資源簡介

(共30張PPT)
基因工程及其技術
1.簡述PCR的原理、條件及過程
2.嘗試進行PCR的基本操作并電泳鑒定PCR的產物
3.掌握基因工程的基本操作程序
【學習目標】
目 錄
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
01
03
基因工程的基本操作程序
利用PCR技術擴增DNA片段并完成電泳鑒定
02
01
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
1.含義：聚合酶鏈式反應簡稱PCR，是目的DNA片段(目的基因)的體外擴增技術
2.原理：DNA半保留復制
3.操作步驟：在向PCR管中加入一定量的模板DNA、引物對、4種dNTP、緩沖液和熱穩定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2+等后，設置好反應程序，啟動PCR儀，自動完成反應步驟
PCR儀
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
4.反應步驟
(1) 變性：在約 94 ℃高溫下，作為模板的雙鏈 DNA 解旋（變性）為兩條單鏈DNA
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
變性
雙螺旋解開
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
(2) 退火：反應體系的溫度降至約55℃，2條引物分別與對應單鏈DNA上的特定部位配對
5’
3’
3’
5’
復性
3’
5’
兩種引物
3’
5’
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
(3) 延伸：反應體系的溫度回升到約72℃（Taq酶催化作用的最適反應溫度），4種脫氧核苷三磷酸根據堿基互補配對原則，在Taq酶的作用下連接到引物3′端之后，使引物鏈延伸，并形成互補的DNA雙鏈
5’
3’
3’
5’
延伸
3’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
完成上述第一次循環后，PCR 儀會按設定接著進行第二次、第三次......循環
第二次循環產物
第三次循環產物
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
5.PCR技術的應用
(1)廣泛應用于醫學及分子生物學領域，如：病原體鑒定、遺傳病診斷 、免疫學研究、癌基因探索及某些疾病治療等
(2)在古生物學、法醫學等方面也有廣泛的應用
02
利用PCR技術擴增DNA片段并完成電泳鑒定
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
1.實驗目的
(1)嘗試運用PCR儀擴增DNA片段
(2)關注PCR技術的應用
(3)學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的方法和技術
2.實驗原理
(1)擴增DNA片段的過程包括變性、退火和延伸等步驟的多次循環
(2)理論上，每經過一個循環，樣本中DNA片段的數量增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過n個循環后，DNA片段數量可擴增至原來的2n 倍
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
(3)PCR反應體系包括：DNA模板、反應緩沖液、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的DNA引物對、Taq酶等
(4)在不同階段，還需要控制PCR儀反應系統的不同溫度
在PCR過程中實際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
（5）PCR和體內DNA復制的差異
PCR 細胞核內DNA復制
場所 試管中 細胞內
方式 半保留全連續局部區域復制 半保留半不連續全鏈復制
起始位點 引物3’端 復制起始位點
酶 僅一種DNA聚合酶（Taq酶） 多種酶
反應條件 溫度變幅大 溫和
解旋 高溫解旋 解旋酶解旋
引物 DNA片段，保留在復制的子鏈中 RNA片段，不保留在復制的子鏈中
產物 引物界定的片段 核基因組
循環次數 人為設置 與細胞分裂同步
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
3.實驗器材和試劑
(1)器材：PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳系統、凝膠成像儀或紫外透射儀、微孔加熱器(微量恒溫儀)、微量取液器、PCR管、槍頭等
(2)試劑：DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、雙蒸水、10×PCR緩沖液等
PCR儀
微量離心管
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
PCR反應體系的配方 10倍濃縮的擴增緩沖液 5ul
2.5mmol/l 的4種脫氧核苷酸的等量混合液 4ul
10umol/l 的引物I 2ul
10umol/l 的引物II 2ul
H2O 35ul
Taq酶 1U
模板DNA 1ul
（1）采用微量取液器，在0.2mLPCR管內配制50μL反應體系
① 94℃ 預變性 5min
② 94℃ 變性 1min
③ 55℃ 退火 1min
④ 72℃ 延伸 2min
⑤ 重復步驟②~④，30個循環 ⑥ 72℃延伸7~10min （2）按下述程序進行擴增
4.實驗步驟
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
進行此實驗需要配制質量分數為1%的瓊脂糖凝膠液(1×TAE)、50μL PCR擴增產物和6μL凝膠加樣緩沖液等試劑，操作時維持恒壓80V1.5～2h
（3）電泳分析
電泳鑒定實驗時，采用凝膠成像儀或紫外透射儀觀察和記錄電泳結果。
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
（1）Marker（M）：標準樣，一個已知分子質量的DNA樣品作為對照，用來確定待測樣品中DNA的相對分子質量。
(2)DNA熒光條帶:
①條帶的有無:代表是否成功擴增出待測樣品中的DNA。若無條帶，常見原因有:無DNA模板，引物設計不合適
②條帶的亮度:代表擴增的DNA數量，越亮代表DNA數量越多
③條帶的位置:常代表DNA的大小。一般距離點樣孔越遠，說明跑的越快，DNA的分子質量越小
產物鑒定
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
1.在電泳鑒定中，判斷DNA片段擴增是否成功的依據是什么？
提示　可以通過凝膠成像儀或紫外透射儀直接觀察DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。
2.試分析PCR反應中變性時溫度低、時間短和退火時的溫度過低對實驗結果分別產生什么影響？
提示　變性時溫度低、時間短可能導致未出現擴增條帶；退火時的溫度過低可能導致出現非特異性擴增條帶。
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
3.復性的過程一定是引物與DNA模板鏈結合嗎？
復性時引物與DNA模板的結合是隨機的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結合，但兩條模板鏈重新結合的概率較低。
原因是：
①模板鏈一般比較長，比引物復雜得多，重新結合的概率較低。
②加入引物的量足夠多，而模板鏈數量少，引物與模板之間的碰撞結合機會，遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞機會。
03
基因工程的基本操作程序
藍色妖姬
轉基因藍玫瑰
藍色妖姬并不是真正的藍玫瑰，而是用白玫瑰或白月季染成藍色的，真正的藍玫瑰是一種轉基因的玫瑰品種。
基因工程的基本操作程序
三色紫羅蘭
白玫瑰
思考：真正的藍玫瑰培育過程是怎樣的呢？
轉基因藍玫瑰
導入
目的基因
受體細胞
藍色素基因
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的獲取
（1）通過化學合成法直接合成目的基因
① 對于比較小的目的基因，在明確脫氧核苷酸序列后，可以通過DNA合成儀直接人工合成
② 全基因或較大基因可以使用半合成的方法降低成本
DNA合成儀
基因工程的基本操作程序
（2）通過基因文庫獲取目的基因
① 基因組文庫：含有某種生物體全部基因片段的重組DNA的克隆群體
特點：受體菌群中的不同個體含有該種生物的不同基因拷貝，整個菌群所含有的基因拷貝便可能涵蓋了該生物的所有基因
篩選方法：一般采用核酸探針雜交的方法
基因工程的基本操作程序
② cDNA文庫：從組織細胞中提取mRNA,逆轉錄成cDNA，與適當載體連接后轉化宿主，這種包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫
特點：含有某種生物的部分基因
課堂小結
基因工程及其技術
聚合酶鏈式反應（PCR）技術
利用PCR技術擴增DNA片段
并完成電泳鑒定
基因工程的基本操作
過程：變性、退火、延伸
原理：DNA半保留復制
獲取目的基因
電泳、結果鑒定與分析
PCR技術
隨堂小測
1.下列有關基因工程基本操作程序的敘述，正確的是( )
A.目的基因檢測時所用的核酸探針是指與目的基因相同的特定雙鏈DNA
B.基因組文庫的基因含有某物種的部分基因
C.若基因比較小且核苷酸序列已知，則可直接通過化學方法合成
D.抗生素合成基因作為標記基因，可鑒別目的基因是否導入受體細胞
解析：A、DNA探針是指用放射性同位素或熒光分子標記的DNA單鏈，利用堿基互補配對原則，檢測目的基因是否導入受體細胞中，A錯誤；B、基因組文庫的基因含有某物種的全部基因，cDNA文庫的基因含有某物種的部分基因，B錯誤；C、若目的基因比較小，核苷酸序列已知，可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成，C正確；D、運載體上的抗生素抗性基因作為標記基因，可用于檢測目的基因是否導入受體細胞，D錯誤。
C
2.如圖是蛋白質工程中改造目的基因的一種技術路線。S1核酸酶可以去除雙鏈DNA突出的單鏈區；外切核酸酶III只能從DNA雙鏈的3'末端逐個水解單核苷酸，可以產生不同長度的5'突出末端。下列敘述錯誤的是( )
A.步驟一需使用兩種限制酶切割目的基因片段
B.步驟二、三分別使用了S1核酸酶、外切核酸酶Ⅲ
C.步驟四宜選用T4 DNA連接酶處理DNA片段
D.質粒載體2中目的基因片段N的長度有多種
解析：步驟一需使用兩種限制酶切割目的基因片段，可防止含目的基因的外源DNA片段自身環化，A正確；外切核酸酶III只能從DNA雙鏈的3'末端逐個水解單核苷酸，可以產生不同長度的5'突出末端，由圖可知，步驟二應使用外切核酸酶III，步驟三應使用S1核酸酶，B錯誤；T4 DNA連接酶可連接平末端，故步驟四宜選用T4 DNA連接酶處理DNA片段，C正確；質粒載體2中目的基因片段N的長度有多種，因為外切核酸酶III處理后可以獲得不同長度的5'突出末端，D正確。
B
3.熒光定量PCR技術是在常規PCR的基礎上，加入與模板DNA某條鏈互補的熒光探針（一類兩端經過特殊基團修飾的單鏈DNA片段），當子鏈延伸至探針處時DNA聚合酶會水解掉探針一端并生成熒光分子，使熒光監測系統接收到熒光信號，即DNA每擴增一次，就有一個熒光分子生成，原理如圖所示。下列有關敘述正確的是( )
A.該項技術可用來直接檢測樣本中新冠病毒核酸的含量
B.1個雙鏈DNA分子經過3輪循環一共會生成8個熒光分子
C.1個雙鏈DNA分子經過5輪循環一共需要消耗15對引物
D.該PCR技術中DNA聚合酶既催化形成磷酸二酯鍵，又催化斷裂磷酸二酯鍵
解析：A、利用熒光定量PCR技術可以進行DNA的含量測定，模板DNA越多，熒光信號越強，而新冠病毒的核酸為RNA，無法直接用該技術檢測，A錯誤；B、熒光探針只能跟模板DNA的某條鏈互補配對，DNA分子每擴增一次，就有一個熒光分子生成，3輪循環后得到8個DNA分子，即擴增形成了7個新DNA分子，一共會生成1+2+4=7個熒光分子，B錯誤；C、1個雙鏈DNA分子經過5輪循環一共會形成32個DNA分子，即形成64條鏈，其中62條鏈都是新合成的，一共需要消耗31對引物，C錯誤；D、子鏈延伸時DNA聚合酶可在子鏈的3'端不斷添加脫氧核苷酸，從而形成磷酸二酯鍵，當子鏈延伸至探針處時DNA聚合酶可以利用5'-3'外切酶活性水解DNA單鏈探針的一端，使其有關基團出現熒光，D正確。
D

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