資源簡介

微專題2　PCR技術中引物的設計、選擇與計算
題型1　PCR技術中引物的設計原則
例1 (2021·湖北卷，16改編)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應中非特異條帶的產生，以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量 B.延長熱變性的時間
C.延長延伸的時間 D.提高退火的溫度
例2 (2024·精誠聯盟高二聯考)設計引物是PCR技術的關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)。如下圖所示，相關敘述錯誤的是(　　)
A.引物Ⅰ與引物Ⅱ因局部堿基互補配對而失效
B.引物Ⅰ′因自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效
C.引物中G＋C的含量越高，變性時所需溫度就越高
D.PCR過程中所使用的解旋酶和DNA聚合酶均應耐高溫
題型2　PCR技術中引物的選擇原則
例3 (2024·A9協作體聯盟聯考)利用PCR方法克隆水通道蛋白的基因P。基因P的部分序列如下圖，請從①～④中選擇擴增P基因的合適引物組合(　　)
A.①② B.①③
C.②③ D.②④
例4 (2024·東城區高二期末)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將來自楊樹的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中。為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，進行PCR擴增時應選擇的引物組合是(　　)
A.①＋③ B.①＋②
C.③＋② D.③＋④
題型3　PCR中有關引物數量的計算規律
(假定PCR開始時只有1個模板DNA分子)
循環次數 1 2 3 … n
產物DNA分子數 2 4 8 … 2n
含引物的DNA分子數 2 4 8 … 2n
含有引物A(或B)的DNA分子數 1 3 7 … 2n－1
同時含有引物A和B的DNA分子數 0 2 6 … 2n－2
消耗引物數量 2 6 14 … 2n＋1－2
兩條鏈等長的DNA分子數 0 0 2 … 2n－2n
例5 利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似，如圖所示。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。
從理論上推測，下列敘述錯誤的是(　　)
A.從第3輪循環開始，產物中才開始出現雙鏈等長的DNA片段
B.第4輪循環產物中，含有引物A的DNA片段占比為15/16
C.第5輪循環產物中，同時含引物A和B的DNA片段占比為15/16
D.完成前6輪循環，共消耗引物數量為128個
例6 RT－PCR是將RNA逆轉錄(RT)成cDNA(與mRNA互補的DNA單鏈)和聚合酶鏈式反應(PCR)相結合的技術，具體過程如圖所示，下列敘述正確的是(　　)
A.過程Ⅰ獲得cDNA的過程與DNA復制過程中存在的堿基配對方式相同
B.圖中A、B兩種引物的核苷酸序列不同，但參與子鏈合成的酶均相同
C.圖中子鏈的合成均是以四種核糖核苷酸為原料從引物的一端開始的
D.過程Ⅱ中，若進行6輪循環，則共需要加入引物的數量為63個
微專題2　PCR技術中引物的設計、選擇與計算
例1　D　[PCR過程中，引物和模板不完全配對會形成非特異條帶，增加模板DNA的量不會減少反應中非特異條帶的產生，A錯誤；延長熱變性的時間，有利于雙鏈DNA解聚為單鏈，不能減少反應中非特異條帶的產生，B錯誤；延長延伸的時間，有利于合成新的DNA鏈，但不能減少反應中非特異條帶的產生，C錯誤；在一定溫度范圍內，選擇較高的退火溫度可減少引物和模板間的非特異性結合，D正確。]
例2　D　[PCR過程中不使用解旋酶，D錯誤。]
例3　A
例4　B
例5　D　[完成第6輪循環，共產生26個DNA分子片段，共含有27條單鏈，其中兩條舊鏈不含引物，因此共需引物27－2＝126(個)，D錯誤。]
例6　D　[過程Ⅰ是以四種脫氧核糖核苷酸為原料，以mRNA為模板逆轉錄合成cDNA的過程，催化該過程的酶是逆轉錄酶，存在的堿基配對方式是U—A、A—T、C—G、G—C；過程Ⅱ是DNA單鏈復制過程，是以四種脫氧核糖核苷酸為原料，以DNA單鏈為模板合成DNA單鏈的過程，催化該過程的酶為TaqDNA聚合酶，該過程中存在的堿基配對方式是A—T、G—C、T—A、C—G，A、B、C錯誤；過程Ⅱ中，若進行6輪循環，最終產生的DNA單鏈數為26＝64(條)，新合成的子鏈數為63條，則進行6輪循環，共需要加入引物的數量為63個，D正確。](共13張PPT)
微專題2
PCR技術中引物的設計、選擇與計算
題型1　PCR技術中引物的設計原則
例1 (2021·湖北卷，16改編)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應中非特異條帶的產生，以下措施中有效的是(　　)
A.增加模板DNA的量 B.延長熱變性的時間
C.延長延伸的時間 D.提高退火的溫度
D
解析：PCR過程中，引物和模板不完全配對會形成非特異條帶，增加模板DNA的量不會減少反應中非特異條帶的產生，A錯誤；
延長熱變性的時間，有利于雙鏈DNA解聚為單鏈，不能減少反應中非特異條帶的產生，B錯誤；
延長延伸的時間，有利于合成新的DNA鏈，但不能減少反應中非特異條帶的產生，C錯誤；
在一定溫度范圍內，選擇較高的退火溫度可減少引物和模板間的非特異性結合，D正確。
例2 (2024·精誠聯盟高二聯考)設計引物是PCR技術的關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)。如下圖所示，相關敘述錯誤的是(　　)
D
A.引物Ⅰ與引物Ⅱ因局部堿基互補配對而失效
B.引物Ⅰ′因自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效
C.引物中G＋C的含量越高，變性時所需溫度就越高
D.PCR過程中所使用的解旋酶和DNA聚合酶均應耐高溫
解析：PCR過程中不使用解旋酶，D錯誤。
題型2　PCR技術中引物的選擇原則
例3 (2024·A9協作體聯盟聯考)利用PCR方法克隆水通道蛋白的基因P?；騊的部分序列如下圖，請從①～④中選擇擴增P基因的合適引物組合(　　)
A
A.①② B.①③
C.②③ D.②④
例4 (2024·東城區高二期末)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將來自楊樹的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中。為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，進行PCR擴增時應選擇的引物組合是(　　)
B
A.①＋③ B.①＋②
C.③＋② D.③＋④
題型3　PCR中有關引物數量的計算規律
(假定PCR開始時只有1個模板DNA分子)
循環次數 1 2 3 … n
產物DNA分子數 2 4 8 … 2n
含引物的DNA分子數 2 4 8 … 2n
含有引物A(或B)的DNA分子數 1 3 7 … 2n－1
同時含有引物A和B的DNA分子數 0 2 6 … 2n－2
消耗引物數量 2 6 14 … 2n＋1－2
兩條鏈等長的DNA分子數 0 0 2 … 2n－2n
例5 利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似，如圖所示。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。
從理論上推測，下列敘述錯誤的是(　　)
A.從第3輪循環開始，產物中才開始出現
雙鏈等長的DNA片段
B.第4輪循環產物中，含有引物A的DNA
片段占比為15/16
C.第5輪循環產物中，同時含引物A和B的DNA片段占比為15/16
D.完成前6輪循環，共消耗引物數量為128個
解析：完成第6輪循環，共產生26個DNA分子片段，共含有27條單鏈，其中兩條舊鏈不含引物，因此共需引物27－2＝126(個)，D錯誤。
D
例6 RT－PCR是將RNA逆轉錄(RT)成cDNA(與mRNA互補的DNA單鏈)和聚合酶鏈式反應(PCR)相結合的技術，具體過程如圖所示，下列敘述正確的是(　　)
D
A.過程Ⅰ獲得cDNA的過程與DNA復制過程中存在的堿基配對方式相同
B.圖中A、B兩種引物的核苷酸序列不同，但參與子鏈合成的酶均相同
C.圖中子鏈的合成均是以四種核糖核苷酸為原料從引物的一端開始的
D.過程Ⅱ中，若進行6輪循環，則共需要加入引物的數量為63個
解析：過程Ⅰ是以四種脫氧核糖核苷酸為原料，以mRNA為模板逆轉錄合成cDNA的過程，催化該過程的酶是逆轉錄酶，存在的堿基配對方式是U—A、A—T、C—G、G—C；過程Ⅱ是DNA單鏈復制過程，是以四種脫氧核糖核苷酸為原料，以DNA單鏈為模板合成DNA單鏈的過程，催化該過程的酶為TaqDNA聚合酶，該過程中存在的堿基配對方式是A—T、G—C、T—A、C—G，A、B、C錯誤；過程Ⅱ中，若進行6輪循環，最終產生的DNA單鏈數為26＝64(條)，新合成的子鏈數為63條，則進行6輪循環，共需要加入引物的數量為63個，D正確。
A.過程Ⅰ獲得cDNA的過程與DNA復制過程中存在的堿基配對方式相同
B.圖中A、B兩種引物的核苷酸序列不同，但參與子鏈合成的酶均相同
C.圖中子鏈的合成均是以四種核糖核苷酸為原料從引物的一端開始的
D.過程Ⅱ中，若進行6輪循環，則共需要加入引物的數量為63個專題特訓2 PCR技術中引物的設計、選擇與計算
(時間：30分鐘分值：36分)
選擇題：第1～9題，每小題4分，共36分。
題型1　PCR技術中引物的設計原則
1.(2024·臺州高二期末)數字PCR技術是一種核酸分子絕對定量技術，其原理如圖所示。下列有關敘述錯誤的是(　　)
應根據目的基因的兩端已知序列設計兩種引物
PCR每一循環包括變性、退火和延伸三個過程
PCR結束后有靶分子的反應單位能檢測出熒光
每個反應單位中都需要加入解旋酶和耐高溫的Taq DNA聚合酶
2.RTPCR是將mRNA逆轉錄獲得cDNA的方法和cDNA聚合酶鏈式反應相結合的技術。某生物興趣小組為該過程設計了相關引物并進行實驗。下列說法錯誤的是(　　)
PCR過程主要涉及的酶是耐高溫的Taq DNA聚合酶
一般情況下，引物A和B的長度越長，則PCR循環步驟中的退火溫度設定就越低
PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，在凝膠中DNA分子的遷移速率與DNA的分子大小有關
實驗后發現幾乎不能得到擴增產物，原因可能是引物B自身出現了局部堿基互補配對而失效
題型2　PCR技術中引物的選擇原則
3.(2024·環大羅山聯盟)常規PCR只能擴增兩引物間的DNA區段，要擴增已知DNA序列兩側的未知DNA序列，可用反向PCR技術。反向PCR技術擴增的原理如圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
酶切階段，L中不能含有酶切時所選限制酶的識別序列
環化階段，可選用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶
圖中引物，應選擇引物1和引物4，且二者間不能互補配對
PCR擴增，每輪循環前應加入限制酶將環狀DNA切割成線狀
4.(2024·綠谷聯盟)PCR技術應用廣泛，研究者設計了與目的基因結合的兩對引物(引物B和C中都替換了一個堿基)，并按如圖方式依次進行4次PCR擴增，從而實現對目的基因的定點誘變。圖中所示的4次PCR都涉及引物的選擇，以下有關PCR1、PCR2、PCR3、PCR4選擇的引物的組合中錯誤的是(　　)
注：圖中“”為堿基序列變化點。
選項 引物A 引物B 引物C 引物D
A PCR1 √ √ × ×
B PCR2 × × √ √
C PCR3 √ × √ ×
D PCR4 √ × × √
注：√表示選擇，×表示不選擇。
A B C D
5.為研究擬南芥植株E基因的功能，科研人員將TDNA插入E基因中，導致其發生突變，突變后的基因記為e。為驗證某擬南芥植株的基因型，科研人員根據基因E和TDNA的序列，設計了三種引物，引物的結合位置如圖所示。已知完整的E基因和TDNA整合后，因片段長度過大，不能完成整個融合基因的PCR擴增。科研人員提取該植株的總DNA，分別用引物“Ⅰ＋Ⅲ”組合及“Ⅱ＋Ⅲ”組合進行PCR，兩種引物組合均能完成擴增。擬南芥植株的基因型為(　　)
Ee EE
ee EE或Ee
題型3　PCR中有關引物數量的計算規律
6.利用PCR將某小段含目的基因的DNA分子擴增循環n次，則(　　)
需要已知目的基因的全部序列以便設計引物
共需2n－2個引物參與子代DNA分子的合成
應向反應體系中加入解旋酶、Taq DNA聚合酶、緩沖液等
理論上第4輪循環產物中含兩種引物的DNA片段占7/8
7.為獲得Gata3GFP融合基因純合小鼠，某科研小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白(GFP)基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合雌、雄小鼠各1只，交配后獲得了4只新生小鼠。為了鑒定4只新生小鼠的基因型，科研人員設計了引物1、引物2和引物3用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。下列分析正確的是(　　)
據圖分析，PCR擴增時選擇的引物組合是引物1和引物3
分析圖乙可知，4號小鼠為Gata3GFP融合基因純合小鼠
圖甲中啟動子區是RNA聚合酶識別和結合的位點，能夠驅動GFP基因的轉錄
若用引物1和引物3擴增甲圖中插入后的片段，循環4次后，產物中等長片段所占的比例為3/8
8.RTPCR是將RNA逆轉錄(RT)和cDNA的PCR相結合的技術，可利用此技術獲取目的基因，具體過程如圖所示。以下說法錯誤的是(　　)
設計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列
GC含量高的引物在與模板鏈結合時，需要更高的溫度
過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、耐高溫的Taq DNA聚合酶和引物A等
過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環的擴增，理論上需要2n－1個引物B
9.熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中的DNA含量，其原理是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針，當子鏈延伸至探針處時會水解探針并生成熒光分子，即DNA每擴增一次，就有一個熒光分子生成，熒光監測系統隨時接收熒光信號的變化，如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)
在反應體系中，檢測到的熒光信號越強則消耗的引物越多
1個DNA分子經過3次循環會得到8個兩條鏈等長的DNA分子
PCR所用引物1和引物2均是由脫氧核苷酸組成的
人工設計合成的引物1的堿基序列不能與引物2的互補配對
專題特訓2　PCR技術中引物的設計、選擇與計算
1．D　[由于DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，因此要用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增，A正確；PCR技術中的每個循環由變性、退火、延伸三個基本反應步驟構成，B正確；熒光的出現是熒光探針水解導致的，熒光探針首先與模板DNA的相應區段結合(靶分子)，隨著DNA復制延伸至熒光探針部位，導致熒光探針的水解進而產生熒光，顯然每個反應單位有無熒光取決于是否含有靶分子，C正確；PCR技術不需要解旋酶，每個反應單位中都需要加入耐高溫的Taq DNA聚合酶，D錯誤。]
2．B　[PCR過程主要涉及的酶是耐高溫的Taq DNA聚合酶，A正確；一般情況下，引物A和B的長度越長，引物與模板DNA之間的非特異性結合的概率越大，因此需要更高的退火溫度，B錯誤；實驗后發現幾乎不能得到擴增產物，原因可能是引物B自身出現了局部堿基互補配對而失效，導致子鏈無法延伸，D正確。]
3．D　[在酶切階段，已知序列L中不能含有酶切時所選限制酶的識別序列，不然會將已知序列L切斷，造成序列識別混亂，A正確；T4 DNA連接酶或E.coli DNA連接酶都可以用來連接黏性末端，因此環化階段，可選用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶，B正確；PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的5′端通過堿基互補配對結合，為保證延伸的是已知序列兩側的未知序列，應該選擇引物1和引物4，且二者間不能互補配對，C正確；PCR的擴增只需要第一次循環前加入足夠的限制酶，并不需要每輪循環前都加入，D錯誤。]
4．C　[根據題意和圖示分析，經過4次PCR技術后獲得了新的基因，這是一種定點的基因突變技術。通過PCR擴增目的DNA片段時，Taq DNA聚合酶催化子鏈沿引物的3′端延伸，DNA新鏈合成的方向為5′→3′，即引物的方向為5′→3′，結合圖示PCR1、PCR2的產物可知，PCR1使用的引物為A、B，PCR2使用的引物為C、D，第3次PCR時，兩條單鏈可互為引物，故PCR3不需要使用引物，PCR4結束后得到的是完整的長段DNA，結合引物的方向為5′→3′，因此選用的是A、D兩種引物。]
5．A　[根據題干“已知完整的基因E和T－DNA整合后，因片段長度過大，不能完成整個融合基因的PCR擴增”，且e的產生是T－DNA插入基因E中，因此當擬南芥的基因型為EE時，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”組合可以獲得PCR產物，但用引物“Ⅰ＋Ⅲ”組合時，不能獲得PCR產物；當擬南芥的基因型為Ee時，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”組合和引物“Ⅰ＋Ⅲ”組合時，都能獲得PCR產物；當擬南芥的基因型為ee時，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”組合不能獲得PCR產物，但用引物“Ⅰ＋Ⅲ”組合時，能獲得PCR產物；即該擬南芥植株的基因型為Ee，A正確。]
6．D　[只需要已知目的基因兩端的序列便可設計引物，A錯誤；擴增循環n次，需一種引物的數量為2n－1，常規PCR共需兩種引物的數量為2×(2n－1)＝2n＋1－2，B錯誤；不需向PCR的反應體系中加入解旋酶，C錯誤；理論上第4輪循環產物中含兩種引物的DNA片段占(24－2)/16＝7/8，D正確。]
7．C　[Gata3－GFP融合基因電泳后的DNA片段較大，Gata3基因電泳后的DNA片段較小。用引物1和引物3進行PCR擴增，若小鼠無GFP基因，則無PCR產物。選擇引物1和引物2進行擴增，整合GFP基因后，核酸片段變長，沒有整合GFP基因時，則片段較小，因此，PCR擴增時選擇的引物組合是引物1和引物2，A錯誤；2號個體只有大片段，所以2號個體是Gata3－GFP融合基因純合子，4號個體只有小片段，是野生型，B錯誤；圖甲中啟動子區是RNA聚合酶識別和結合的位點，能夠驅動Gata3和GFP基因的轉錄，進而可編碼相應的蛋白質，C正確；若用引物1和引物3擴增甲圖中插入后的片段，循環4次后，獲得的DNA片段總數為24＝16(個)，其中等長片段的數目為24－2×4＝8(個)，可見其所占的比例為1/2，D錯誤。]
8．C　[引物是一段能與目的基因互補配對的脫氧核苷酸序列，設計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列，A正確；G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵，所以GC含量越高的引物，退火溫度越高，B正確；過程Ⅰ是逆轉錄過程，所以需要加入緩沖液、原料、逆轉錄酶和引物A等，C錯誤；過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環的擴增，根據DNA的半保留復制可知，理論上需要2n－1個引物B，D正確。]
9．B　[當子鏈延伸至探針處時會水解探針并生成熒光分子，即DNA每擴增一次，就有一個熒光分子生成，則檢測到的熒光信號越強，說明合成的子鏈越多，消耗的引物就越多，A正確；1個DNA分子經過3次循環得到兩條鏈等長的DNA分子數量為23－2×3＝2(個)，B錯誤；PCR所用引物1和引物2均是由脫氧核苷酸組成的單鏈，可以與模板DNA的兩端堿基互補配對，C正確；人工設計合成的引物1的堿基序列不能與引物2的互補配對，否則可能引起兩種引物之間的堿基互補配對，進而不能與模板DNA配對，則不能進行PCR，D正確。](共21張PPT)
專題特訓2　
PCR技術中引物的設計、選擇與計算
(時間：30分鐘　滿分：36分)
D
題型1　PCR技術中引物的設計原則
1.(2024·臺州高二期末)數字PCR技術是一種核酸分子絕對定量技術，其原理如圖所示。下列有關敘述錯誤的是(　　)
A.應根據目的基因的兩端已知序列設計兩種引物
B.PCR每一循環包括變性、退火和延伸三個過程
C.PCR結束后有靶分子的反應單位能檢測出熒光
D.每個反應單位中都需要加入解旋酶和耐高溫的Taq DNA聚合酶
解析：由于DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，因此要用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增，A正確；
PCR技術中的每個循環由變性、退火、延伸三個基本反應步驟構成，B正確；
熒光的出現是熒光探針水解導致的，熒光探針首先與模板DNA的相應區段結合(靶分子)，隨著DNA復制延伸至熒光探針部位，導致熒光探針的水解進而產生熒光，顯然每個反應單位有無熒光取決于是否含有靶分子，C正確；
PCR技術不需要解旋酶，每個反應單位中都需要加入耐高溫的Taq DNA聚合酶，D錯誤。
A.應根據目的基因的兩端已知序列設計兩種引物
B.PCR每一循環包括變性、退火和延伸三個過程
C.PCR結束后有靶分子的反應單位能檢測出熒光
D.每個反應單位中都需要加入解旋酶和耐高溫的Taq DNA聚合酶
2.RT－PCR是將mRNA逆轉錄獲得cDNA的方法和cDNA聚合酶鏈式反應相結合的技術。某生物興趣小組為該過程設計了相關引物并進行實驗。下列說法錯誤的是(　　)
B
A.PCR過程主要涉及的酶是耐高溫的Taq DNA聚合酶
B.一般情況下，引物A和B的長度越長，則PCR循環步驟中的退火溫度設定就越低
C.PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，在凝膠中DNA分子的遷移速率與DNA的分子大小有關
D.實驗后發現幾乎不能得到擴增產物，原因可能是引物B自身出現了局部堿基互補配對而失效
解析：PCR過程主要涉及的酶是耐高溫的Taq DNA聚合酶，A正確；
一般情況下，引物A和B的長度越長，引物與模板DNA之間的非特異性結合的概率越大，因此需要更高的退火溫度，B錯誤；
實驗后發現幾乎不能得到擴增產物，原因可能是引物B自身出現了局部堿基互補配對而失效，導致子鏈無法延伸，D正確。
A.PCR過程主要涉及的酶是耐高溫的Taq DNA聚合酶
B.一般情況下，引物A和B的長度越長，則PCR循環步驟中的退火溫度設定就越低
C.PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，在凝膠中DNA分子的遷移速率與DNA的分子大小有關
D.實驗后發現幾乎不能得到擴增產物，原因可能是引物B自身出現了局部堿基互補配對而失效
題型2　PCR技術中引物的選擇原則
3.(2024·環大羅山聯盟)常規PCR只能擴增兩引物間的DNA區段，要擴增已知DNA序列兩側的未知DNA序列，可用反向PCR技術。反向PCR技術擴增的原理如圖所示。下列敘述錯誤的是(　　)
D
A.酶切階段，L中不能含有酶切時所
選限制酶的識別序列
B.環化階段，可選用E.coli DNA連
接酶或T4 DNA連接酶
C.圖中引物，應選擇引物1和引物4，且二者間不能互補配對
D.PCR擴增，每輪循環前應加入限制酶將環狀DNA切割成線狀
解析：在酶切階段，已知序列L中不能含有酶切時所選限制酶的識別序列，不然會將已知序列L切斷，造成序列識別混亂，A正確；
T4 DNA連接酶或E.coli DNA連接酶都可以用來連接黏性末端，因此環化階段，可選用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶，B正確；
PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的5′端通過堿基互補配對結合，為保證延伸的是已知序列兩側的未知序列，應該選擇引物1和引物4，且二者間不能互補配對，C正確；
PCR的擴增只需要第一次循環前加入足夠的限制酶，并不需要每輪循環前都加入，D錯誤。
A.酶切階段，L中不能含有酶切時所選限制酶的識別序列
B.環化階段，可選用E.coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶
C.圖中引物，應選擇引物1和引物4，且二者間不能互補配對
D.PCR擴增，每輪循環前應加入限制酶將環狀DNA切割成線狀
4.(2024·綠谷聯盟)PCR技術應用廣泛，研究者設計了與目的基因結合的兩對引物(引物B和C中都替換了一個堿基)，并按如圖方式依次進行4次PCR擴增，從而實現對目的基因的定點誘變。圖中所示的4次PCR都涉及引物的選擇，以下有關PCR1、PCR2、PCR3、PCR4選擇的引物的組合中錯誤的是(　　)
C
注：圖中“ ”為堿基序列變化點。
注：√表示選擇，×表示不選擇。
選項 引物A 引物B 引物C 引物D
A PCR1 √ √ × ×
B PCR2 × × √ √
C PCR3 √ × √ ×
D PCR4 √ × × √
解析：根據題意和圖示分析，經過4次PCR技術后獲得了新的基因，這是一種定點的基因突變技術。通過PCR擴增目的DNA片段時，Taq DNA聚合酶催化子鏈沿引物的3′端延伸，DNA新鏈合成的方向為5′→3′，即引物的方向為5′→3′，結合圖示PCR1、PCR2的產物可知，PCR1使用的引物為A、B，PCR2使用的引物為C、D，第3次PCR時，兩條單鏈可互為引物，故PCR3不需要使用引物，PCR4結束后得到的是完整的長段DNA，結合引物的方向為5′→3′，因此選用的是A、D兩種引物。
5.為研究擬南芥植株E基因的功能，科研人員將T－DNA插入E基因中，導致其發生突變，突變后的基因記為e。為驗證某擬南芥植株的基因型，科研人員根據基因E和T－DNA的序列，設計了三種引物，引物的結合位置如圖所示。已知完整的E基因和T－DNA整合后，因片段長度過大，不能完成整個融合基因的PCR擴增?？蒲腥藛T提取該植株的總DNA，分別用引物“Ⅰ＋Ⅲ”組合及“Ⅱ＋Ⅲ”組合進行PCR，兩種引物組合均能完成擴增。擬南芥植株的基因型為(　　)
A
A.Ee B.EE
C.ee D.EE或Ee
解析：根據題干“已知完整的基因E和T－DNA整合后，因片段長度過大，不能完成整個融合基因的PCR擴增”，且e的產生是T－DNA插入基因E中，因此當擬南芥的基因型為EE時，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”組合可以獲得PCR產物，但用引物“Ⅰ＋Ⅲ”組合時，不能獲得PCR產物；當擬南芥的基因型為Ee時，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”組合和引物“Ⅰ＋Ⅲ”組合時，都能獲得PCR產物；當擬南芥的基因型為ee時，用引物“Ⅱ＋Ⅲ”組合不能獲得PCR產物，但用引物“Ⅰ＋Ⅲ”組合時，能獲得PCR產物；即該擬南芥植株的基因型為Ee，A正確。
A.Ee B.EE
C.ee D.EE或Ee
題型3　PCR中有關引物數量的計算規律
6.利用PCR將某小段含目的基因的DNA分子擴增循環n次，則(　　)
A.需要已知目的基因的全部序列以便設計引物
B.共需2n－2個引物參與子代DNA分子的合成
C.應向反應體系中加入解旋酶、Taq DNA聚合酶、緩沖液等
D.理論上第4輪循環產物中含兩種引物的DNA片段占7/8
D
解析：只需要已知目的基因兩端的序列便可設計引物，A錯誤；
擴增循環n次，需一種引物的數量為2n－1，常規PCR共需兩種引物的數量為2×(2n－1)＝2n＋1－2，B錯誤；
不需向PCR的反應體系中加入解旋酶，C錯誤；
理論上第4輪循環產物中含兩種引物的DNA片段占(24－2)/16＝7/8，D正確。
7.為獲得Gata3－GFP融合基因純合小鼠，某科研小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白(GFP)基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合雌、雄小鼠各1只，交配后獲得了4只新生小鼠。為了鑒定4只新生小鼠的基因型，科研人員設計了引物1、引物2和引物3用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。下列分析正確的是(　　)
C
A.據圖分析，PCR擴增時選擇的引物組合是引物1和引物3
B.分析圖乙可知，4號小鼠為Gata3－GFP融合基因純合小鼠
C.圖甲中啟動子區是RNA聚合酶識別和結合的位點，能夠驅動GFP基因的轉錄
D.若用引物1和引物3擴增甲圖中插入后的片段，循環4次后，產物中等長片段所占的比例為3/8
解析：Gata3－GFP融合基因電泳后的DNA片段較大，Gata3基因電泳后的DNA片段較小。用引物1和引物3進行PCR擴增，若小鼠無GFP基因，則無PCR產物。選擇引物1和引物2進行擴增，整合GFP基因后，核酸片段變長，沒有整合GFP基因時，則片段較小，因此，PCR擴增時選擇的引物組合是引物1和引物2，A錯誤；
2號個體只有大片段，所以2號個體是Gata3－GFP融合基因純合子，4號個體只有小片段，是野生型，B錯誤；
圖甲中啟動子區是RNA聚合酶識別和結合的位點，能夠驅動Gata3和GFP基因的轉錄，進而可編碼相應的蛋白質，C正確；
若用引物1和引物3擴增甲圖中插入后的片段，循環4次后，獲得的DNA片段總數為24＝16(個)，其中等長片段的數目為24－2×4＝8(個)，可見其所占的比例為1/2，D錯誤。
A.據圖分析，PCR擴增時選擇的引物組合是引物1和引物3
B.分析圖乙可知，4號小鼠為Gata3－GFP融合基因純合小鼠
C.圖甲中啟動子區是RNA聚合酶識別和結合的位點，能夠驅動GFP基因的轉錄
D.若用引物1和引物3擴增甲圖中插入后的片段，循環4次后，產物中等長片段所占的比例為3/8
8.RT－PCR是將RNA逆轉錄(RT)和cDNA的PCR相結合的技術，可利用此技術獲取目的基因，具體過程如圖所示。以下說法錯誤的是(　　)
C
A.設計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列
B.GC含量高的引物在與模板鏈結合時，需要更高的溫度
C.過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、耐高溫的Taq DNA聚合酶和引物A等
D.過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環的擴增，理論上需要2n－1個引物B
解析：引物是一段能與目的基因互補配對的脫氧核苷酸序列，設計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列，A正確；
G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵，所以GC含量越高的引物，退火溫度越高，B正確；
過程Ⅰ是逆轉錄過程，所以需要加入緩沖液、原料、逆轉錄酶和引物A等，C錯誤；
過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環的擴增，根據DNA的半保留復制可知，理論上需要2n－1個引物B，D正確。
A.設計擴增目的基因的引物時需已知一段目的基因序列
B.GC含量高的引物在與模板鏈結合時，需要更高的溫度
C.過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、耐高溫的Taq DNA聚合酶和引物A等
D.過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進行n次循環的擴增，理論上需要2n－1個引物B
9.熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中的DNA含量，其原理是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針，當子鏈延伸至探針處時會水解探針并生成熒光分子，即DNA每擴增一次，就有一個熒光分子生成，熒光監測系統隨時接收熒光信號的變化，如圖所示。下列說法錯誤的是(　　)
B
A.在反應體系中，檢測到的熒光信號越強則消耗的引物越多
B.1個DNA分子經過3次循環會得到8個兩條鏈等長的DNA分子
C.PCR所用引物1和引物2均是由脫氧核苷酸組成的
D.人工設計合成的引物1的堿基序列不能與引物2的互補配對
解析：當子鏈延伸至探針處時會水解探針并生成熒光分子，即DNA每擴增一次，就有一個熒光分子生成，則檢測到的熒光信號越強，說明合成的子鏈越多，消耗的引物就越多，A正確；
1個DNA分子經過3次循環得到兩條鏈等長的DNA分子數量為23－2×3＝2(個)，B錯誤；
PCR所用引物1和引物2均是由脫氧核苷酸組成的單鏈，可以與模板DNA的兩端堿基互補配對，C正確；
人工設計合成的引物1的堿基序列不能與引物2的互補配對，否則可能引起兩種引物之間的堿基互補配對，進而不能與模板DNA配對，則不能進行PCR，D正確。
A.在反應體系中，檢測到的熒光信號越強則消耗的引物越多
B.1個DNA分子經過3次循環會得到8個兩條鏈等長的DNA分子
C.PCR所用引物1和引物2均是由脫氧核苷酸組成的
D.人工設計合成的引物1的堿基序列不能與引物2的互補配對

展開更多......

收起↑