),迅速將這些單克隆抗體中 和掉了。
人源化單克隆抗體：抗體的可變區(qū)又可分為高變區(qū)和骨架區(qū)，高變區(qū)即互補(bǔ)決定區(qū)
(complementarity determining region,CDR), 是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位;可變區(qū)除
高變區(qū)之外的其他部位稱為骨架區(qū)，主要起維持CDR 構(gòu)象的作用。如果我們進(jìn)一步把除
CDR 之外的所有區(qū)域(包括骨架區(qū)和恒定區(qū))都進(jìn)行人源化(人源化程度最高可達(dá)97%), 就可以進(jìn)一步降低HAMA 的程度，提高其使用安全性和有效性。目前已經(jīng)廣泛使用的人 源化單克隆抗體有pembrolizumab 、nivolumab 、trastuzumab 、bevacizumab 等。前兩種的靶 標(biāo)是PD-1,PD-1 在 T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞表面均有表達(dá)。正常細(xì)胞表面 表達(dá)有PD-L1;PD-LI 與 PD-1 特異性結(jié)合，可以抑制免疫細(xì)胞的活化，防止免疫反應(yīng)過 強(qiáng)和自身免疫病的發(fā)生。在腫瘤細(xì)胞表面異常大量表達(dá)PD-L1, 極大降低了免疫應(yīng)答強(qiáng)度， 實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的目的。注射針對(duì)PD-1 的抗體，阻止了腫瘤細(xì)胞的PD-L1 與 免 疫 細(xì)胞的PD-1 的結(jié)合，也就阻止了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。后兩 種的靶標(biāo)都是生長(zhǎng)因子，通過與表皮細(xì)胞膜表面的受體或血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合， 阻止相應(yīng)的生長(zhǎng)因子與這些受體的結(jié)合，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的。
全人源化單克隆抗體：我們的終極目標(biāo)是沒有HAMA, 因此，只有與人的抗體序列完 全一致的全人源化抗體才是最好的。但是我們不能把抗原注射到一個(gè)人的體內(nèi)，然后取出 他的脾臟，利用胰蛋白酶處理，再誘導(dǎo)融合，最后篩選，獲得單克隆抗體。不過我們有其 他辦法，目前獲得全人源單克隆抗體的技術(shù)主要有噬菌體抗體庫技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、 轉(zhuǎn)基因小鼠制備技術(shù)等。噬菌體抗體庫技術(shù)就是將編碼人抗體的基因轉(zhuǎn)入絲狀噬菌體中并
表達(dá)呈現(xiàn)在噬菌體的表面。核 糖體展示技術(shù)就是利用核糖體、 mRNA、 抗體蛋白及其他蛋白質(zhì) 翻譯必要成分，在非細(xì)胞體系(in vitro) 中完成翻譯。轉(zhuǎn)基因小鼠 制備技術(shù)是全人源化抗體生產(chǎn)的 主要方式，向抗體基因缺失的小 鼠中轉(zhuǎn)入編碼人類抗體的基因，
使其表達(dá)人的抗體。
單克隆抗體的發(fā)展如圖23.7 所示。
另外，還有一種雙特異性 抗體，原理很簡(jiǎn)單，它是含有兩 種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗 體，能在靶細(xì)胞和功能分子(細(xì) 胞)之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo) 向性的免疫反應(yīng)，如圖23.8所示。
知識(shí)拓展
實(shí)線表示恒定區(qū)C, 虛線表示高變區(qū)。藍(lán)色表示鼠源 部分，紅色表示人源部分，比例僅示意，不代表真實(shí)情況。
圖23.7 單克隆抗體的發(fā)展
國(guó)238 雙特異性拉體
是( D )
A.雙抗可同時(shí)與2種抗原結(jié)合
B.利用雙抗可以將蛋白類藥物運(yùn)送至靶細(xì)胞
1.(2022 · 山東卷，15)如圖所示，將由2種不同的抗原分別制備的單克隆抗體分子，
在體外解偶聯(lián)后重新偶聯(lián)可制備雙特異性抗體，簡(jiǎn)稱雙抗。下列說法錯(cuò)誤的
C.篩選雙抗時(shí)需使用制備單克隆抗體時(shí)所使用的2種抗原
D.同時(shí)注射2種抗原可刺激B 細(xì)胞分化為產(chǎn)雙抗的漿細(xì)胞
學(xué)以致用3
抗體1 抗體2 抗體3
知識(shí)拓展——免疫偶聯(lián)物(ADC)
4.單克隆抗體的應(yīng)用
單克隆抗體可以作為診斷試劑，具有準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速的優(yōu)點(diǎn)，還可以用于治
療疾病和運(yùn)載藥物，如抗體藥物耦聯(lián)物(antibody-drug conjugates,ADC) 。ADC 又稱免疫
耦聯(lián)物，是通過一個(gè)接頭，將單克隆抗體與小分子藥物連接，形成的復(fù)合物，這種復(fù)合物 克服了單克隆抗體的靶向性強(qiáng)但藥效較弱、小分子藥物藥效很強(qiáng)但靶向性低的缺陷，真正
實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)醫(yī)療。
根據(jù)所結(jié)合的小分子藥物類型的不同， ADC 可以分為以下三大類。
(1)化學(xué)免疫耦聯(lián)物：由單克隆抗體和治療藥物(如博安霉素、柔紅霉素等)相連接。
(2)免疫毒素耦聯(lián)物：由單克隆抗體和毒素蛋白(如白喉毒素等)共價(jià)耦聯(lián)而成。
(3)放射性免疫耦聯(lián)物：由單克隆抗體與放射性物質(zhì)(如釔等)相耦聯(lián)。
植物細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較如表23.2所示。
2.抗體—藥物偶聯(lián)物(ADC) 通過將細(xì)胞毒素與單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)
胞的選擇性殺傷，過程如圖所示。下列表述正確的是( C )
A.ADC可通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入腫瘤細(xì)胞 抗 體 、 ADC被細(xì)胞吞噬 ⑤
B.抗體進(jìn)入細(xì)胞后激活溶酶體酶，導(dǎo) 頭 ① ③
致細(xì)胞凋亡 釋放藥物 細(xì)胞凋亡
溶酶體裂解
C.單克隆抗體攜帶細(xì)胞毒素與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合
D.腫瘤細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程，所以不會(huì)產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)
②
ADC
物
接
藥
學(xué)以致用4
CAR-T技術(shù)將上述兩個(gè)過程整合為一個(gè)。CAR 是一個(gè)跨膜蛋白，之所以稱為嵌合抗
原受體，是因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)來源于不同蛋白質(zhì)的組合，結(jié)構(gòu)上分為胞外段、跨膜區(qū)段和胞內(nèi) 區(qū) 段 三 部 分 。
(1)胞外段包括兩部分：一是用于引導(dǎo)CAR 進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成跨膜蛋白的信號(hào)肽；二是 由單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)改造的單鏈肽，它負(fù)責(zé)與腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原結(jié)合。
(2)跨膜區(qū)段來源于CD28受體的跨膜區(qū)段。
(3)胞內(nèi)段整合了多個(gè)T 細(xì)胞激活信號(hào)的胞內(nèi)段，除了CD28的胞內(nèi)段外，還有TCR 結(jié)合蛋白的Zeta 胞內(nèi)段(含有三個(gè)免疫受體酪氨酸激活結(jié)構(gòu)域(ITAM),一旦抗原與CAR 結(jié)合，ITAM可迅速磷酸化，傳遞信號(hào))、4-1BB受體(又稱為CD137受體，是腫瘤壞死因 子受體超家族的成員，介導(dǎo)的共刺激信號(hào)可增強(qiáng)T 細(xì)胞的功能)的胞內(nèi)段等，這些胞內(nèi)段 共同作用，提高T 細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)的殺傷。
顯然，CAR-T技術(shù)成功的前提是找到腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原。如目前最成功的 CAR-T 療法是與B 細(xì)胞病變有關(guān)的白血病療法，包括急性B 細(xì)胞白血病和B 細(xì)胞淋巴瘤 等，這是因?yàn)闊o論是正常B 細(xì)胞還是白血病或淋巴瘤B 細(xì)胞，在其細(xì)胞表面都穩(wěn)定地表達(dá) 有 CD19 抗原，針對(duì)CDI9 抗原的CAR-T 技術(shù)，雖然在殺死癌變的B 細(xì)胞的同時(shí)，也殺死 了 正 常 的B 細(xì) 胞 ， 但 可 以 通 過 定 期 注 射 免 疫 球 蛋 白 的 方 式 來 彌 補(bǔ) 。
5.CAR-T 技 術(shù)
2021年9月， 一 則題為“‘頂級(jí)奢侈品'— — 120萬 一針，2個(gè)月癌細(xì)胞‘清零’ 中國(guó)首例患者出院”的新聞在網(wǎng)上發(fā)布，隨之而來， CAR-T 療法也引起了人們的廣泛關(guān) 注 。CAR-T 療法，全稱是chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy, 意思是嵌合抗原 受 體 —T 細(xì)胞免疫療法。其基本原理是在體外對(duì)患者自身的T 細(xì)胞進(jìn)行改造，使它能識(shí)別 自身的癌細(xì)胞，大量培養(yǎng)這些改造的T 細(xì)胞，將其輸回患者體內(nèi)，用于特異性清除體內(nèi)的 癌細(xì)胞，如圖23.9所示。
眾所周知， T 細(xì)胞有多種類型。例如，細(xì)胞毒性T 細(xì) 胞(cytotoxic T cell) 表 面 含 有 CD8, 能識(shí)別諸如被病原體感染的體細(xì)胞或癌細(xì)胞表面的特異性抗原并誘導(dǎo)這些靶細(xì)胞裂 解死亡；輔助性T 細(xì) 胞(helper T cell)表面含有CD4, 能分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)其他淋巴 細(xì)胞(如致敏B 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞等)的增殖分化；調(diào)節(jié)性/抑制性T 細(xì) 胞(regulatory/ suppressor T cell)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答強(qiáng)度，避免自身免疫反應(yīng)和過敏反應(yīng)；記憶T 細(xì) 胞 (memory T cell)參與二次免疫。
(a)T 細(xì)胞激活的 (b)CAR-T 細(xì)胞與 (c)CAR 蛋白結(jié)構(gòu)示意
圖23.9 CAR-T技術(shù)
正常情況下， T 細(xì)胞不能識(shí)別抗原，需要兩個(gè)激活信號(hào)激活后才能識(shí)別抗原，稱為雙 信號(hào)系統(tǒng)。首先，樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞將處理好的抗原肽以抗原—MHC 復(fù)合物的 形式呈遞在細(xì)胞表面并被T 細(xì)胞表面的T 細(xì)胞受體(TCR) 結(jié)合，這是激活T 細(xì)胞的第一個(gè) 信號(hào)。其次，樹突狀細(xì)胞表面的B7 蛋白與T 細(xì)胞表面的CD28 受體結(jié)合，產(chǎn)生共刺激信號(hào)， 這是激活T 細(xì)胞的第二個(gè)信號(hào)。
[ 信 號(hào) 肽 - 跑外段連按肽段-
L 區(qū)一
間隔肽段一
CD28— 4-1BB—
Zeta —
樹突狀細(xì)胞
抗 原 -MHC復(fù)合物
T細(xì)胞受體←
T細(xì)胞
知識(shí)拓展——CAR-T技術(shù)
兩個(gè)主要信號(hào)通路 腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合
細(xì)胞外 細(xì)胞填
細(xì)胞內(nèi)
2B
→CD28
ITAM
(3)CAR-T細(xì)胞免疫療法是指將嵌合抗原受體(CAR) 導(dǎo)入細(xì)胞毒性T細(xì)胞中，從而產(chǎn)生特異性識(shí)別腫瘤的T細(xì)胞。研究人員嘗試用CAR-T 免疫
療法治療某種B 細(xì)胞淋巴瘤 (MCL), 從而實(shí)現(xiàn)靶向治療，其中的原理是 。
細(xì)胞毒性T細(xì)胞表面的抗原受體(CAR) 與B細(xì)胞淋巴瘤(MCL) 細(xì)胞表面的抗原
特異性結(jié)合
CAR 能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的特定抗原
3)嵌臺(tái)抗原受體工細(xì)胞療法(CAR.T) 的基本原理是通過基因工程技術(shù)，將患者的工淋巴細(xì)胞分離出來，并在體外進(jìn)行基因改造，使其表面表
達(dá)嵌合抗原受體(CAR)。 這種CAR 能引導(dǎo)工細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)攻擊，原理是 。
學(xué)以致用5
(不定項(xiàng)) CD19是一種抗原，廣泛表達(dá)于B細(xì)胞系時(shí)細(xì)胞膜上，包括屬要的B細(xì) 胞。CD19 與B淋已細(xì)胞的增殖、分化、活化以及抗體的產(chǎn)生有關(guān)，也是診浙B 細(xì) 胞系腫瘤的重要統(tǒng)志物。CARI 療法是對(duì)B細(xì)胞系腫瘤的一種免疫療法，其操作 是從患者血液提取T細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行基因改造，使其表面產(chǎn)生能夠識(shí)別CD19 的 讓嵌抗原受體(CAR), 將改造后的T 細(xì)胞大量擴(kuò)增后輸回患者體內(nèi)可以清除瘟細(xì) 胞。下列說法正確的是( BCD
A.CD19基因突變患者存在嚴(yán)重的體液免疫和細(xì)胞免缺陷
B.CAR-T療法可能會(huì)使患者出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴的不良反應(yīng)
C, 輸回患者體內(nèi)的CAR-T 細(xì)胞一般不會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)
D, 腫瘤細(xì)胞的CD19表達(dá)量減少會(huì)導(dǎo)致CAR-T療法的治療效果降低
學(xué)以致用5
(B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞)
(選雜交瘤細(xì)胞、選產(chǎn)生特定抗 體的雜交瘤細(xì)胞)
(骨髓瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、產(chǎn)生特 定抗體的雜交瘤細(xì)胞)
滅活病毒
一個(gè)新優(yōu)勢(shì)- - 特異性強(qiáng)、靈敏度高、大量制備
單克隆抗體
一種誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法-—
一種新細(xì)胞- - 雜交瘤細(xì)胞
單克隆抗體制備過程的“123”
1次融合
2次篩選
3次培養(yǎng)
點(diǎn)撥提升2
三個(gè)“新”
2.治療疾病和運(yùn)載藥物
如：?jiǎn)慰寺】贵w+藥物=“生
物導(dǎo)彈”可用于治療癌癥
與生活的聯(lián)系
抗人絨毛促性腺激素 單克隆抗體
1.診斷試劑
艾滋病檢測(cè)試劑
乙肝測(cè)定試劑
線一定要顯色，若該線顯色，則表明待測(cè)樣品從樣品墊順利到達(dá)吸水墊。若使用該試紙檢
測(cè)時(shí)結(jié)果表明妊娠，則圖中 ( 填“C”或“T” 或“C 和T”) 線顯色，且發(fā)生了 種抗原 — 抗體雜交。
(2)試紙中用到的抗體一 般采用單克隆抗體技術(shù)制備，如抗鼠IgG 抗體的制備過程為：先將 注入到小鼠體內(nèi)，從小鼠的 _ 中獲取B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，并
篩選出雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)行_ ,即可獲得產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。
【答案】(1) c C和T 3
(2) 鼠IgG 脾 克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)
注：膠體金：可與蛋白質(zhì)牢固結(jié)合， 大量聚集時(shí)肉眼可見紅色
樣品墊：滴加樣品的位置
結(jié)合墊：含有可移動(dòng)的膠體金標(biāo)記的 HCG抗體1、膠體金標(biāo)記的鼠IgG
T線：固定了HCG抗體2
C線：固定了抗鼠IgG抗體
(填 “C” 或 “T” 或 “C 和T”)
3. 目前市售的“早早孕試紙”是通過孕婦妊娠早期尿液檢驗(yàn)HCG (人絨毛膜促性腺激素) 其原理如下圖：
待測(cè)樣品
4」
樣品墊 結(jié)合墊 T線 C線吸水墊
▲ HCG
● 膠體金
YHCG 抗體1 丫 鼠IgG
丫 抗 鼠IgG抗體
HCG 抗體2
(1)若“早早孕試紙”產(chǎn)品質(zhì)量合格，使用時(shí)
獲取已免疫的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)
胞→融合、篩選→雜交瘤細(xì)胞→動(dòng)物
細(xì)胞培養(yǎng)→提取單克隆抗體
診斷試劑、治療疾病
動(dòng)物細(xì)胞 融合技術(shù)
單克隆抗體
細(xì)胞膜的流動(dòng)性
物理法、化學(xué)法、生物法
【整體建構(gòu)】
制備
應(yīng)用
原理
方法

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