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第1節(jié) 基因工程及其技術(shù)
【學(xué)習(xí)目標(biāo)】
1.簡(jiǎn)述基因工程的發(fā)展歷程
2.闡明基因工程所需的三種基本工具的作用
目錄
基因工程是在多學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的
壹
基因工程的基本工具
貳
積極思維
1982年，美國(guó)科學(xué)家帕米特（R. D. Palmiter，1942—）等人采用顯微注射法，將帶有大鼠生長(zhǎng)激素基因的重組DNA分子導(dǎo)入小鼠受精卵內(nèi)，將其培育成早期胚胎后再植入代孕小鼠體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育。
小鼠妊娠并成功分娩出攜帶有大鼠生長(zhǎng)激素基因的小鼠。在同樣生長(zhǎng)條件下，這種轉(zhuǎn)入大鼠生長(zhǎng)激素基因的小鼠生長(zhǎng)快、體型大，成鼠的體重是同一胎中普通小鼠的1.8倍，有“巨型小鼠”之稱。
普通小鼠（左）和巨型小鼠（右）
巨型小鼠與普通小鼠在基因組成上有什么不同？
嘗試描述培育巨型小鼠的主要過(guò)程？
基因工程是在多學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的
壹
基因工程是在多學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的
1.1957年，美國(guó)科學(xué)家科恩伯格等首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶
2.1967年，羅思和海林斯基發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)工具——質(zhì)粒(細(xì)菌除擬核外還有一種具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀DNA分子)；同年，科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶
基因工程
3.1970年，特明和巴爾的摩在RNA“腫瘤”病毒中發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶；同年，史密斯等人從流感嗜血桿菌中分離到一種特異性很強(qiáng)的限制性內(nèi)切核酸酶
4.1972年，伯格領(lǐng)導(dǎo)的研究小組在世界上首次實(shí)現(xiàn)了DNA分子體外重組
5.1973年，科恩領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，將大腸桿菌不同的質(zhì)粒重組，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了成功
基因工程
7.1976年，科學(xué)家用質(zhì)粒為載體，將生長(zhǎng)激素釋放抑制因子基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，并于1977年首次生產(chǎn)出治療肢端肥大癥、巨人癥的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子
6.科恩和博耶合作，將非洲爪蟾核糖體蛋白基因的DNA片段與大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行重組，再用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，這說(shuō)明真核生物的基因可以在原核生物中進(jìn)行表達(dá)
8.1977年，桑格測(cè)定了一種噬菌體的基因組序列，這是人類(lèi)首次對(duì)完整基因組的核苷酸排列順序進(jìn)行測(cè)定
基因工程的基本工具
貳
基因工程的基本工具
基因工程又稱為DNA重組技術(shù)，是指在體外通過(guò)人工“剪切”和“拼接”等方法，將外源目的基因與載體DNA進(jìn)行組合形成重組DNA，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使其在受體細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)。
“分子搬運(yùn)工”
“分子剪刀”
“分子黏合劑”
DNA重組技術(shù)需要的基本工具包括
基因工程的基本工具
1.“分子剪刀”——限制性內(nèi)切核酸酶（又稱限制酶）
（1）特點(diǎn)：特異性（專(zhuān)一性）很強(qiáng)
（2）作用：識(shí)別DNA 分子上特定的脫氧核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)
（3）切割方式：錯(cuò)位切和平切
基因工程的基本工具
①錯(cuò)位切：在DNA 分子兩條鏈的不同部位進(jìn)行切割，切割后形成的兩個(gè)DNA 分子片段的末端均留下一段游離的單鏈，這種單鏈稱為黏性末端。
例：限制酶EcoR I的錯(cuò)位切產(chǎn)生由4個(gè)脫氧核苷酸組成的黏性末端
基因工程的基本工具
②平切：在 DNA 分子兩條鏈上相同的部位進(jìn)行切割，切割后形成平末端。
例：限制酶Hae III的平切結(jié)果
基因工程的基本工具
在基因工程中，科學(xué)家常根據(jù)需要，采用一定的限制酶識(shí)別DNA分子上的不同序列并進(jìn)行切割。切割后的DNA分子會(huì)形成3′端黏性末端、5′端黏性末端或平末端。
限制酶 識(shí)別序列與切割部位 產(chǎn)生的末端類(lèi)型
Bbu Ⅰ 5‘-GCATGC-3’ 3’-CGTACG-5’ 3‘端黏性末端
Hind Ⅲ 5‘-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’端黏性末端
Not Ⅰ 5‘-GCGGCCGC-3’ 3’-CGCCGGCC-5’ 5’端黏性末端
EcoR Ⅰ 5‘-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 5’端黏性末端
Hpa Ⅰ 5‘-GTTAAC-3’ 3’-CAATTG-5’ 平末端
Alu Ⅰ 5‘-AGCT-3’ 3’-TCGA-5 平末端
基因工程的基本工具
1.限制酶主要存在于原核生物中，推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
提示　限制酶是原核生物的一種防御工具，用來(lái)切割侵入細(xì)胞的外源DNA，以保證自身安全。
2.為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？
提示　含某種限制酶的細(xì)菌的DNA分子不具備這種限制酶的識(shí)別序列，或者甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。
基因工程的基本工具
2.“分子黏合劑”——DNA 連接酶
①兩個(gè)具有黏性末端的DNA分子的連接
a.通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則可以將黏性末端的兩條鏈之間的堿基連接起來(lái)
b.DNA分子基本骨架之間的磷酸二酯鍵通過(guò)DNA連接酶的作用連接
②DNA連接酶的分布及作用
a.分布：廣泛存在于各種生物體內(nèi)
b.作用：在DNA復(fù)制、修復(fù)以及體內(nèi)外重組過(guò)程中起著重要作用
基因工程的基本工具
限制酶和DNA連接酶的作用示意圖
基因工程的基本工具
③種類(lèi)
種類(lèi) 來(lái)源 作用
E.coli DNA連接酶 大腸桿菌 可以用于連接具有黏性末端的DNA分子
T4 DNA連接酶 T4噬菌體 可以用于連接具有黏性末端或平末端的DNA分子
基因工程的基本工具
④與DNA相關(guān)的幾種酶的比較
比較項(xiàng)目 DNA連接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯鍵 磷酸二酯鍵 磷酸二酯鍵 氫鍵
作用對(duì)象 DNA片段 DNA 單個(gè)的脫氧核苷酸 DNA
作用結(jié)果 將兩個(gè)DNA片段連接成完整的DNA分子 切割DNA分子 將單個(gè)的脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端 將雙鏈DNA
分子局部解
旋為單鏈
基因工程的基本工具
1.下圖是4種限制酶的識(shí)別序列及其酶切位點(diǎn)，請(qǐng)思考回答下列問(wèn)題：
(1)圖中限制酶切割后產(chǎn)生黏性末端的是哪些酶？產(chǎn)生平末端的是哪些酶？如果是黏性末端，請(qǐng)畫(huà)出切割后的末端。
提示　酶1、酶2切割后為黏性末端，酶3、酶4切割后為平末端；酶1切割后的末端為：
酶2切割后的末端為：
基因工程的基本工具
(2)酶1與酶2切割后產(chǎn)生的片段能用DNA連接酶連接起來(lái)嗎？如能連接，說(shuō)明什么？
提示　能；由此說(shuō)明只要限制酶切割后產(chǎn)生的黏性末端互補(bǔ)(或相同)就可以用DNA連接酶連接起來(lái)
2.基因工程中能將DNA連接酶替換為DNA聚合酶嗎？為什么？
提示　不能；DNA聚合酶只能催化單個(gè)脫氧核苷酸加到DNA片段上，而DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接成完整的DNA分子
基因工程的基本工具
3.“分子搬運(yùn)工”——載體
將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并使其在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，還需要一定的“分子搬運(yùn)工”，基因工程上將它們稱為載體。
（1）種類(lèi)：質(zhì)粒（最早被應(yīng)用）、λ噬菌體的衍生物、動(dòng)物病毒等
（2）載體應(yīng)該具有的 DNA 序列
序列 原因
復(fù)制原點(diǎn) 使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺傳
標(biāo)記基因 用于鑒定和選擇重組DNA分子
多種限制酶的切割位點(diǎn) 供外源基因的插入
基因工程的基本工具
標(biāo)記基因的篩選原理
載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因而受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對(duì)該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。如圖所示：
基因工程的基本工具
質(zhì)粒的特點(diǎn)、本質(zhì)及作為載體所具備的條件
(1)特點(diǎn)：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子
(2)本質(zhì)：質(zhì)粒是獨(dú)立于真核細(xì)胞的細(xì)胞核或原核細(xì)胞的擬核DNA之外的小型DNA分子，不是細(xì)胞器
(3)質(zhì)粒作為載體所具備的條件
條件 原因
穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制(有復(fù)制原點(diǎn)) 目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)大
有多種限制酶切割位點(diǎn) 可攜帶多個(gè)或多種外源基因
具有特殊的標(biāo)記基因 便于重組DNA分子的鑒定和選擇
無(wú)毒害作用 避免受體細(xì)胞受到損傷
課堂小結(jié)
基因工程及其技術(shù)
基因工程是在多學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的
基因工程的基本工具
“分子搬運(yùn)工”
“分子黏合劑”
“分子剪刀”
限制酶
DNA連接酶
載體
隨堂檢測(cè)
1.用人的胰島素基因制成DNA探針檢測(cè)下列物質(zhì)，不能形成雜交分子的是( )
A.人胰島α細(xì)胞的mRNA B.人肝細(xì)胞的DNA
C.人胰島α細(xì)胞中的DNA D.人胰島β細(xì)胞的mRNA
解析：人胰島α細(xì)胞、人胰島B細(xì)胞和肝細(xì)胞中都有胰島素基因,但該基因只有在胰島B細(xì)胞中表達(dá)。用人的胰島素基因制成的DNA探針既可以與胰島素基因雜交形成雜交分子,又可以與胰島素基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA雜交形成雜交分子。
A
2.在基因工程操作中限制性內(nèi)切核酸酶是不可缺少的工具。下列關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的敘述，錯(cuò)誤的是( )
A.限制性內(nèi)切核酸酶也可以識(shí)別和剪切RNA
B.限制性內(nèi)切核酸酶可以從某些原核生物中提取
C.限制性內(nèi)切核酸酶的活性受溫度和pH等因素的影響
D.一種限制性內(nèi)切核酸酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列
解析：A、限制性內(nèi)切核酸酶也只能識(shí)別和剪切DNA,A錯(cuò)誤； B、限制性內(nèi)切核酸酶主要來(lái)自原核生物，B正確；C、酶的活性受溫度和pH等因素的影響，C正確； D、一種限制性內(nèi)切核酸酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，D正確。故選：A。
A
3.DNA重組技術(shù)需要使用多種工具酶，下圖為4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)示意圖。下列敘述正確的是( )
A.限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列只能由6個(gè)核苷酸組成
B.Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割的DNA片段可以用T4 DNA連接酶連接
C.Sma Ⅰ和EcoR V切割的DNA片段可以用E.coli DNA連接酶連接
D.Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割的DNA片段連接后，仍能被Spe Ⅰ和Xba Ⅰ識(shí)別切割
解析：A、多數(shù)限制酶識(shí)別的序列是6個(gè)核苷酸組成的，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成，A錯(cuò)誤；B、Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割的DNA片段有相同的黏性末端，可以用T4 DNA連接酶連接，B正確；C、由圖可知，Sma Ⅰ和EcoR V切出的為平末端，應(yīng)用T4 DNA連接酶連接，C錯(cuò)誤；D、由圖可知，Spe Ⅰ和Xba Ⅰ識(shí)別序列不同，Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割的DNA片段連接后，若為Spe Ⅰ切割的兩個(gè)片段連接，則不能被Xba Ⅰ切割，反之亦然，D錯(cuò)誤。
B

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