資源簡介

(共23張PPT)
微生物的選擇培養與計數
課題背景
自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合菌群中不是優勢種群時，更難實現。
稀釋涂布平板法呈現的雜菌群
那么我們又如何達成這一目標呢？
科學家們應用選擇性培養基解決了這一難題。
1. 科學實例：尋找耐高溫的DNA聚合酶
啟示：尋找目的菌種時要根據它對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。
篩選原因：因為熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數微生物，使耐熱的Taq細菌保留下來。
PCR是一種在體外DNA復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。
1966年，布魯克在美國黃石國家公園的一個熱泉中發現了耐熱的Taq細菌，并分離到耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）。
（一）選擇培養基
耐高溫的酶
耐高溫生物體
高溫環境（熱泉、火山口）
尋找
尋找
培養基中加氨芐青霉素
具有氨芐青霉素抗性的菌落
沒有氨芐青霉素抗性的細菌
培養基應有菌落
沒有氨芐青霉素抗性的細菌被淘汰
怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細菌
舉例
2.實驗室中微生物的篩選原理：
人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。
（一）選擇培養基
允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的
培養基，叫做選擇培養基。
不加有機碳源
不加氮源
3.選擇培養基舉例
自養微生物
酵母菌和霉菌(青霉素能殺死細菌、放線菌)
固氮微生物
加入青霉素
加高濃度食鹽
金黃色葡萄球菌
石油是唯一碳源
（一）選擇培養基
能消除石油污染的微生物
思考-討論
選擇培養基配方的設計
尿素的立體結構
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質穩定，是現代農業生產中一種重要的氮肥。尿素被土壤中某些細菌分解成NH3,再被轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。
這些細菌之所以能分解尿素，是因為能合成脲酶，來催化尿素分解。
討論：
1.你如何設計培養基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來？
2.該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？
培養基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生長發育繁殖，所以用此培養基就能夠選擇出分解尿素的微生物。
見P18頁培養基配方
1.從物理性質來講，兩者屬于_____培養基，
判斷依據是_________________________________；
該類培養基的主要用途為_____________________；
2.從用途上來講，培養基二屬于______培養基，
目的是為了獲得_____________________；
3.兩種培養基共有的培養基成分有：________________________；
培養基一的碳源為________，氮源為________；
培養基二的碳源為________，氮源為________。
培養基一 牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
瓊脂 20.0g
蒸餾水 定容到1000ml
培養基二 KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 定容到1000ml
固體
添加了凝固劑瓊脂，且比例為1.5%~2%
分離、鑒定、計數
選擇
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、無機鹽、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
討論：
稀釋涂布平板法
1.原理：將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。
稀釋度足夠高時，能在培養基表面形成單個菌落。
（二）微生物的選擇培養
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細菌，還需對土壤菌液進行稀釋及科學的微生物數量測定方法---稀釋涂布平板法。
6支試管，分別加入9ml無菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
2.樣品梯度稀釋：
微量 移液器
稀釋10倍菌液
101
土壤10g
②在火焰旁稱取土壤10g，加入90ml無菌水中，搖勻，制成稀釋10倍的土壤菌液。
分別取1ml上清液，加入盛有9ml無菌水的試管中，制成不同稀釋倍數的菌液。
取6支試管，分別加入9ml無菌水。
灼
⑤將涂布器在火焰上灼燒，待酒精燃盡后，涂布器冷卻后，再進行涂布。
涂
⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。
各梯度分別涂布3個平板
1個不涂布作空白對照
3.取樣涂布平板：
滴
③取0.1ml菌液（不超過 ），滴加到培養基表面
④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中
浸
放入37℃恒溫箱中培養1～2d
4.培養與觀察
稀釋103倍
稀釋104倍
稀釋105倍
空白對照
恒溫培養箱
（三）微生物的數量測定
稀釋涂布平板法除用于分離微生物外，也常用于統計樣品中活菌數。在稀釋度足夠高時，培養基上表面生長的一個單菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，可推測出樣品中大約有多少活菌。
1)原理：
2)計數原則：
一般選擇菌落數在30—300的平板上進行計數。
1.稀釋涂布平板法：
注意事項
①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30—300的平板上進行計數。
②為增強實驗說服力與準確性，設計實驗時，需要涂布至少三個平板作為重復組。（重復實驗，減少誤差）。
③統計的菌落往往比活菌的實際數目低。
④因此，統計結果一般用菌落數而不是活菌數表示。
⑤分析實驗結果時，要考慮重復組結果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。
因為當兩個或多個細胞連在一起時，繁殖后形成的還是一個菌落
實例分析：
甲同學做此實驗在稀釋倍數105獲得3個平板，菌落數分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數目？
3)計算：
每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數。
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107個
2.顯微鏡直接計數：
這種方法是利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。
每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數
注意：統計結果一般是活菌數和死菌數的總和。（“染色排除法”）
探究-實踐
(四）土壤中分解尿素的細菌的分離和計數
尿素的立體結構
提出問題
1.從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌
2.統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌
研究思路
土壤取樣
制備培養基
樣品稀釋與取樣涂布
微生物的培養與觀察
絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。
基礎知識
1.土壤取樣
1）取樣的位置：土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培養基。細菌適宜在酸堿度接近中性的 潮濕土壤中生長，絕大多數的細菌分布距地表3 8cm的土壤層。
2）取樣要求：先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。
取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。
2.制備培養基
制備以尿素為唯一氮源的選擇培養基。
3.樣品的稀釋
測土壤中細菌數量，一般選用1x104 、1x105 和1x106倍的稀釋液進行平板培養。
4.微生物的培養與觀察
30-370C溫度下培養1-2d，每隔24h統計一次菌落數。選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。
實驗設計
圖中的1、2、3平板是選擇培養基，4平板為牛肉膏蛋白胨培養基，以判斷選擇培養基是否具有篩選作用；另外，還要有兩個對照，即不接種的選擇培養基和牛肉膏蛋白胨培養基，以驗證培養基中是否含有雜菌。
4.微生物的培養與觀察
操作提示
2）無菌操作
3）做好標記
本實驗使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前要做好標記
4）制定計劃
對于耗時較長的生物實驗，要事先規劃時間，以便提高工作效率，在操作時更加有條不紊
1）不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。
a.取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。
b.應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入
錐形瓶中，塞好棉塞。
c.在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。
主要方法 平板劃線法 稀釋涂布平板法
純化原理 通過接種環在瓊脂固體培養基的表面_________操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。（不能計數） 將菌液進行一系列的_________,稀釋度足夠高時,聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞。（可計數）
連續劃線
梯度稀釋
主要步驟 _________操作
接種工具 _______
平板示 意圖
平板劃線
涂布器
(五）兩種接種方法的比較
梯度稀釋和涂布平板操作
接種環
課題小結
叮當！下課啦！

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