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微專題3　雙標記基因、影印接種、藍白斑顯色法與CRISPR/Cas9基因編輯技術
題型1　利用雙標記基因和影印接種技術篩選含有目的基因的受體細胞
大腸桿菌pBR322質粒含有標記基因：氨芐青霉素抗性基因(ampr)和四環素抗性基因(tetr)，外源DNA插在BamH Ⅰ位點處。將細菌涂布在含有氨芐青霉素(amp)的固體平板上進行第一輪篩選，未轉化的則不能生長，轉化成功的能長出菌落。上述轉化成功的受體細胞有兩種類型，即含重組質粒的細胞和含空載質粒的細胞。為了進一步區分這兩類受體細胞，需要采用圖示的方法進行第二輪篩選，由于外源DNA片段在BamH Ⅰ位點的重組導致質粒的tetr基因失活，含重組質粒的受體細胞呈amprtets表型(上標“r”代表抗性，“s”代表敏感)；而含空載質粒的受體細胞則為amprtetr表型。因此，含重組質粒的受體細胞只能在amp平板上生長，含空載質粒的受體細胞可出現在同時含amp和tet的平板上。
例1 某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到ampr或tetr中會導致相應的基因失活(ampr表示氨芐青霉素抗性基因，tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌， 之后受體細胞的類型(對兩種抗生素表現出抗性r或敏感性s)不包含(　　)
A.ampr、tetr B.ampr、tets
C.amps、tetr D.amps、tets
例2 某質粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三種限制性內切核酸酶切割位點，同時還含有四環素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。利用此質粒獲得轉基因抗鹽煙草的過程，如下圖所示。請回答下列問題：
(1)將目的基因導入植物細胞，采用最多的方法是農桿菌轉化法。其中用到的質粒是__________；該質粒含有一段特殊的DNA片段，稱為____________。該方法中農桿菌的作用是_______________________________________________
_______________________________________________________________。
(2)在構建重組質粒時，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質粒相比，選用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ兩種酶的好處是_________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)含有目的基因的農桿菌可根據標記基因進行篩選。若農桿菌在含有氨芐青霉素和四環素的培養基上都可以生長繁殖，農桿菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。為什么？__________________________________。
(4)將已經轉化的農桿菌進行如下操作，篩選出符合要求的農桿菌。先把轉化的農桿菌接種到A培養基中培養，長出菌落后，用無菌牙簽挑取A上的單個菌落，分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環素和氨芐青霉素)兩個培養基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請在圖中相應的位置上圈出來。
題型2　利用藍白斑顯色法篩選含有目的基因的受體細胞
很多大腸桿菌的質粒上含有LacZ標記基因，其表達的β－半乳糖苷酶可將一種無色的化合物(X－gal)分解成藍色物質，使菌落呈現藍色。重組DNA技術常用的大腸桿菌質粒pUC18同時攜帶ampr和LacZ兩個標記基因，外源DNA插在LacZ標記基因內部的任何限制酶切割位點處。將細菌涂布在同時含有amp和X－gal的固體培養基上，在長出來的菌落中，藍色菌落的為含空載質粒的受體細胞，白色菌落的為含重組質粒的受體細胞。
例3 (2024·衢州質檢)非洲豬瘟病毒可對養豬業構成嚴重威脅，該病毒是一種雙鏈DNA病毒，可編碼多種蛋白質。非洲豬瘟病毒表面的主要結構蛋白p22蛋白，可以誘導豬產生抗體。工業上可利用轉基因技術生產p22蛋白疫苗，并制備相應的單克隆抗體。請回答下列有關問題：
(1)p22蛋白疫苗的制備和鑒定，與p22蛋白基因及質粒有關的限制酶酶切位點如下圖所示，已知不同種限制酶切割出的黏性末端不同。
(LacZ基因能表達出β－半乳糖苷酶，使無色的半乳糖苷分解，進而使菌落呈現藍色)
①根據p22蛋白基因的序列設計一對引物，通過________技術擴增特定的DNA以獲取目的基因；②構建重組DNA，利用________________限制酶(寫出酶的名稱)分別切割目的基因和質粒，以減少連接產物的種類并避免目的基因與質粒反向連接；③用重組質粒轉化感受態細胞，并將受體細胞涂布在含氨芐青霉素的LB固體平板上，在37 ℃恒溫培養箱培養12 h，挑取________的單菌落，將其轉移至液體培養基擴大培養，一段時間后離心收集細胞，超聲破碎后離心取上清液制備樣品，利用________的方法對p22蛋白進行鑒定。
(2)抗p22蛋白的單克隆抗體制備及鑒定，p22蛋白可作為________對小鼠進行多次注射后，分離出小鼠脾細胞，利用________的仙臺病毒促進該細胞與體外培養的骨髓瘤細胞融合；融合細胞經過多次篩選后得到的雜交瘤細胞具有的特點是____________________________________________________________；
將選出的雜交瘤細胞接種至小鼠腹腔，待小鼠腹部膨脹明顯，采集________，分離提取出單克隆抗體。
題型3　基因魔剪——CRISPR/Cas9基因編輯技術
例4 近年誕生的具有劃時代意義的CRISPR/Cas9基因編輯技術可簡單、準確地進行基因定點編輯。其原理是由一條單鏈向導RNA引導內切核酸酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割。通過設計向導RNA中20個堿基的識別序列，可人為選擇DNA上的目標位點進行切割(見下圖)。下列相關敘述錯誤的是(　　)
A.Cas9蛋白由相應基因指導在核糖體中合成，作用是破壞磷酸二酯鍵
B.向導RNA與基因形成的雙鏈區也要遵循堿基互補配對原則
C.向導RNA可以在逆轉錄酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸
D.若α鏈剪切點附近序列為5′－TCCACAATC－3′，則相應的識別序列為5′－UCCACAAUC－3′
例5 基因編輯技術是指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。新一代基因編輯技術CRISPR/Cas9有“基因魔剪”的美稱，它的實質是用特殊的引導序列sgRNA將“基因剪刀——Cas9酶”精準定位到所需修飾的基因上然后進行編輯。2018年11月，一對名為露露和娜娜的基因編輯嬰兒的誕生引發了國內外巨大的爭議。
(1)有些細胞中沒有編碼Cas9酶的基因，可利用基因工程的方法構建____________，通過________等載體導入細胞。CRISPR/Cas9中sgRNA分子的序列與基因組DNA中特定堿基序列通過________可以彼此結合在一起，而Cas9酶是一種____________酶，可催化______鍵水解，實現對DNA序列的定向切割。
(2)露露和娜娜被編輯的基因是CCR5基因，為驗證胚胎的CCR5基因是否成功被編輯，需要在胚胎發育早期，將細胞的微量全基因組DNA用________技術進行擴增，然后采用________技術檢測目的基因以及轉錄出的mRNA是否存在，還需要對________蛋白進行檢測。
微專題3　雙標記基因、影印接種、藍白斑顯色法
與CRISPR/Cas9基因編輯技術
例1　C　[含有質粒載體的大腸桿菌中，有兩種抗性，即ampr、tetr ，A不符合題意；含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌，有氨芐青霉素抗性，但沒有四環素抗性，即ampr、tets，B不符合題意；不存在有四環素抗性、氨芐青霉素敏感性的類型，C符合題意；含有環狀目的基因的大腸桿菌，沒有抗性，即amps、tets，D不符合題意。]
例2　(1)Ti質粒　T DNA　感染煙草細胞，把目的基因插入到煙草細胞的染色體DNA上
(2)防止目的基因和質粒自身環化，防止目的基因與質粒反向連接
(3)否　含有目的基因的質粒中四環素抗性基因被破壞
(4)
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例3　(1)PCR　HindⅢ和BamH Ⅰ　白色　抗原－抗體雜交
(2)抗原　滅活　能無限增殖且產生大量特異性抗體　腹水
解析　(1)PCR技術是體外擴增DNA的技術，可以得到大量的DNA；結合圖示可知，利用HindⅢ和BamH Ⅰ對質粒和目的基因進行切割，可以防止質粒及目的基因自身環化以及質粒與目的基因反向連接。重組質粒上含有氨芐青霉素抗性基因，在含氨芐青霉素的LB固體平板上含重組質粒的菌株和含普通質粒的菌株都可以生長，由于重組質粒的LacZ基因被破壞，菌落呈白色，因此在含氨芐青霉素的LB固體平板上挑選白色菌落即為含重組質粒的目的菌株；抗原－抗體雜交可以對p22蛋白進行鑒定，即若p22蛋白基因成功表達，則抗原－抗體雜交呈陽性。(2)要制備抗p22蛋白的單克隆抗體，可將p22蛋白作為抗原，滅活的仙臺病毒可以促進動物細胞的融合；多次篩選得到的雜交瘤細胞，既能無限增殖，又能產生大量特異性抗體；小鼠腹腔可以對雜交瘤細胞進行體內克隆，待小鼠腹部膨脹明顯，采集腹水，分離提取出單克隆抗體。
例4　C　[核糖體是蛋白質合成的場所，因此Cas9蛋白由相應基因指導在核糖體中合成，作用是破壞磷酸二酯鍵，A正確；向導RNA與基因形成的雙鏈區堿基對之間遵循堿基互補配對原則，B正確；向導RNA通過轉錄形成，需要RNA聚合酶的催化，而逆轉錄酶催化以RNA為模板合成DNA的過程，C錯誤；由于目標DNA中的α鏈可與向導RNA中的識別序列的互補鏈進行堿基互補配對，因此若α鏈剪切點附近序列為5′－TCCACAATC－3′，則相應的識別序列為5′－UCCACAAUC－3′，D正確。]
例5　(1)重組DNA分子　質粒、動植物病毒及噬菌體　堿基互補配對　限制(限制性內切核酸)　磷酸二酯
(2)PCR　核酸分子雜交　CCR5
解析　(1)基因工程步驟的核心是構建重組DNA分子。載體有質粒、動植物病毒及噬菌體等。CRISPR/Cas9中sgRNA分子的序列與基因組DNA中特定堿基序列通過堿基互補配對可以彼此結合在一起。Cas9酶是一種限制酶(限制性內切核酸酶)，作用部位為磷酸二酯鍵。(2)將細胞的微量全基因組DNA用PCR技術進行擴增，以增加CCR5基因的數量。檢測目的基因以及轉錄出的mRNA是否存在采用核酸分子雜交技術。實驗的目的是為了驗證胚胎的CCR5基因是否成功被編輯，因此還需要對CCR5蛋白進行檢測。(共21張PPT)
微專題3
雙標記基因、影印接種、藍白斑顯色法與CRISPR/Cas9基因編輯技術
題型1　利用雙標記基因和影印接種技術篩選含有目的基因的受體細胞
大腸桿菌pBR322質粒含有標記基因：氨芐青霉素抗性基因(ampr)和四環素抗性基因(tetr)，外源DNA插在BamH Ⅰ位點處。將細菌涂布在含有氨芐青霉素(amp)的固體平板上進行第一輪篩選，未轉化的則不能生長，轉化成功的能長出菌落。上述轉化成功的受體細胞有兩種類型，即含重組質粒的細胞和含空載質粒的細胞。為了進一步區分這兩類受體細胞，需要采用圖示的方法進行第二輪篩選，由于外源DNA片段在BamH Ⅰ位點的重組導致質粒的tetr基因失活，含重組質粒的受體細胞呈amprtets表型(上標“r”代表抗性，“s”代表敏感)；而含空載質粒的受體細胞則為amprtetr表型。因此，含重組質粒的受體細胞只能在amp平板上生長，含空載質粒的受體細胞可出現在同時含amp和tet的平板上。
例1 某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到ampr或tetr中會導致相應的基因失活(ampr表示氨芐青霉素抗性基因，tetr表示四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamH Ⅰ酶切后，與用BamH Ⅰ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌， 之后受體細胞的類型(對兩種抗生素表現出抗性r或敏感性s)不包含(　　)
C
A.ampr、tetr B.ampr、tets
C.amps、tetr D.amps、tets
解析：含有質粒載體的大腸桿菌中，有兩種抗性，即ampr、tetr ，A不符合題意；
含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌，有氨芐青霉素抗性，但沒有四環素抗性，即ampr、tets，B不符合題意；
不存在有四環素抗性、氨芐青霉素敏感性的類型，C符合題意；
含有環狀目的基因的大腸桿菌，沒有抗性，即amps、tets，D不符合題意。
A.ampr、tetr B.ampr、tets
C.amps、tetr D.amps、tets
例2 某質粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三種限制性內切核酸酶切割位點，同時還含有四環素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。利用此質粒獲得轉基因抗鹽煙草的過程，如下圖所示。請回答下列問題：
(1)將目的基因導入植物細胞，采用最多的方法是農桿菌轉化法。其中用到的質粒是　　　　?。辉撡|粒含有一段特殊的DNA片段，稱為　　　　　　。該方法中農桿菌的作用是________________________________________________
________________________________________________________________。
Ti質粒
T- DNA
感染煙草細胞，把目的基因插入到煙草細胞的染色體DNA上
(2)在構建重組質粒時，和只用一種酶切割目的基因的兩端及質粒相比，選用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ兩種酶的好處是_______________________________________
_______________________________________________________________。
(3)含有目的基因的農桿菌可根據標記基因進行篩選。若農桿菌在含有氨芐青霉素和四環素的培養基上都可以生長繁殖，農桿菌中是否已含有目的基因？　(填“是”或“否”)。為什么？_________________________________________。
防止目的基因和質粒自身環化，防止目的
基因與質粒反向連接
否
含有目的基因的質粒中四環素抗性基因被破壞
(4)將已經轉化的農桿菌進行如下操作，篩選出符合要求的農桿菌。先把轉化的農桿菌接種到A培養基中培養，長出菌落后，用無菌牙簽挑取A上的單個菌落，分別接種到B(含氨芐青霉素)和C(含四環素和氨芐青霉素)兩個培養基的相同位置上，一段時間后，菌落的生長狀況如圖所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？請在圖中相應的位置上圈出來。
題型2　利用藍白斑顯色法篩選含有目的基因的受體細胞
很多大腸桿菌的質粒上含有LacZ標記基因，其表達的β－半乳糖苷酶可將一種無色的化合物(X－gal)分解成藍色物質，使菌落呈現藍色。重組DNA技術常用的大腸桿菌質粒pUC18同時攜帶ampr和LacZ兩個標記基因，外源DNA插在LacZ標記基因內部的任何限制酶切割位點處。將細菌涂布在同時含有amp和X－gal的固體培養基上，在長出來的菌落中，藍色菌落的為含空載質粒的受體細胞，白色菌落的為含重組質粒的受體細胞。
例3 (2024·衢州質檢)非洲豬瘟病毒可對養豬業構成嚴重威脅，該病毒是一種雙鏈DNA病毒，可編碼多種蛋白質。非洲豬瘟病毒表面的主要結構蛋白p22蛋白，可以誘導豬產生抗體。工業上可利用轉基因技術生產p22蛋白疫苗，并制備相應的單克隆抗體。請回答下列有關問題：
(1)p22蛋白疫苗的制備和鑒定，與p22蛋白基因及質粒有關的限制酶酶切位點如下圖所示，已知不同種限制酶切割出的黏性末端不同。
(LacZ基因能表達出β－半乳糖苷酶，使無色的半乳糖苷分解，進而使菌落呈現藍色)
①根據p22蛋白基因的序列設計一對引物，通過　　　　技術擴增特定的DNA以獲取目的基因；②構建重組DNA，利用　　　　　　　　限制酶(寫出酶的名稱)分別切割目的基因和質粒，以減少連接產物的種類并避免目的基因與質粒反向連接；③用重組質粒轉化感受態細胞，并將受體細胞涂布在含氨芐青霉素的LB固體平板上，在37 ℃恒溫培養箱培養12 h，挑取　　　　的單菌落，將其轉移至液體培養基擴大培養，一段時間后離心收集細胞，超聲破碎后離心取上清液制備樣品，利用　　　　　　　　　　的方法對p22蛋白進行鑒定。
PCR
HindⅢ和BamH Ⅰ
白色
抗原－抗體雜交
(2)抗p22蛋白的單克隆抗體制備及鑒定，p22蛋白可作為　　　　對小鼠進行多次注射后，分離出小鼠脾細胞，利用　　　　的仙臺病毒促進該細胞與體外培養的骨髓瘤細胞融合；融合細胞經過多次篩選后得到的雜交瘤細胞具有的特點是__________________________________________________________________；
將選出的雜交瘤細胞接種至小鼠腹腔，待小鼠腹部膨脹明顯，采集　　　　，分離提取出單克隆抗體。
抗原
滅活
能無限增殖且產生大量特異性抗體
腹水
解析：(1)PCR技術是體外擴增DNA的技術，可以得到大量的DNA；結合圖示可知，利用HindⅢ和BamH Ⅰ對質粒和目的基因進行切割，可以防止質粒及目的基因自身環化以及質粒與目的基因反向連接。重組質粒上含有氨芐青霉素抗性基因，在含氨芐青霉素的LB固體平板上含重組質粒的菌株和含普通質粒的菌株都可以生長，由于重組質粒的LacZ基因被破壞，菌落呈白色，因此在含氨芐青霉素的LB固體平板上挑選白色菌落即為含重組質粒的目的菌株；抗原－抗體雜交可以對p22蛋白進行鑒定，即若p22蛋白基因成功表達，則抗原－抗體雜交呈陽性。
(2)要制備抗p22蛋白的單克隆抗體，可將p22蛋白作為抗原，滅活的仙臺病毒可以促進動物細胞的融合；多次篩選得到的雜交瘤細胞，既能無限增殖，又能產生大量特異性抗體；小鼠腹腔可以對雜交瘤細胞進行體內克隆，待小鼠腹部膨脹明顯，采集腹水，分離提取出單克隆抗體。
題型3　基因魔剪——CRISPR/Cas9基因編輯技術
例4 近年誕生的具有劃時代意義的CRISPR/Cas9基因編輯技術可簡單、準確地進行基因定點編輯。其原理是由一條單鏈向導RNA引導內切核酸酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割。通過設計向導RNA中20個堿基的識別序列，可人為選擇DNA上的目標位點進行切割(見下圖)。下列相關敘述錯誤的是(　　)
C
A.Cas9蛋白由相應基因指導在核糖體中合成，
作用是破壞磷酸二酯鍵
B.向導RNA與基因形成的雙鏈區也要遵循堿
基互補配對原則
C.向導RNA可以在逆轉錄酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸
D.若α鏈剪切點附近序列為5′－TCCACAATC－3′，則相應的識別序列為
5′－UCCACAAUC－3′
解析：核糖體是蛋白質合成的場所，因此Cas9蛋白由相應基因指導在核糖體中合成，作用是破壞磷酸二酯鍵，A正確；
向導RNA與基因形成的雙鏈區堿基對之間遵循堿基互補配對原則，B正確；
向導RNA通過轉錄形成，需要RNA聚合酶的催化，而逆轉錄酶催化以RNA為模板合成DNA的過程，C錯誤；
由于目標DNA中的α鏈可與向導RNA中的識別序列的互補鏈進行堿基互補配對，因此若α鏈剪切點附近序列為5′－TCCACAATC－3′，則相應的識別序列為5′－UCCACAAUC－3′，D正確。
A.Cas9蛋白由相應基因指導在核糖體中合成，作用是破壞磷酸二酯鍵
B.向導RNA與基因形成的雙鏈區也要遵循堿基互補配對原則
C.向導RNA可以在逆轉錄酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸
D.若α鏈剪切點附近序列為5′－TCCACAATC－3′，則相應的識別序列為5′－UCCACAAUC－3′
例5 基因編輯技術是指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。新一代基因編輯技術CRISPR/Cas9有“基因魔剪”的美稱，它的實質是用特殊的引導序列sgRNA將“基因剪刀——Cas9酶”精準定位到所需修飾的基因上然后進行編輯。2018年11月，一對名為露露和娜娜的基因編輯嬰兒的誕生引發了國內外巨大的爭議。
(1)有些細胞中沒有編碼Cas9酶的基因，可利用基因工程的方法構建　　　　　　　　　　，通過　　　　　　　　　　　　　　　　等載體導入細胞。CRISPR/Cas9中sgRNA分子的序列與基因組DNA中特定堿基序列通過
　　　　　　可以彼此結合在一起，而Cas9酶是一種　　　　　　　　　酶，可催化　　　　　　　鍵水解，實現對DNA序列的定向切割。
重組DNA分子
質粒、動植物病毒及噬菌體
堿基互補配對
限制(限制性內切核酸)
磷酸二酯
(2)露露和娜娜被編輯的基因是CCR5基因，為驗證胚胎的CCR5基因是否成功被編輯，需要在胚胎發育早期，將細胞的微量全基因組DNA用　　　　技術進行擴增，然后采用　　　　　　技術檢測目的基因以及轉錄出的mRNA是否存在，還需要對　　　　蛋白進行檢測。
PCR
核酸分子雜交
CCR5
解析：(1)基因工程步驟的核心是構建重組DNA分子。載體有質粒、動植物病毒及噬菌體等。CRISPR/Cas9中sgRNA分子的序列與基因組DNA中特定堿基序列通過堿基互補配對可以彼此結合在一起。Cas9酶是一種限制酶(限制性內切核酸酶)，作用部位為磷酸二酯鍵。
(2)將細胞的微量全基因組DNA用PCR技術進行擴增，以增加CCR5基因的數量。檢測目的基因以及轉錄出的mRNA是否存在采用核酸分子雜交技術。實驗的目的是為了驗證胚胎的CCR5基因是否成功被編輯，因此還需要對CCR5蛋白進行檢測。專題特訓3　雙標記基因、影印接種、藍白斑顯色法與CRISPR/Cas9基因編輯技術
(時間：30分鐘分值：32分)
選擇題：第1～8題，每小題4分，共32分。
題型1　利用雙標記基因和影印接種技術篩選含有目的基因的受體細胞
1.如圖表示某種質粒，其中ori為復制必需的序列，ampr為氨芐青霉素抗性基因，tetr為四環素抗性基因，箭頭表示不同限制性內切核酸酶的酶切位點。為了便于篩選，目的基因合適的插入位點是(　　)
① ②
③ ①和③
2.圖1表示某重組質粒的構建過程，質粒P0具有四環素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)，并且含有限制性內切核酸酶EcoR Ⅴ的酶切位點。為篩選出含有重組質粒P1的菌落，采用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到甲、乙、丙三類菌落，三類菌落形態相同，其生長情況如圖2。下列敘述正確的是(　　)
甲類菌落可能同時導入了P0和P1質粒
乙類菌落擴大培養后可用于生產
丙類菌落可能導入了含反向連接目的基因的質粒
用玻璃刮刀將無抗生素平板上的菌落按位置接種到其他三個平板上
3.下圖是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，載體質粒具有四環素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。轉化大腸桿菌后，采用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到A、B、C、D四種菌落，其生長情況如下表(注：“＋”代表生長，“－”代表不生長)。根據表中結果判斷，含有重組質粒的菌落是(　　)
　　平板類型 菌落類型　　 無抗生素 氨芐青霉素 四環素 氨芐青霉素＋四環素
菌落A ＋ ＋ ＋ ＋
菌落B ＋ ＋ － －
菌落C ＋ － － －
菌落D ＋ － ＋ －
菌落A 菌落B
菌落C 菌落D
題型2　利用藍白斑顯色法篩選含有目的基因的受體細胞
4.大腸桿菌的質粒上含有LacZ基因，其編碼的產物β半乳糖苷酶在Xgal和IPTG同時存在時，可以產生藍色沉淀，使菌落呈現藍色，否則菌落呈現白色。如圖為利用該質粒進行的轉基因過程，請據圖判斷菌落①②③的顏色分別是(　　)
藍色　白色　白色 藍色　藍色　白色
藍色　白色　藍色 白色　藍色　白色
5.大腸桿菌pUC118質粒是基因工程中常用的一種載體，具有氨芐青霉素抗性基因，該質粒中某限制酶的唯一切點位于LacZ基因中。在特定的選擇培養基中，若LacZ基因沒有被破壞，則大腸桿菌菌落呈藍色；若LacZ基因被破壞，則菌落呈白色。關于圖中操作的說法正確的是(　　)
試管1中應加入限制酶處理
試管2中用Ca2＋處理，將重組載體導入不含LacZ基因的大腸桿菌中
若大腸桿菌的菌落為藍色，則質粒未導入大腸桿菌
培養基中除必需的營養物質外，還應加入適量卡那霉素
題型3　CRISPR/Cas9基因編輯技術
6.CRISPR/Cas9系統主要由向導RNA(SgRNA)和Cas9蛋白兩部分組成，SgRNA可引導Cas9蛋白到特定基因位點進行切割，其機制如圖所示。下列說法正確的是(　　)
SgRNA通過堿基互補配對原則識別目標DNA分子，Cas9蛋白的功能與DNA連接酶相似
若要利用CRISPR/Cas9技術將一個基因從目標DNA分子上去除，通常需設計兩個序列不同的SgRNA
CRISPR/Cas9技術編輯基因有時會因SgRNA錯誤結合而出現“脫靶”現象，一般SgRNA序列越短，脫靶率越低
向導RNA可以在逆轉錄酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸
7.2020年諾貝爾化學獎授予了兩位女科學家以表彰她們在基因編輯研究領域做出的卓越貢獻。這兩位科學家巧用CRISPR/Cas9基因剪刀，以極高的精度編輯了動物、植物和微生物的DNA，CRISPR/Cas9基因組編輯系統工作原理如圖所示，關于此技術的解釋錯誤的是(　　)
Cas9為一種能使磷酸二酯鍵斷裂的酶
DNARNA雜交區域不存在TA堿基對
在單鏈向導RNA中也存在堿基互補配對
人為改變向導RNA的序列可實現對特定基因的切割
8.CRISPR/Cas9是大腸桿菌等細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統，可用來對抗入侵的部分病毒(DNA)及外源DNA，其原理是由一條單鏈向導RNA引導核酸內切酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割。CRISPR/Cas9基因編輯技術是通過設計向導RNA中20個堿基的識別序列，可以對目標DNA上幾乎任何一個位置進行刪除或添加特定的DNA片段，如圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
識別序列形成雜交區的過程與轉錄過程的堿基配對方式相同
在被切割后的目標DNA中添加特定的DNA片段需要DNA連接酶
大腸桿菌等細菌細胞內能合成與入侵病毒(DNA)及外源DNA互補的RNA序列
Cas9能專一性破壞雙鏈DNA分子中堿基之間的氫鍵來切割DNA分子
專題特訓3　雙標記基因、影印接種、藍白斑顯色法與
CRISPR/Cas9基因編輯技術
1．B　[由題意可知，為了方便篩選，可以把目的基因插入到質粒的某個特殊基因中，因此排除③，又因為ori是復制的必需基因，因此排除①，可以選擇ampr和tetr作為插入基因的位置，B正確。]
2．A　[根據題圖分析可知，甲類菌落既具有氨芐青霉素抗性，又具有四環素抗性，其可能同時轉入了P0和P1質粒，也可能只轉入了P0質粒，A正確；乙類菌落不具有四環素抗性，但具有氨芐青霉素抗性，其可能轉入了P1質粒，但還需要進一步的鑒定，例如抗原－抗體雜交后，才能進行擴大培養用于生產，B錯誤；丙類菌落既不具有四環素抗性，也不具有氨芐青霉素抗性，說明其不含質粒，C錯誤；應該用接種環將菌落接種到其他平板上，D錯誤。]
3．B　[分析題圖可知：構建重組DNA分子時，目的基因插入的位置在四環素抗性基因(tetr)中間，破壞了四環素抗性基因(tetr)，氨芐青霉素抗性基因(ampr)沒有被破壞。因此含有重組質粒的菌落在添加了四環素的培養基中不能生長，而在添加氨芐青霉素的培養基中能生長，故選B。]
4．B
5．B　[試管1中應加入DNA連接酶處理，A錯誤；試管2中用Ca2＋處理，使大腸桿菌成為感受態細胞，這樣可將重組載體導入不含LacZ基因的大腸桿菌中，B正確；若大腸桿菌的菌落為藍色，則導入大腸桿菌的是普通質粒，C錯誤；由題干信息可知，標記基因是氨芐青霉素抗性基因，因此培養基中除必需的營養物質外，還應加入適量氨芐青霉素，D錯誤。]
6．B　[由圖可知，SgRNA可通過與特定基因位點的堿基互補配對，來引導Cas9蛋白到該位點進行切割，即SgRNA通過堿基互補配對原則識別目標DNA分子，而Cas9蛋白的功能與限制酶相似，A錯誤；CRISPR/Cas9技術編輯基因有時會因SgRNA錯誤結合而出現“脫靶”現象，SgRNA的序列越短，可識別的DNA上的特定堿基序列越短，越容易發生“脫靶”現象，即脫靶率越高，C錯誤；向導RNA是以DNA的一條鏈為模板通過轉錄形成的，可以在RNA聚合酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸，D錯誤。]
7．B　[分析題意可知，Cas9蛋白功能類似于基因工程中限制酶的作用，Cas9能夠切割DNA，是一種能使磷酸二酯鍵斷裂的酶，A正確；DNA分子的堿基組成是A、T、G、C，RNA的堿基組成是A、U、G、C，故DNA－RNA雜交區域存在T－A堿基對，B錯誤；據圖可知，向導RNA有折疊成雙鏈的片段，故在單鏈向導RNA分子中也存在堿基互補配對，C正確；向導RNA能識別并結合特定的DNA序列，所以人為改變向導RNA的序列可實現對特定基因的切割，D正確。]
8．D　[識別序列形成雜交區的過程與轉錄過程的堿基配對方式相同，都是A—U、T—A、C—G、G—C，A正確；在被切割后的目標DNA中添加特定的DNA片段需要DNA連接酶將DNA片段連接起來，B正確；Cas9能特異性的切斷目標DNA分子中脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D錯誤。](共18張PPT)
專題特訓3　
雙標記基因、影印接種、藍白斑顯色法與CRISPR/Cas9基因編輯技術
(時間：30分鐘　滿分：32分)
B
題型1　利用雙標記基因和影印接種技術篩選含有目的基因的受體細胞
1.如圖表示某種質粒，其中ori為復制必需的序列，ampr為氨芐青霉素抗性基因，tetr為四環素抗性基因，箭頭表示不同限制性內切核酸酶的酶切位點。為了便于篩選，目的基因合適的插入位點是(　　)
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類題
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A.① B.②
C.③ D.①和③
解析：由題意可知，為了方便篩選，可以把目的基因插入到質粒的某個特殊基因中，因此排除③，又因為ori是復制的必需基因，因此排除①，可以選擇ampr和tetr作為插入基因的位置，B正確。
2.圖1表示某重組質粒的構建過程，質粒P0具有四環素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)，并且含有限制性內切核酸酶EcoR Ⅴ的酶切位點。為篩選出含有重組質粒P1的菌落，采用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到甲、乙、丙三類菌落，三類菌落形態相同，其生長情況如圖2。下列敘述正確的是(　　)
A
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類題
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A.甲類菌落可能同時導入了P0和P1質粒
B.乙類菌落擴大培養后可用于生產
C.丙類菌落可能導入了含反向連接目的基因的質粒
D.用玻璃刮刀將無抗生素平板上的菌落按位置接種到其他三個平板上
解析：根據題圖分析可知，甲類菌落既具有氨芐青霉素抗性，又具有四環素抗性，其可能同時轉入了P0和P1質粒，也可能只轉入了P0質粒，A正確；
乙類菌落不具有四環素抗性，但具有氨芐青霉素抗性，其可能轉入了P1質粒，但還需要進一步的鑒定，例如抗原－抗體雜交后，才能進行擴大培養用于生產，B錯誤；
丙類菌落既不具有四環素抗性，也不具有氨芐青霉素抗性，說明其不含質粒，C錯誤；
應該用接種環將菌落接種到其他平板上，D錯誤。
A.甲類菌落可能同時導入了P0和P1質粒
B.乙類菌落擴大培養后可用于生產
C.丙類菌落可能導入了含反向連接目的基因的質粒
D.用玻璃刮刀將無抗生素平板上的菌落按位置接種到其他三個平板上
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類題
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3.下圖是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，載體質粒具有四環素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。轉化大腸桿菌后，采用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到A、B、C、D四種菌落，其生長情況如下表(注：“＋”代表生長，“－”代表不生長)。根據表中結果判斷，含有重組質粒的菌落是(　　)
B
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類題
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　　平板類型 菌落類型　　 無抗生素 氨芐青霉素 四環素 氨芐青霉素＋四環素
菌落A ＋ ＋ ＋ ＋
菌落B ＋ ＋ － －
菌落C ＋ － － －
菌落D ＋ － ＋ －
A.菌落A B.菌落B
C.菌落C D.菌落D
解析：分析題圖可知：構建重組DNA分子時，目的基因插入的位置在四環素抗性基因(tetr)中間，破壞了四環素抗性基因(tetr)，氨芐青霉素抗性基因(ampr)沒有被破壞。因此含有重組質粒的菌落在添加了四環素的培養基中不能生長，而在添加氨芐青霉素的培養基中能生長，故選B。
A.菌落A B.菌落B
C.菌落C D.菌落D
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類題
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●某科研小組利用質粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構建重組DNA分子。下列分析錯誤的是(　　)
C
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類題
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A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質粒，可得到2條DNA片段
B.不能用AluⅠ酶切割質粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會破壞目的基因
C.構建重組DNA時，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時切割質粒和外源DNA
D.導入了重組DNA的細菌能在含四環素的培養基上生長而不能在含氯霉素的培養基上生長
解析：限制酶HindⅢ和PstⅠ在質粒上各有一個識別切割位點，用HindⅢ和PstⅠ切割質粒，可得到2條DNA片段，A正確；
AluⅠ的識別、切割位點位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA會破壞目的基因，B正確；
選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時切割質粒和外源DNA，質粒中的兩個標記基因均會被破壞，C錯誤；
選擇HindⅢ和PstⅠ同時切割質粒和外源DNA，會破壞質粒中的氯霉素抗性基因，保留四環素抗性基因，所以導入了重組DNA的細菌能在含四環素的培養基上生長而不能在含氯霉素的培養基上生長，D正確。
A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質粒，可得到2條DNA片段
B.不能用AluⅠ酶切割質粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會破壞目的基因
C.構建重組DNA時，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時切割質粒和外源DNA
D.導入了重組DNA的細菌能在含四環素的培養基上生長而不能在含氯霉素的培養基上生長
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類題
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題型2　利用藍白斑顯色法篩選含有目的基因的受體細胞
4.大腸桿菌的質粒上含有LacZ基因，其編碼的產物β－半乳糖苷酶在X－gal和IPTG同時存在時，可以產生藍色沉淀，使菌落呈現藍色，否則菌落呈現白色。如圖為利用該質粒進行的轉基因過程，請據圖判斷菌落①②③的顏色分別是(　　)
B
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類題
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A.藍色　白色　白色
B.藍色　藍色　白色
C.藍色　白色　藍色
D.白色　藍色　白色
5.大腸桿菌pUC118質粒是基因工程中常用的一種載體，具有氨芐青霉素抗性基因，該質粒中某限制酶的唯一切點位于LacZ基因中。在特定的選擇培養基中，若LacZ基因沒有被破壞，則大腸桿菌菌落呈藍色；若LacZ基因被破壞，則菌落呈白色。關于圖中操作的說法正確的是(　　)
B
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類題
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A.試管1中應加入限制酶處理
B.試管2中用Ca2＋處理，將重組載體
導入不含LacZ基因的大腸桿菌中
C.若大腸桿菌的菌落為藍色，則質粒
未導入大腸桿菌
D.培養基中除必需的營養物質外，還應加入適量卡那霉素
解析：試管1中應加入DNA連接酶處理，A錯誤；
試管2中用Ca2＋處理，使大腸桿菌成為感受態細胞，這樣可將重組載體導入不含LacZ基因的大腸桿菌中，B正確；
若大腸桿菌的菌落為藍色，則導入大腸桿菌的是普通質粒，C錯誤；
由題干信息可知，標記基因是氨芐青霉素抗性基因，因此培養基中除必需的營養物質外，還應加入適量氨芐青霉素，D錯誤。
A.試管1中應加入限制酶處理
B.試管2中用Ca2＋處理，將重組載體導入不含LacZ基因的大腸桿菌中
C.若大腸桿菌的菌落為藍色，則質粒未導入大腸桿菌
D.培養基中除必需的營養物質外，還應加入適量卡那霉素
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類題
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題型3　CRISPR/Cas9基因編輯技術
6.CRISPR/Cas9系統主要由向導RNA(SgRNA)和Cas9蛋白兩部分組成，SgRNA可引導Cas9蛋白到特定基因位點進行切割，其機制如圖所示。下列說法正確的是(　　)
B
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類題
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A.SgRNA通過堿基互補配對原則識別目標DNA
分子，Cas9蛋白的功能與DNA連接酶相似
B.若要利用CRISPR/Cas9技術將一個基因從目標
DNA分子上去除，通常需設計兩個序列不同的SgRNA
C.CRISPR/Cas9技術編輯基因有時會因SgRNA錯誤結合而出現“脫靶”現象，一般SgRNA序列越短，脫靶率越低
D.向導RNA可以在逆轉錄酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸
解析：由圖可知，SgRNA可通過與特定基因位點的堿基互補配對，來引導Cas9蛋白到該位點進行切割，即SgRNA通過堿基互補配對原則識別目標DNA分子，而Cas9蛋白的功能與限制酶相似，A錯誤；
CRISPR/Cas9技術編輯基因有時會因SgRNA錯誤結合而出現“脫靶”現象，SgRNA的序列越短，可識別的DNA上的特定堿基序列越短，越容易發生“脫靶”現象，即脫靶率越高，C錯誤；
向導RNA是以DNA的一條鏈為模板通過轉錄形成的，可以在RNA聚合酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸，D錯誤。
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A.SgRNA通過堿基互補配對原則識別目標DNA分子，Cas9蛋白的功能與DNA連接酶相似
B.若要利用CRISPR/Cas9技術將一個基因從目標DNA分子上去除，通常需設計兩個序列不同的SgRNA
C.CRISPR/Cas9技術編輯基因有時會因SgRNA錯誤結合而出現“脫靶”現象，一般SgRNA序列越短，脫靶率越低
D.向導RNA可以在逆轉錄酶的催化下合成，合成的原料包括四種核糖核苷酸
7.2020年諾貝爾化學獎授予了兩位女科學家以表彰她們在基因編輯研究領域做出的卓越貢獻。這兩位科學家巧用CRISPR/Cas9基因剪刀，以極高的精度編輯了動物、植物和微生物的DNA，CRISPR/Cas9基因組編輯系統工作原理如圖所示，關于此技術的解釋錯誤的是(　　)
B
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A.Cas9為一種能使磷酸二酯鍵斷裂的酶
B.DNA－RNA雜交區域不存在T－A堿基對
C.在單鏈向導RNA中也存在堿基互補配對
D.人為改變向導RNA的序列可實現對特定
基因的切割
解析：分析題意可知，Cas9蛋白功能類似于基因工程中限制酶的作用，Cas9能夠切割DNA，是一種能使磷酸二酯鍵斷裂的酶，A正確；
DNA分子的堿基組成是A、T、G、C，RNA的堿基組成是A、U、G、C，故DNA－RNA雜交區域存在T－A堿基對，B錯誤；
據圖可知，向導RNA有折疊成雙鏈的片段，故在單鏈向導RNA分子中也存在堿基互補配對，C正確；
向導RNA能識別并結合特定的DNA序列，所以人為改變向導RNA的序列可實現對特定基因的切割，D正確。
A.Cas9為一種能使磷酸二酯鍵斷裂的酶
B.DNA－RNA雜交區域不存在T－A堿基對
C.在單鏈向導RNA中也存在堿基互補配對
D.人為改變向導RNA的序列可實現對特定基因的切割
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8.CRISPR/Cas9是大腸桿菌等細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統，可用來對抗入侵的部分病毒(DNA)及外源DNA，其原理是由一條單鏈向導RNA引導核酸內切酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割。CRISPR/Cas9基因編輯技術是通過設計向導RNA中20個堿基的識別序列，可以對目標DNA上幾乎任何一個位置進行刪除或添加特定的DNA片段，如圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
D
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類題
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A.識別序列形成雜交區的過程與轉錄過程
的堿基配對方式相同
B.在被切割后的目標DNA中添加特定的
DNA片段需要DNA連接酶
C.大腸桿菌等細菌細胞內能合成與入侵病毒
(DNA)及外源DNA互補的RNA序列
D.Cas9能專一性破壞雙鏈DNA分子中堿基之間的氫鍵來切割DNA分子
解析：識別序列形成雜交區的過程與轉錄過程的堿基配對方式相同，都是A—U、T—A、C—G、G—C，A正確；
在被切割后的目標DNA中添加特定的DNA片段需要DNA連接酶將DNA片段連接起來，B正確；
Cas9能特異性的切斷目標DNA分子中脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D錯誤。
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類題
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A.識別序列形成雜交區的過程與轉錄過程的堿基配對方式相同
B.在被切割后的目標DNA中添加特定的DNA片段需要DNA連接酶
C.大腸桿菌等細菌細胞內能合成與入侵病毒(DNA)及外源DNA互補的RNA序列
D.Cas9能專一性破壞雙鏈DNA分子中堿基之間的氫鍵來切割DNA分子

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