資源簡介

(共49張PPT)
§3-1 重組DNA技術的基本工具
基因工程
抗蟲棉
棉花細胞
普通棉花
(無抗蟲特征)
(含抗蟲基因)
棉花植株
(有抗蟲特征)
基因工程
抗蟲基因
提取
蘇云金芽孢桿菌（簡稱Bt）
(有抗蟲特征)
考
點
別 名 基因拼接技術
或DNA重組技術
操作環境 生物體外
操作對象 基 因
操作水平 DNA分子水平
基本過程 剪切→拼接→導入→表達
結 果 人類需要的基因產物
原 理 基因重組（廣義）
基因工程的概念考點解析：
優點：
定向改造生物體的性狀（目的性強)
基因重組的三種類型
①減數第一次分裂前期：同源染色體上的非等位基因重組
②減數第一次分裂后期：非同源染色體上的非等位基因重組
③基因工程操作導致的基因重組
①不同生物的DNA能夠進行拼接嗎？
②Bt基因在棉花細胞中能夠表達？
①基因是控制生物性狀的遺傳物質的結構和功能單位
②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則
③生物界共用一套遺傳密碼
理論基礎
蘇云
金桿菌
Bt基因
普通棉
花DNA
抗蟲棉
提取
導入
表達
能，
①DNA的基本組成單位相同
②都遵循堿基互補配對原則
③DNA分子的空間結構都是規則的雙螺旋結構
番木瓜容易受番木瓜環斑病毒的侵襲。當番木瓜被這種病毒感染后，產量會大大下降。科學家通過精心設計，用“分子工具”培育出了轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒。
到社會中去
DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。
那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？
這些“分子工具”各具有什么特征呢？
轉基因番木瓜（左）與非轉基因番木瓜（右）
“分子手術刀”
準確切割DNA分子
“分子縫合針”
“分子運輸車”
將DNA片段連接起來
將體外重組好的DNA分子導入受體細胞
限制性內切核酸酶
DNA連接酶
基因進入受體細胞的載體
【易錯警示】工具酶≠工具
基因工程的基本工具
一、限制性內切核酸酶—“分子手術刀”
切割DNA分子的工具是限制性內切核酸酶，又稱 。
1.來源：
2.種類：
主要來自原核生物
限制酶
數千種
限制酶不是一種酶，而是一類酶
3.作用特點：
專一性
能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。
限制酶
限制酶
切割的是什么？
兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵
氫鍵自動斷開
4.識別序列：
EcoR Ⅰ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
Sma Ⅰ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamH Ⅰ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T-A-G-G…5’
Taq Ⅰ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
限制酶所識別的序列的特點是：呈現堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列。
在切割部位，一條鏈從5’往3’讀的堿基順序與另一條鏈5’往3’讀的順序完全一致。
一、限制性內切核酸酶—“分子手術刀”
黏性末端　　　　
黏性末端
EcoRI限制酶的切割
只能識別GAATTC序列,并在G和A之間切開。
一.重組DNA技術的基本工具----限制酶
平末端　　　平末端
SmaI限制酶的切割
只能識別CCCGGG序列,并在C和G之間切開
一.重組DNA技術的基本工具----限制酶
一、限制性內切核酸酶—“分子手術刀”
5.切割結果：
產生黏性末端或平末端
推斷限制酶切一次：
斷開 個磷酸二酯鍵，產生 個游離的磷酸基團，產生 個黏性末端，
消耗 分子水。
兩
2
2
兩
6. 種類與命名：
現在已經從約300種微生物中分離出了約
4000種限制性內切酶(限制酶)。
EcoRⅠ
SmaⅠ
粘質沙雷氏桿菌
（Serratia marcesens）
大腸桿菌
（Escherichia coli R）
練習：流感嗜血桿菌的d菌株
( Haemophilus influenzae d )中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:
HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ
寫出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH Ⅰ:
-G
-CCTAG
*思考：你從中發現什么現象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
GATCC-
G-
Bgl Ⅱ:
EcoR Ⅰ:
-G
-CTTAA
AATTC-
G-
形成的黏性末端（從5’往3’讀）
Hind Ⅲ:
-A
-TTCGA
AGCTT-
A-
-A
-TCTAG
GATCT-
A-
同
尾
酶
1.要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？
可產生幾個黏性末端？
要切兩個切口，產生四個黏性末端。
2.如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？
會產生相同的黏性末端
3.限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？
不能。限制酶只能識別并切開雙鏈DNA分子。
思考
同種限制酶切割產生的黏性末端相同；不同限制酶切割，產生的黏性末端可能相同，也可能不同。
技巧：圖片倒轉180°，完全相同則為同一種限制酶切割
下列黏性末端最可能由同種限制酶切割而成的是( )
① ②
③ 　　　 　④
　　　　　　　　　　　　　　　　　　
A.①② B.①③ C.①④ D.②③
B
一.重組DNA技術的基本工具----限制酶
①判斷兩個末端是否為同一種限制酶切割產生的方法：將其中一個末端旋轉180度，若與另一個完全相同，則說明兩個末端是用同一種限制酶切割
②兩個末端若是由同一種限制酶切割產生的，則兩個片段連接后還具有該種限制酶的識別序列和切割位點
-G
-CCTAG
GATCT-
A-
GATCC-
G-
請判斷：以下黏性末端是由 種限制酶作用產生的。
①
②
③
3
若為同種限制酶，則切割形成的黏性末端及切割位點應相同。
【P71旁欄思考題】限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用。
原核細胞DNA中不存在限制酶的識別序列或能被識別的序列被修飾了。
【P74拓展應用1】為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？
二、DNA連接酶—“分子縫合針”
1.作用：
2.種類：
將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
類型 E.coli DNA連接酶 T4 DNA連接酶
來源
功能 只縫合____________ 縫合__________和_______________
結果 恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________ 大腸桿菌
T4噬菌體
黏性末端
黏性末端
平末端(效率低)
磷酸二酯鍵
注意：不是連接氫鍵
（氫鍵的形成不需要酶的催化）
E.coli DNA連接酶、T4 DNA連接酶
兩DNA片段要具有相同的黏性末端才能拼起來
DNA聚合酶的作用
DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？
A A T T G
A
A
A
T
T
不是，連接的對象不同
A
DNA聚合酶
A
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA連接酶 DNA聚合酶
相同點 作用實質 化學本質 不 同 點 模板
作用對象
作用結果
用途
催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵
都是蛋白質
不需要
需要DNA的一條鏈作模板
形成完整的重組DNA分子
形成DNA的一條鏈
基因工程
DNA復制
只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵
在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵
一.重組DNA技術的基本工具--DNA連接酶
旁欄思考（P72）：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？
與DNA相關的五種酶的比較
名稱 作用部位 作用對象 作用結果
限制酶
DNA連接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯鍵
磷酸二酯鍵
磷酸二酯鍵
磷酸二酯鍵
堿基對之間
的氫鍵
DNA
DNA片段
單個的脫氧
核苷酸
DNA
DNA
將DNA切成兩個片段，形成
黏性末端或平末端
將兩個DNA片段連接為一個DNA分子
將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端，形成新的DNA分子
將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸
將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈
思考3：Bt基因是否可以直接導入到棉花細胞（受體細胞）？為什么？
否，目的基因直接導入受體細胞可能會被細胞中的酶降解或不能復制、表達。
思考4：有沒有什么DNA分子可以進入宿主細胞并復制表達？
三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”
1.作用：
2.種類：
質粒、噬菌體和動植物病毒等。
將目的基因轉入受體細胞，在受體細胞內對目的基因進行大量復制。
種類 用途 不同點
質粒、噬菌體
植物病毒 動物病毒 將外源基因導入大腸桿菌
等受體細胞
將外源基因導入植物細胞
將外源基因導入動物細胞
來源不同，在大小、結構、復制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別
3.最常用的載體——質粒
一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環狀雙鏈DNA分子。
標記基因
其基因屬于細胞質基因。
三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”
標記基因：①抗生素抗性基因②熒光蛋白基因
三、基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”
4.運載體需具備的條件：
①在受體細胞中穩定存在并能自我復制
或整合到受體DNA上，隨受體DNA同
步復制；
②有一個至多個限制酶切割位點，
便于插入（攜帶）目的基因；
③具有標記基因，便于篩選含有重組
DNA分子的細胞；
④對受體細胞無害、易分離。
真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。
霍亂弧菌的質粒有多個限制酶切位點，你會用它做載體嗎？
如何確定目的基因是否進入受體細胞了？
載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內表達，受體細胞對該抗生素產生抗性。在含有該抗生素的培養基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞。
標記基因的篩選原理
思考·討論：重組DNA分子
請你根據圖3-3中的相關信息找到兩條片段上EcoRI 的識別序列和切割位點。 然后，用剪刀進行“切割”。待切割位點全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來。
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
1、剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。
如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。
不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。
2、你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對？如果不能，可能是什么原因造成的？
3、你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
4、從以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子時，需用限制酶切割____次此DNA分子，產生____個黏性末端。
2
4
鏈狀DNA分子
1個酶切割位點，若用限制酶完全切割完后形成____個DNA片段
2個酶切割位點，若用限制酶完全切割完后形成____個DNA片段
環狀DNA分子
1個酶切割位點，若用限制酶完全切割完后形成____個DNA片段
2個酶切割位點，若用限制酶完全切割完后形成____個DNA片段
2
3
2
1
用相同的限制酶切割目的基因和運載體。
產生相同末端，便于連接。
5.目的基因是要與運載體結合的，那如何
處理質粒？
★重組質粒的形成：
用相同的限制酶處理目的基因和運載體，獲得相同的末端，然后用DNA連接酶對其進行連接。
思考討論
思考：
1.如果用一種限制酶分別切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶處理后會出現幾種產物？(只考慮兩兩結合)
①目的基因-目的基因連接
③目的基因-質粒連接
②質粒-質粒連接
④目的基因自身環化
⑤質粒自身環化
結論：為避免目的基因和質粒的自身環化及目的基因與質粒的反向連接，可使用兩種不同的限制酶切割目的基因和質粒
雙酶切法
技能提升
(1)獲取目的基因和切割載體時, 通常使用同種限制酶,目的是為了
。但是使用該法缺點是容易發生
以及 ，為了避免上述情況發生，可采取的措施是
。
產生相同的黏性末端，便于連接
目的基因與質粒反向連接
目的基因、質粒的自身環化
分別使用兩種限制酶（雙酶切法）去切割目的基因和載體
(2)獲取一個目的基因需限制酶切割 次,共產生 個游離的磷酸基團。
兩
4
思考討論
(3)選擇限制酶切割位點的基本原則：
①切割目的基因時： 。
②切割質粒時： 。
能切下目的基因且不破壞目的基因
至少保留一個完整的標記基因，便于篩選
思考討論
限制酶
DNA連接酶
載體
①對受體細胞無害；
②有一個至多個限制酶切割位點；
③有特殊的標記基因；
④能自我復制或能整合到宿主DNA上。
質粒、 λ噬菌體衍生物 、動植物病毒
基因工程的基本工具
作為載體的條件
種類:
磷酸二酯鍵
來源：
主要來源于原核生物
特點：
作用部位：
具有專一性
結果：
形成黏性末端或平末端
連接部位：磷酸二酯鍵
種類： E.coliDNA連接酶、T4 DNA連接酶
作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來
課堂小結
DNA的粗提取與鑒定
0
0.14
NaCI濃度（mol/L）
1.實驗原理
利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
DNA不溶于酒精，
但某些蛋白質溶于酒精
DNA能溶于物質的量濃度為2 mol/L的NaCl溶液
在一定溫度下，
DNA被二苯胺試劑染成藍色
初步分離DNA和蛋白質
溶解DNA
鑒定DNA
DNA的粗提取與鑒定
2.材料用具
（1）材料：
富含DNA的材料(如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜和豬肝等)、研磨液、體積分數為95％的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。
（2）用具：
燒杯、量筒、玻璃棒、研缽、紗布、漏斗、試管、試管架、試管夾、酒精燈、石棉網、三腳架、火柴、刀片和天平等。
不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白質變性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl緩沖液 穩定DNA
析出DNA
溶解DNA
鑒定DNA
3.方法步驟
（1）通過研磨釋放 DNA
稱取約30g 洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10 mL 研磨液，充分研磨（可加入少量石英砂助研）。
①研磨的目的：
②研磨時間不宜太長：
③有條件的可以在材料處理的過程中加入纖維素酶、果膠酶：
④研磨不宜太用力
DNA的粗提取與鑒定
破碎細胞，使核物質容易溶解在研磨液中
防止研磨時產生的熱量影響DNA的提取量
研磨效果好（有利于充分研磨）
3.方法步驟
（2）過濾獲取含DNA的上清液
DNA的粗提取與鑒定
可能含有核蛋白、多糖等雜質
在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可以直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500 r / min 的轉速下離心5 min ，再取上清液放入燒杯中。
過濾能用濾紙代替嗎？
低溫放置幾分鐘的作用：
①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；
②抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；
③低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少其斷裂。
不可以，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失。
在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數為95%),靜置2~3 min,溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌,卷起絲狀物,并用濾紙吸去上面的水分;或者將溶液倒入塑料離心管中,在10000r/min的轉速下離心5min,棄上清液,將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子。
①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
②低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。
③使蛋白質溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
（3）冷卻酒精析出DNA
3.方法步驟
DNA的粗提取與鑒定
（4）DNA的鑒定
取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。
加入2mol/L氯化鈉溶液
不加入絲狀物
加入4mL二苯胺試劑
加入2mol/L氯化鈉溶液
加入絲狀物
加入4mL二苯胺試劑
實驗組
水浴加熱
對照組
溶液藍色的深淺與溶液中DNA的含量的多少有關
3.方法步驟
DNA的粗提取與鑒定
4.結果分析
DNA的粗提取與鑒定
鑒定結果不明顯的可能原因：
①材料中的核物質沒有充分釋放出來，如研磨不充分或蒸餾水的量不夠。②加入酒精后搖動或攪拌時過猛，DNA被破壞。
③二苯胺最好現用現配，否則二苯胺變色，影響鑒定效果。
1.怎么確認實驗提取出來的是DNA所含雜質較少？若鑒定結果呈現藍色比
較淺，說明什么問題？
觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多。
4.進一步探究
DNA的粗提取與鑒定
為了提純DNA，某同學提出以下實驗方案，請分析原因：
操作2:上述得到的DNA提取液，緩緩加入蒸餾水，調節NaCl溶液的濃度為0.14mol/L，玻璃棒攪拌，析出DNA。
操作1:得到的DNA粗提取物（絲狀物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，過濾，取濾液（DNA提取液）。
用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽溶液中不能溶解的雜質；
用低鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。
因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。
5.進一步探究
0
0.14
NaCI濃度（mol/L）
DNA的粗提取與鑒定
5.進一步探究
方法二：可以先添加質量分數為25%的SDS溶液，使蛋白質變性后與DNA分開；隨后，加入氯仿—異丙醇混合液(體積比為24：1)，通過離心將蛋白質及其他雜質除去，取上清液；可重復上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。
方法三：由于苯酚可以迅速使蛋白質變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時DNA溶于上層水相，蛋白質變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實驗用具就可以將兩者分開。
練習與應用
一、概念檢測
1. DNA連接酶是重組DNA技術常用的一種工具酶。下列相關敘述正確的是（ ）
A．能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵
B．能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵
C．能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵
D．只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端
2．在重組DNA技術中，將外源基因送入受體細胞的載體可以是（ ）
A．大腸桿菌的質粒 B．切割DNA分子的酶
C．DNA片段的黏性末端 D．用來識別特定基因的DNA探針
C
A
【擴展應用】有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ進行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ, XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進行切割。各限制酶的識別序列和切割位點如下。
(1)哪種限制酶切割B片段產生的DNA片段能與限制酶speⅠ切割A片段產生的DNA片段相連接？為什么？
XbaⅠ。
因為XbaⅠ與SpeⅠ切割產生了相同的黏性末端。
(2)不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義？
識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。同尾酶使構建載體時，切割位點的選擇范圍擴大。
例如，我們選擇了用某種限制酶切割載體，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有該限制酶的識別序列，那么用該限制酶切割含有目的基因的DNA片段時，目的基因就很可能被切斷；這時可以考慮用合適的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的識別序列）來獲取目的基因。
練習與應用

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