資源簡介

第二節(jié)　純凈的目標微生物可通過分離和純化獲得
第1課時　目標微生物的分離和純化
[學習目標]　1.概述分離和純化微生物的平板劃線法和稀釋涂布平板法。2.嘗試分離和純化酵母菌。
一、采用劃線或涂布的接種方法能夠?qū)崿F(xiàn)對目標微生物的分離和純化
1．單菌落：在________培養(yǎng)基上采用劃線或稀釋涂布的方法接種，通過培養(yǎng)獲得的由____________________分裂形成的、______________________的、有一定形態(tài)構(gòu)造的子細胞集團。
2．目標微生物分離和純化的兩種方法
提醒　(1)扇形劃線：從培養(yǎng)基上的一點出發(fā)，向多方向多次劃線，每劃一條線都要將接種環(huán)在酒精燈的火焰上滅菌，然后再次從同一起點變換方向劃線。
(2)多次連續(xù)平行劃線：劃線分3～4次進行。將培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)一定角度后，不需再次蘸取菌種，只需在上一次劃線的末端區(qū)域直接開始劃線即可。
(3)稀釋涂布平板法：接種時，通常需要先將菌液進行梯度稀釋，并在培養(yǎng)皿側(cè)面或底面做好標記。
判斷正誤
(1)采用劃線的方法接種時，每劃一條線前接種環(huán)都要灼燒滅菌(　　)
(2)多次連續(xù)平行劃線時，接種環(huán)已滅菌，整個劃線過程中不再滅菌(　　)
(3)與平板劃線法相比，稀釋涂布平板法分散細菌得到單菌落的效果更好(　　)
任務(wù)一：微生物的分離和純化的原理
1．多次連續(xù)平行劃線法的操作中，在進行第二次及之后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因：劃線后，線條末端菌種的數(shù)目比線條起始處要____，每次從上一次劃線的末端開始，能使菌種的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步________，最終能得到由________細胞繁殖而來的菌落。
2．為什么最后一次劃線與第一次的劃線不能相連？
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3．稀釋涂布平板法也是常用的微生物分離和純化方法。某同學欲通過稀釋涂布平板法了解某牛奶中大腸桿菌的含量，進行了相關(guān)的實驗操作。請分析回答下列問題：
(1)如何獲得該牛奶的10倍、100倍、1 000倍稀釋液？
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(2)接種前，該同學將表面殘留著少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上灼燒，這樣做的目的是什么？
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(3)該同學應(yīng)如何確定哪些菌落是大腸桿菌的單菌落？
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　平板劃線操作中三種灼燒的目的
項目 目的
蘸取菌液前灼燒 避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染菌種
每次劃線前灼燒 殺死上一次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時接種環(huán)上的菌種直接來源于上一次劃線的末端
劃線操作結(jié)束后灼燒 及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免菌種污染環(huán)境和感染操作者
1．(2024·寧波北侖中學高二期中)在分離、純化細菌的實驗中，劃線接種(甲)、培養(yǎng)結(jié)果(乙)如圖，a、b、c、d是劃線的四個區(qū)域。下列有關(guān)敘述錯誤的是(　　)
A．操作過程中，接種環(huán)蘸取菌液1次，至少需灼燒5次
B．連續(xù)劃線的目的是獲得單個細胞形成的菌落
C．蘸取菌液和劃線要在酒精燈火焰旁進行
D．圖甲中的a區(qū)域為劃線的起始區(qū)域
2．圖甲所示是稀釋涂布平板法中的部分操作，圖乙所示是平板劃線法的操作結(jié)果。下列相關(guān)敘述錯誤的是(　　)
A．圖甲中涂布前要將涂布器灼燒，冷卻后才能涂布菌液
B．對于濃度較高的菌液，若圖甲中的最高稀釋倍數(shù)僅為102，則所得到的菌落不一定是由單個的細胞繁殖而成的
C．圖乙所示培養(yǎng)皿中每個劃線區(qū)域都可得到符合要求的菌落
D．圖乙中連續(xù)劃線的起點是上一次劃線的末端(除第一次劃線外)
二、活動：接種、培養(yǎng)并分離酵母菌
1．目的要求
(1)用____________法或稀釋涂布平板法接種酵母菌。
(2)用________培養(yǎng)基大量擴增酵母菌。
2．方法步驟
判斷正誤
(1)用記號筆標記培養(yǎng)皿中菌落時，應(yīng)標記在皿底上(　　)
(2)用接種環(huán)取出菌種后需馬上塞上裝菌種試管的棉塞，然后再劃線(　　)
(3)用固體培養(yǎng)基更容易大量擴增酵母菌(　　)
任務(wù)二：酵母菌培養(yǎng)過程的注意事項和結(jié)果分析
1．如何判斷培養(yǎng)基是否被雜菌污染？
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2．如果培養(yǎng)基出現(xiàn)不同顏色特征的菌落，你認為出現(xiàn)的原因是什么？
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3．僅從菌落特征是否能夠認定你分離出了酵母菌？怎么進行進一步鑒定？
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4．判斷液體培養(yǎng)基中接種酵母菌成功的依據(jù)是什么？
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5．平板倒置的目的是什么？
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6．制作平板和平板劃線法接種時，哪些操作可防止雜菌污染？
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　實驗結(jié)果的分析
(1)培養(yǎng)未接種的培養(yǎng)基的目的是檢查培養(yǎng)基制備是否合格。未接種的培養(yǎng)基表面若有菌落生長，則說明培養(yǎng)基被污染，應(yīng)該重新制備；若無菌落生長，則說明培養(yǎng)基未被污染。
(2)在接種酵母菌的固體培養(yǎng)基上可觀察到獨立的菌落，這些菌落在顏色、形狀和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在固體培養(yǎng)基中觀察到不同形態(tài)的菌落，原因可能是菌種不純，混入了其他雜菌，或在實驗操作過程中被雜菌污染。
3．將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基都放入37 ℃恒溫箱的目的是(　　)
A．對比觀察培養(yǎng)基的成分是否相同
B．對比分析培養(yǎng)基是否被雜菌污染
C．沒必要放入未接種的培養(yǎng)基
D．為了下次接種時再使用
4．平板劃線法接種酵母菌時，下列操作正確的是(　　)
A．每次劃線時，接種環(huán)都需要蘸取菌液一次
B．劃線分離結(jié)束后接種環(huán)無需再進行滅菌
C．在超凈工作臺上接種時要在酒精燈火焰旁進行
D．劃線分離后將培養(yǎng)皿正放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
答案精析
一、梳理教材新知
1．固體　一個細胞　肉眼可見
2．微生物　連續(xù)平行　扇形　梯度稀釋　固體　涂布器　劃線的尾部　稀釋度適當　多次連續(xù)平行
判斷正誤
(1)√　(2)×　(3)√
探究核心知識
1．少　減少　單個
2．最后一次劃線已經(jīng)將菌種稀釋成單個的細胞，如果與第一次的劃線相連則增加了菌種的數(shù)目，達不到純化的效果。
3．(1)向1 mL牛奶中加入9 mL無菌水，獲得10倍稀釋液；再取1 mL 10倍稀釋液，加入9 mL無菌水，獲得100倍稀釋液；取1 mL的100倍稀釋液加入9 mL無菌水，獲得1 000倍稀釋液。
(2)避免涂布器上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基，影響實驗結(jié)果。
(3)根據(jù)大腸桿菌菌落特有的形狀、大小、顏色、邊緣、表面光滑與否等特征進行確定。
落實思維方法
1．D　[操作過程中，接種環(huán)蘸取菌液1次，劃線了4次，至少需灼燒5次，A正確；連續(xù)劃線可以將聚集的菌種逐步稀釋，以便獲得由單個細胞生長繁殖成的單菌落，B正確；為了防止空氣中雜菌的污染，蘸取菌液和劃線都要在酒精燈火焰旁進行，C正確；分析圖乙可知，a對應(yīng)的區(qū)域出現(xiàn)了單菌落，d對應(yīng)區(qū)域菌落最多，因此a區(qū)域應(yīng)該為劃線的最終區(qū)域，d區(qū)域為劃線的起始區(qū)域，D錯誤。]
2．C　[平板劃線法中多次劃線的目的是降低菌種濃度，經(jīng)過連續(xù)劃線才有可能得到由單個細胞繁殖而成的單菌落，這種菌落才符合要求，C錯誤。]
二、梳理教材新知
1．(1)平板劃線　(2)液體
2．底部　灼燒滅菌　培養(yǎng)容器內(nèi)壁　稀釋　中央　不接種菌液　斜面
判斷正誤
(1)√　(2)×　(3)×
探究核心知識
1．培養(yǎng)未接種的培養(yǎng)基，觀察是否有菌落生長。如果有，說明培養(yǎng)基被雜菌污染。
2．可能是接種的菌種不純或者無菌操作不規(guī)范等。
3．不能。可以利用生化實驗及顯微鏡觀察來進一步鑒定，如①挑取單菌落接入糖水中，培養(yǎng)一段時間檢查是否能產(chǎn)生酒味；②接入面團中觀察能否發(fā)面；③挑取菌落樣品，制作臨時裝片，在顯微鏡下觀察、識別。
4．和對照組相比，培養(yǎng)基變渾濁。
5．防止水分過度揮發(fā)；防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基。
6．(1)倒平板：①要使三角瓶的瓶口通過酒精燈火焰；②不要讓培養(yǎng)基濺在培養(yǎng)皿內(nèi)壁與皿蓋上；③用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，將培養(yǎng)基倒入，立即蓋上皿蓋。
(2)平板劃線法接種：①在酒精燈火焰旁劃線；②接種前將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒；③取菌液前后，要將試管口通過酒精燈火焰；④劃線時將培養(yǎng)皿的皿蓋打開一條縫隙，用接種環(huán)在培養(yǎng)皿表面迅速劃線，劃線后及時蓋上皿蓋。
落實思維方法
3．B　[對未接種的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，起到對照作用，可確定培養(yǎng)基是否被雜菌污染。]
4．C　[劃線分離時，菌種只蘸取一次，A錯誤；劃線分離結(jié)束后，接種環(huán)仍需進行灼燒滅菌，B錯誤；微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵是無菌操作，在超凈工作臺上接種時，需要在酒精燈火焰旁進行，以防止空氣中微生物的污染，C正確；劃線分離結(jié)束后，培養(yǎng)皿應(yīng)倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，D錯誤。]第2課時　微生物的數(shù)量測定和選擇培養(yǎng)
[學習目標]　1.概述測定微生物數(shù)量的稀釋涂布平板法和顯微鏡計數(shù)法。2.舉例說明通過調(diào)整培養(yǎng)基的配方，可有目的地培養(yǎng)某種微生物。3.嘗試分離和計數(shù)能分解尿素的微生物。
一、稀釋涂布平板法和顯微鏡計數(shù)法可測定微生物的數(shù)量
1．稀釋涂布平板法測定微生物數(shù)量
2．顯微鏡計數(shù)法
判斷正誤
(1)稀釋涂布平板法中，隨機抽取某個稀釋度的培養(yǎng)基，統(tǒng)計菌落數(shù)(　　)
(2)將不同稀釋度的3個平板統(tǒng)計菌落數(shù)后求平均值(　　)
(3)如果小方格內(nèi)酵母細胞數(shù)目過多，應(yīng)當對菌液進行稀釋(　　)
任務(wù)一：稀釋涂布平板法測定微生物的數(shù)量
1．兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果：甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230；乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。
(1)稀釋涂布平板法測定微生物數(shù)量的原理是什么？
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(2)兩位同學的統(tǒng)計結(jié)果是否可靠？若不可靠，應(yīng)如何改進？
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(3)統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低，為什么？
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2．某同學在三種稀釋倍數(shù)下吸取0.1 mL的稀釋菌液涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)，得到以下的數(shù)據(jù)，試計算1 mL菌液中活菌數(shù)(一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板進行計數(shù))。
稀釋倍數(shù) 菌落數(shù)
平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
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任務(wù)二：顯微鏡計數(shù)法
1．一次取樣后，將樣液稀釋10倍，采用如圖1所示血細胞計數(shù)板計數(shù)，在顯微鏡下觀察到如圖2所示的現(xiàn)象(“”表示酵母菌)。
對圖2的中方格中的酵母菌計數(shù)時，最佳計數(shù)路徑是a～d中的哪一種？若以圖2的計數(shù)結(jié)果作為應(yīng)計數(shù)的5個中方格的平均值，則此樣液中酵母菌的密度是多少？
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2．為什么顯微鏡計數(shù)法統(tǒng)計的菌數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目要多？
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　稀釋涂布平板法測定微生物數(shù)量
(1)統(tǒng)計依據(jù)：平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中的活菌數(shù)。
(2)誤差分析：菌落太少說明稀釋倍數(shù)太大，各平板之間菌落數(shù)差異會很大(多一個菌落，乘以稀釋倍數(shù)誤差就大了)，造成誤差。數(shù)量太多的菌落的生長受到抑制，菌落之間營養(yǎng)競爭較大，可導致某些菌落營養(yǎng)不良影響計數(shù)，并且難以區(qū)分各個菌落，無法準確計數(shù)，造成誤差。
(3)結(jié)果分析：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比實際數(shù)目少，因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
1．某同學對101、102、103倍稀釋液計數(shù)的平均菌落數(shù)分別是2 760、295和16，則菌落總數(shù)為(所用稀釋液體積為0.1 mL)(　　)
A．2.76×104個/mL
B．2.95×105個/mL
C．4.6×104個/mL
D．3.775×104個/mL
2．(2024·紹興高二校考)下列對液體培養(yǎng)基中的酵母菌進行計數(shù)的方法，描述不正確的是(　　)
A．可以用顯微鏡直接計數(shù)，需要血細胞計數(shù)板，但數(shù)據(jù)可能偏大
B．也可以用培養(yǎng)菌落的方法進行計數(shù)，但數(shù)據(jù)可能偏大
C．無論用哪種方法計數(shù)，都必須進行濃度梯度稀釋
D．無論用哪種方法計數(shù)，都必須多次計數(shù)求平均值
二、調(diào)整培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)方式可有目的地培養(yǎng)某種微生物
1．選擇培養(yǎng)基
2．活動：能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)
(1)實驗原理
(2)方法步驟
提醒　①LB固體培養(yǎng)基的成分：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂和水。
②尿素固體培養(yǎng)基的成分：葡萄糖、氯化鈉、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖和水。
③瓊脂和瓊脂糖之間的主要區(qū)別在于瓊脂是從紅藻中獲得的凝膠狀物質(zhì)(含N)，而瓊脂糖是從瓊脂或紅藻中純化的線性聚合物(不含N)，瓊脂糖是瓊脂的主要成分，占瓊脂的70%以上。 瓊脂糖在細菌培養(yǎng)中非常有用。
判斷正誤
(1)選擇培養(yǎng)基只允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他微生物的生長(　　)
(2)分離能分解尿素的微生物時，培養(yǎng)基中尿素作為唯一氮源(　　)
(3)配制的尿素固體培養(yǎng)基在滅菌后再加入尿素溶液，因為尿素高溫易分解(　　)
(4)相同稀釋度下，尿素固體培養(yǎng)基的菌落數(shù)比LB固體培養(yǎng)基多(　　)
任務(wù)三：用功能不同的培養(yǎng)基分離與鑒別微生物
按功能劃分，可以把培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。鑒別培養(yǎng)基是指根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學試劑配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物的培養(yǎng)基。據(jù)此回答以下問題。
1．根據(jù)教材“活動”中尿素固體培養(yǎng)基的配制，回答下列問題：
(1)從物理特征看，該培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基，從功能上看屬于________培養(yǎng)基。
(2)尿素固體培養(yǎng)基是如何實現(xiàn)對能分解尿素的細菌的篩選的？
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(3)在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基中分離出的微生物都是能分解尿素的嗎？
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2．已知剛果紅是一種染料，它可以與纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發(fā)生這種反應(yīng)。當在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅與纖維素形成紅色復合物；而當纖維素被纖維素分解菌分解后，復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以這些菌為中心的透明圈。請回答下列問題：
(1)現(xiàn)在要從土壤中分離纖維素分解菌，請你給出實驗方案。
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(2)怎么比較纖維素分解菌的分解能力？
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　幾種選擇培養(yǎng)基的設(shè)計
特性 主要用途 設(shè)計原理
加入青霉素 分離酵母菌等真菌 青霉素能抑制細菌生長，對真菌無作用
不加氮源 分離固氮微生物 固氮微生物能利用空氣中的氮氣
不加碳源 分離自養(yǎng)型微生物 自養(yǎng)型微生物能利用無機碳源
3．(2023·湖州高二期末)下列有關(guān)微生物篩選的敘述中，不正確的是(　　)
A．利用高溫條件篩選耐熱的Taq細菌
B．加入青霉素可以篩選出對青霉素有抗性的細菌
C．含酚紅的尿素培養(yǎng)基初步鑒別出分解尿素的細菌
D．篩選分解尿素的細菌時應(yīng)以尿素作為培養(yǎng)基中的唯一營養(yǎng)物質(zhì)
4．如圖為“能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)”的部分實驗結(jié)果，下列敘述正確的是(　　)
A．圖中采用平板劃線法接種
B．圖中①和②表示尿素培養(yǎng)基長出的菌落
C．圖中③④培養(yǎng)基中菌落生長代謝時，會釋放CO2
D．實驗結(jié)果表明，自然界中能合成脲酶的微生物比例較高
答案精析
一、梳理教材新知
1．3　減小　平均值
2．計數(shù)板　蓋玻片邊緣　紅細胞　五點取樣　不數(shù)下　數(shù)左　3　80個小方格細胞總數(shù)/80×400×10 000×稀釋倍數(shù)
判斷正誤
(1)×　(2)×　(3)√
提示　(1)在每一個梯度濃度內(nèi)，至少要涂布 3 個平板，一般選擇菌落數(shù)在 30～300 的進行記數(shù)，求其平均值。(2)應(yīng)隨機抽取相同稀釋度的3個平板統(tǒng)計菌落數(shù)后求平均值。
探究核心知識
任務(wù)一
1．(1)當稀釋倍數(shù)適當時，在固體培養(yǎng)基表面能得到由單個細胞生長繁殖成的單菌落；通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中的活菌數(shù)。
(2)都不可靠。甲同學應(yīng)設(shè)置重復實驗，在同一稀釋度下至少涂布3個平板，統(tǒng)計結(jié)果后計算平均值。乙同學的其中一個平板菌落數(shù)為21，與另外兩組數(shù)值相差太大，意味著操作有誤，需要重新實驗。
(3)因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
2．105的稀釋倍數(shù)下取0.1 mL的稀釋菌液涂布的三個平板上的菌落數(shù)在30～300之間，計算其平均值為(212＋234＋287)/3≈244(個)。進一步可以換算出1 mL菌液中活菌數(shù)為(244÷0.1)×105＝2.44×108(個)。
任務(wù)二
1．據(jù)圖分析可知，a圖所示的計數(shù)方法從頭到尾，一氣呵成，計數(shù)過程中不會出現(xiàn)漏記與重復計數(shù)，而其余幾種計數(shù)方法中都有多條計數(shù)路徑，需要將各路徑的數(shù)據(jù)相加，容易出現(xiàn)漏記與重復計數(shù)，因此對圖2的中方格中酵母菌計數(shù)時，最佳計數(shù)路徑是a。據(jù)圖分析，圖2含有酵母菌25個，若以該計數(shù)結(jié)果作為應(yīng)計數(shù)的5個中方格的平均值，則此樣液中酵母菌的密度＝25×25×10 000×10＝6.25×107(個·mL－1)。
2．因為顯微鏡計數(shù)法不能區(qū)分死菌和活菌。
落實思維方法
1．B　[某同學在101、102、103倍稀釋的平均菌落數(shù)為2 760、295和16，為保證結(jié)果準確，一般應(yīng)選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，故數(shù)值為295，稀釋倍數(shù)為102，則每毫升菌落總數(shù)為295×102÷0.1＝2.95×105(個)。]
2．B　[對液體培養(yǎng)基中的酵母菌進行計數(shù)可以用顯微鏡直接計數(shù)，需要血細胞計數(shù)板，由于不能區(qū)分死菌和活菌，數(shù)據(jù)可能偏大，A正確；對液體培養(yǎng)基中的酵母菌進行計數(shù)可以用培養(yǎng)菌落的方法進行計數(shù)，當兩個或多個酵母菌連在一起時，繁殖后會形成一個菌落，可能會導致數(shù)據(jù)偏小，B錯誤；無論用哪種方法計數(shù)，都必須進行濃度梯度稀釋，并多次計數(shù)求平均值，C、D正確。]
二、梳理教材新知
1．添加(或減去)　特定　其他　抗性　敏感　固氮　目標微生物　特定的細胞
2．(1)尿素　脲酶　氨　黃　酚紅指示劑　紅色　強
(2)G6玻璃砂漏斗　60 ℃　99　1　底部　移液器　由大到小　0.1　酒精燈火焰　均勻　恒溫培養(yǎng)箱
判斷正誤
(1)√　(2)√　(3)√　(4)×
提示　(4)LB固體培養(yǎng)基為全營養(yǎng)培養(yǎng)基，尿素固體培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基，可淘汰不能以尿素為氮源進行固氮的微生物，因此尿素固體培養(yǎng)基的菌落數(shù)比LB固體培養(yǎng)基少。
探究核心知識
1．(1)固體　選擇
(2)該培養(yǎng)基中的唯一氮源為尿素，只有能分泌脲酶的微生物才能夠分解尿素，而不能分泌脲酶的微生物不能分解尿素，會因缺乏氮源而無法生長繁殖，所以用該培養(yǎng)基能夠篩選出分解尿素的細菌。
(3)不都是，有些菌落可能是自生固氮微生物，而不是能分解尿素的微生物。
2．(1)用“纖維素作為唯一碳源”的選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入剛果紅進行鑒別。在培養(yǎng)基上形成透明圈的菌落即為纖維素分解菌。
(2)透明圈直徑與菌落直徑比值越大，說明該菌落分解纖維素的能力越強。
落實思維方法
3．D　[耐熱的Taq細菌可以生存在高溫環(huán)境中，所以可以利用高溫條件篩選耐熱的Taq細菌，A正確；尿素分解菌可以將尿素分解成氨使酚紅指示劑呈紅色，C正確；篩選分解尿素的細菌時應(yīng)以尿素作為培養(yǎng)基中的唯一氮源，同時也要加入其他營養(yǎng)物質(zhì)，D錯誤。]
4．C　[根據(jù)實驗結(jié)果可知，圖中采用的接種方法為稀釋涂布平板法，A錯誤；圖中①和②的稀釋度等于③和④，但菌落數(shù)卻明顯多于③④，很可能是LB培養(yǎng)基上長出的菌落，B錯誤；根據(jù)實驗結(jié)果，判斷自然界中能合成脲酶的微生物比例較低，D錯誤。](共74張PPT)
第一章 發(fā)酵工程
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第2課時
微生物的數(shù)量測定和選擇培養(yǎng)
學習目標
1.概述測定微生物數(shù)量的稀釋涂布平板法和顯微鏡計數(shù)法。
2.舉例說明通過調(diào)整培養(yǎng)基的配方，可有目的地培養(yǎng)某種微生物。
3.嘗試分離和計數(shù)能分解尿素的微生物。
內(nèi)容索引
一、稀釋涂布平板法和顯微鏡計數(shù)法可測定微生物的數(shù)量
課時對點練
二、調(diào)整培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)方式可有目的地培養(yǎng)某種微生物
稀釋涂布平板法和顯微鏡計數(shù)法可測定微生物的數(shù)量
一
梳理　教材新知
1.稀釋涂布平板法測定微生物數(shù)量
3
減小
平均值
2.顯微鏡計數(shù)法
計數(shù)板
蓋玻片邊緣
紅細胞
五點取樣
不數(shù)下
數(shù)左
3
80個小方格細胞
總數(shù)/80×400×10 000×稀釋倍數(shù)
(1)稀釋涂布平板法中，隨機抽取某個稀釋度的培養(yǎng)基，統(tǒng)計菌落數(shù)
(　　)
×
提示　在每一個梯度濃度內(nèi)，至少要涂布 3 個平板，一般選擇菌落數(shù)在 30～300 的進行記數(shù)，求其平均值。
(2)將不同稀釋度的3個平板統(tǒng)計菌落數(shù)后求平均值(　　)
×
提示　應(yīng)隨機抽取相同稀釋度的3個平板統(tǒng)計菌落數(shù)后求平均值。
(3)如果小方格內(nèi)酵母細胞數(shù)目過多，應(yīng)當對菌液進行稀釋(　　)
√
任務(wù)一：稀釋涂布平板法測定微生物的數(shù)量
1.兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果：甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230；乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。
探究　核心知識
(1)稀釋涂布平板法測定微生物數(shù)量的原理是什么？
提示　當稀釋倍數(shù)適當時，在固體培養(yǎng)基表面能得到由單個細胞生長繁殖成的單菌落；通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中的活菌數(shù)。
(2)兩位同學的統(tǒng)計結(jié)果是否可靠？若不可靠，應(yīng)如何改進？
提示　都不可靠。甲同學應(yīng)設(shè)置重復實驗，在同一稀釋度下至少涂布3個平板，統(tǒng)計結(jié)果后計算平均值。乙同學的其中一個平板菌落數(shù)為21，與另外兩組數(shù)值相差太大，意味著操作有誤，需要重新實驗。
(3)統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低，為什么？
提示　因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
2.某同學在三種稀釋倍數(shù)下吸取0.1 mL的稀釋菌液涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)，得到以下的數(shù)據(jù)，試計算1 mL菌液中活菌數(shù)(一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板進行計數(shù))。
稀釋倍數(shù) 菌落數(shù)
平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
提示　105的稀釋倍數(shù)下取0.1 mL的稀釋菌液涂布的三個平板上的菌落數(shù)在30～300之間，計算其平均值為(212＋234＋287)/3≈244(個)。進一步可以換算出1 mL菌液中活菌數(shù)為(244÷0.1)×105＝2.44×108(個)。
任務(wù)二：顯微鏡計數(shù)法
1.一次取樣后，將樣液稀釋10倍，采用如圖1所示血細胞計數(shù)板計數(shù)，在顯微鏡下觀察到如圖2所示的現(xiàn)象(“　”表示酵母菌)。
對圖2的中方格中的酵母菌計數(shù)時，最佳計數(shù)路徑是a～d中的哪一種？若以圖2的計數(shù)結(jié)果作為應(yīng)計數(shù)的5個中方格的平均值，則此樣液中酵母菌的密度是多少？
提示　據(jù)圖分析可知，a圖所示的計數(shù)方法從頭到尾，一氣呵成，計數(shù)過程中不會出現(xiàn)漏記與重復計數(shù)，而其余幾種計數(shù)方法中都有多條計數(shù)路徑，需要將各路徑的數(shù)據(jù)相加，容易出現(xiàn)漏記與重復計數(shù)，因此對圖2的中方格中酵母菌計數(shù)時，最佳計數(shù)路徑是a。據(jù)圖分析，圖2含有酵母菌25個，若以該計數(shù)結(jié)果作為應(yīng)計數(shù)的5個中方格的平均值，則此樣液中酵母菌的密度＝25×25×10 000×10＝6.25×107(個·mL－1)。
2.為什么顯微鏡計數(shù)法統(tǒng)計的菌數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目要多？
提示　因為顯微鏡計數(shù)法不能區(qū)分死菌和活菌。
核心歸納
稀釋涂布平板法測定微生物數(shù)量
(1)統(tǒng)計依據(jù)：平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中的活菌數(shù)。
(2)誤差分析：菌落太少說明稀釋倍數(shù)太大，各平板之間菌落數(shù)差異會很大(多一個菌落，乘以稀釋倍數(shù)誤差就大了)，造成誤差。數(shù)量太多的菌落的生長受到抑制，菌落之間營養(yǎng)競爭較大，可導致某些菌落營養(yǎng)不良影響計數(shù)，并且難以區(qū)分各個菌落，無法準確計數(shù)，造成誤差。
(3)結(jié)果分析：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比實際數(shù)目少，因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
1.某同學對101、102、103倍稀釋液計數(shù)的平均菌落數(shù)分別是2 760、295和16，則菌落總數(shù)為(所用稀釋液體積為0.1 mL)
A.2.76×104個/mL
B.2.95×105個/mL
C.4.6×104個/mL
D.3.775×104個/mL
√
落實　思維方法
某同學在101、102、103倍稀釋的平均菌落數(shù)為2 760、295和16，為保證結(jié)果準確，一般應(yīng)選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，故數(shù)值為295，稀釋倍數(shù)為102，則每毫升菌落總數(shù)為295×102÷0.1＝2.95×105(個)。
2.(2024·紹興高二校考)下列對液體培養(yǎng)基中的酵母菌進行計數(shù)的方法，描述不正確的是
A.可以用顯微鏡直接計數(shù)，需要血細胞計數(shù)板，但數(shù)據(jù)可能偏大
B.也可以用培養(yǎng)菌落的方法進行計數(shù)，但數(shù)據(jù)可能偏大
C.無論用哪種方法計數(shù)，都必須進行濃度梯度稀釋
D.無論用哪種方法計數(shù)，都必須多次計數(shù)求平均值
√
對液體培養(yǎng)基中的酵母菌進行計數(shù)可以用顯微鏡直接計數(shù)，需要血細胞計數(shù)板，由于不能區(qū)分死菌和活菌，數(shù)據(jù)可能偏大，A正確；
對液體培養(yǎng)基中的酵母菌進行計數(shù)可以用培養(yǎng)菌落的方法進行計數(shù)，當兩個或多個酵母菌連在一起時，繁殖后會形成一個菌落，可能會導致數(shù)據(jù)偏小，B錯誤；
無論用哪種方法計數(shù)，都必須進行濃度梯度稀釋，并多次計數(shù)求平均值，C、D正確。
調(diào)整培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)方式可有目的地培養(yǎng)某種微生物
二
1.選擇培養(yǎng)基
梳理　教材新知
添加(或減去)
特定
其他
抗性
敏感
固氮
目標微生物
特定的細胞
2.活動：能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)
(1)實驗原理
尿素
脲酶
氨
黃
酚紅指示劑
紅色
強
(2)方法步驟
G6玻璃砂漏斗
60 ℃
99
1
底部
移液器
由大到小
0.1
酒精
燈火焰
均勻
恒溫培養(yǎng)箱
提醒　①LB固體培養(yǎng)基的成分：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂和水。
②尿素固體培養(yǎng)基的成分：葡萄糖、氯化鈉、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖和水。
③瓊脂和瓊脂糖之間的主要區(qū)別在于瓊脂是從紅藻中獲得的凝膠狀物質(zhì)(含N)，而瓊脂糖是從瓊脂或紅藻中純化的線性聚合物(不含N)，瓊脂糖是瓊脂的主要成分，占瓊脂的70%以上。 瓊脂糖在細菌培養(yǎng)中非常有用。
(1)選擇培養(yǎng)基只允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他微生物的生長(　　)
(2)分離能分解尿素的微生物時，培養(yǎng)基中尿素作為唯一氮源(　　)
(3)配制的尿素固體培養(yǎng)基在滅菌后再加入尿素溶液，因為尿素高溫易分解(　　)
(4)相同稀釋度下，尿素固體培養(yǎng)基的菌落數(shù)比LB固體培養(yǎng)基多(　　)
√
×
√
√
提示　LB固體培養(yǎng)基為全營養(yǎng)培養(yǎng)基，尿素固體培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基，可淘汰不能以尿素為氮源進行固氮的微生物，因此尿素固體培養(yǎng)基的菌落數(shù)比LB固體培養(yǎng)基少。
任務(wù)三：用功能不同的培養(yǎng)基分離與鑒別微生物
按功能劃分，可以把培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。鑒別培養(yǎng)基是指根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學試劑配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物的培養(yǎng)基。據(jù)此回答以下問題。
1.根據(jù)教材“活動”中尿素固體培養(yǎng)基的配制，回答下列問題：
(1)從物理特征看，該培養(yǎng)基屬于　　　培養(yǎng)基，從功能上看屬于_____培養(yǎng)基。
探究　核心知識
固體
選擇
(2)尿素固體培養(yǎng)基是如何實現(xiàn)對能分解尿素的細菌的篩選的？
提示　該培養(yǎng)基中的唯一氮源為尿素，只有能分泌脲酶的微生物才能夠分解尿素，而不能分泌脲酶的微生物不能分解尿素，會因缺乏氮源而無法生長繁殖，所以用該培養(yǎng)基能夠篩選出分解尿素的細菌。
(3)在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基中分離出的微生物都是能分解尿素的嗎？
提示　不都是，有些菌落可能是自生固氮微生物，而不是能分解尿素的微生物。
2.已知剛果紅是一種染料，它可以與纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發(fā)生這種反應(yīng)。當在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅與纖維素形成紅色復合物；而當纖維素被纖維素分解菌分解后，復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以這些菌為中心的透明圈。請回答下列問題：
(1)現(xiàn)在要從土壤中分離纖維素分解菌，請你給出實驗方案。
提示　用“纖維素作為唯一碳源”的選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入剛果紅進行鑒別。在培養(yǎng)基上形成透明圈的菌落即為纖維素分解菌。
(2)怎么比較纖維素分解菌的分解能力？
提示　透明圈直徑與菌落直徑比值越大，說明該菌落分解纖維素的能力越強。
核心歸納
幾種選擇培養(yǎng)基的設(shè)計
特性 主要用途 設(shè)計原理
加入青霉素 分離酵母菌等真菌 青霉素能抑制細菌生長，對真菌無作用
不加氮源 分離固氮微生物 固氮微生物能利用空氣中的氮氣
不加碳源 分離自養(yǎng)型微生物 自養(yǎng)型微生物能利用無機碳源
3.(2023·湖州高二期末)下列有關(guān)微生物篩選的敘述中，不正確的是
A.利用高溫條件篩選耐熱的Taq細菌
B.加入青霉素可以篩選出對青霉素有抗性的細菌
C.含酚紅的尿素培養(yǎng)基初步鑒別出分解尿素的細菌
D.篩選分解尿素的細菌時應(yīng)以尿素作為培養(yǎng)基中的唯一營養(yǎng)物質(zhì)
√
落實　思維方法
耐熱的Taq細菌可以生存在高溫環(huán)境中，所以可以利用高溫條件篩選耐熱的Taq細菌，A正確；
尿素分解菌可以將尿素分解成氨使酚紅指示劑呈紅色，C正確；
篩選分解尿素的細菌時應(yīng)以尿素作為培養(yǎng)基中的唯一氮源，同時也要加入其他營養(yǎng)物質(zhì)，D錯誤。
4.如圖為“能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)”的部分實驗結(jié)果，下列敘述正確的是
A.圖中采用平板劃線法接種
B.圖中①和②表示尿素培養(yǎng)基長出的菌落
C.圖中③④培養(yǎng)基中菌落生長代謝時，會
　釋放CO2
D.實驗結(jié)果表明，自然界中能合成脲酶的
　微生物比例較高
√
根據(jù)實驗結(jié)果可知，圖中采用的接種方法為稀釋涂布平板法，A錯誤；
圖中①和②的稀釋度等于③和④，但菌落數(shù)卻明顯多于③④，很可能是LB培養(yǎng)基上長出的菌落，B錯誤；
根據(jù)實驗結(jié)果，判斷自然界中能合成脲酶的微生物比例較低，D錯誤。
網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
課時對點練
三
題組一　微生物的數(shù)量測定
1.某同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值為234，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)是(涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1 mL)
A.2.34×108個 B.2.34×109個
C.234個 D.23.4個
√
對點訓練
據(jù)題意分析可知，每毫升樣品中的菌落數(shù)＝234÷0.1×106＝2.34×
109(個)。
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2.下列關(guān)于教材中用顯微鏡計數(shù)法測定酵母菌的數(shù)量的敘述，正確的是
A.對于壓在方格邊緣線上的酵母菌的處理方法是計數(shù)四條邊及其頂角的酵母菌數(shù)
B.對酵母菌計數(shù)時，用滴管吸取靜置的培養(yǎng)液滴滿血細胞計數(shù)板的方格區(qū)
C.若血細胞計數(shù)板的大方格體積為2 mm×2 mm×0.1 mm，加入稀釋10倍的培
　養(yǎng)液后鏡檢，大方格內(nèi)酵母菌數(shù)為M，則10 mL培養(yǎng)液中酵母菌的總數(shù)約為
　2.5M×105個
D.某同學按對角線方位計數(shù)5個中方格菌數(shù)分別為10、11、8、10、9，估算每
　一小方格的酵母菌數(shù)是0.48
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對點訓練
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對點訓練
對于壓在一個方格邊緣上的酵母菌的處理方法是只計數(shù)每一小方格上方和左側(cè)線條上的酵母菌數(shù)(即“數(shù)上不數(shù)下”“數(shù)左不數(shù)右”)，A錯誤；
對酵母菌計數(shù)時，用滴管吸取振蕩均勻的培養(yǎng)液滴滿血細胞計數(shù)板的方格區(qū)，B錯誤；
血細胞計數(shù)板的大方格體積＝2×2×0.1＝0.4(mm3)，其中酵母菌數(shù)為M，則10 mL培養(yǎng)液中酵母菌數(shù)＝M÷0.4×1 000×10×10＝2.5M×105(個)，C正確；
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對點訓練
某同學按對角線方位計數(shù)5個中方格(血細胞計數(shù)板規(guī)格為25×16，即每個中方格有16個小方格)菌數(shù)分別為10、11、8、10、9，估算每一小方格的酵母菌數(shù)＝(10＋11＋8＋10＋9)÷5÷16＝0.6，D錯誤。
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3.(2024·杭州高二聯(lián)考)人們在研究、利用微生物時，需用無菌技術(shù)獲取純種微生物，并對其進行計數(shù)或保存。下列相關(guān)敘述正確的是
A.可用稀釋涂布平板法在顯微鏡下對酵母菌細胞進行計數(shù)
B.血細胞計數(shù)板若先加液體再加蓋玻片則會導致計數(shù)結(jié)果偏大
C.獲得單菌落后，利用涂布法接種至斜面培養(yǎng)基中保存
D.接種、分離后，使用過的器皿需先經(jīng)洗滌再徹底滅菌
對點訓練
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可用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下對酵母菌直接計數(shù)或用稀釋涂布平板法間接計數(shù)，A錯誤；
應(yīng)該先蓋蓋玻片再滴加培養(yǎng)液，若先向血細胞計數(shù)板的計數(shù)室中加培養(yǎng)液再加蓋玻片會造成統(tǒng)計結(jié)果偏大，B正確；
獲得單菌落后，可挑取菌落，利用劃線法接種至斜面培養(yǎng)基中保存，C錯誤；
接種、分離后，使用過的器皿需先經(jīng)高壓滅菌后再洗滌，以免造成環(huán)境污染，D錯誤。
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4.丙草胺是一種廣泛應(yīng)用的除草劑，能抑制土壤細菌、放線菌和真菌的生長。某研究小組從某地土壤中分離獲得能有效降解丙草胺的細菌菌株，并對其計數(shù)(如圖所示)，以期為修復污染土壤提供微生物資源。下列有關(guān)敘述錯誤的是
A.將培養(yǎng)基調(diào)至酸性時，有利于降解菌
　的生長繁殖
B.利用該方法的計數(shù)結(jié)果往往比顯微鏡
　計數(shù)法偏小
C.用以丙草胺為唯一氮源的培養(yǎng)基進行培
　養(yǎng)可以提高降解菌的濃度
D.5 號試管的結(jié)果表明每克土壤中的菌株數(shù)為 1.7×109個
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細菌通常要求在中性偏堿的環(huán)境中生長，A錯誤；
該計數(shù)方法為稀釋涂布平板法，由于當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌
落，故計數(shù)結(jié)果比顯微鏡計數(shù)法偏小，B正確；
若以丙草胺作為唯一氮源，則只有具有降解丙草胺能力的菌株能夠存活，故可以提高降解菌的濃度，C正確；
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對點訓練
根據(jù)5號試管的數(shù)據(jù)可知，每克土壤中菌株數(shù)為(168＋175＋167)÷3
÷0.1×106＝1.7×109(個)，D正確。
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選項 尿素 瓊脂糖 葡萄糖 硝酸鹽
A ＋ ＋ ＋ ＋
B － － － －
C ＋ ＋ ＋ －
D ＋ － － ＋
5.分離土壤中分解尿素的細菌，可選用的培養(yǎng)基是
√
對點訓練
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
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6.(2024·嘉興高二期末)如圖是研究人員從紅棕壤中篩選高效分解尿素的細菌的過程示意圖。
下列敘述錯誤的是
A.步驟②的液體培養(yǎng)基含有的
　唯一氮源是尿素
B.步驟③的平板培養(yǎng)基是加入了適量尿素的LB固體培養(yǎng)基
C.步驟③采用稀釋涂布平板法接種，期待獲得能分解尿素的細菌的單菌落
D.步驟④挑取③中菌落分別接種，可通過溶液pH的變化比較細菌分解尿
　素的能力
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對點訓練
步驟②為選擇培養(yǎng)，該液體培養(yǎng)基中含有的唯一氮源是尿素，A正確；
步驟③的平板培養(yǎng)基應(yīng)該是以尿素作為唯一氮源的固體培養(yǎng)基，其目的是篩選出分解尿素的微生物，而LB固體培養(yǎng)基中本身就含有氮源，B錯誤；
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對點訓練
步驟③采用稀釋涂布平板法接種，其目的是通過梯度稀釋獲得能分解尿素的細菌的單菌落，C正確；
尿素在分解過程中會產(chǎn)生氨，進而會導致培養(yǎng)基中pH發(fā)生變化，故可通過溶液pH的變化比較細菌分解尿素的能力，D正確。
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7.通過實驗測定土壤中的細菌數(shù)量，下列與此操作有關(guān)的敘述中，不正確的是
A.將培養(yǎng)皿倒置，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48小時
B.選擇菌落數(shù)在300個以上的培養(yǎng)皿進行計數(shù)
C.取104、105、106倍的土壤稀釋液0.1 mL，分別涂布于各組平板上
D.用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板
對點訓練
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培養(yǎng)細菌時，要將培養(yǎng)皿倒置，可防止水分過度揮發(fā)和冷凝水滴落到培養(yǎng)基表面，并在37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48小時，A正確；
選擇菌落數(shù)在30～300個的3個平板進行計數(shù)，求其平均值，B錯誤。
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8.“能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)”實驗中，配制LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基的目的是
A.作為實驗組，分離尿素分解菌
B.作為對照組，檢測培養(yǎng)基滅菌是否徹底
C.作為對照組，觀察尿素分解菌在含有酚紅培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)
D.作為對照組，觀察全營養(yǎng)條件下能生長的土壤微生物的種類和數(shù)量
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配制LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基的目的是作為對照組，觀察全營養(yǎng)條件下能生長的土壤微生物的種類和數(shù)量，以區(qū)分選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用，D正確。
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9.某同學依據(jù)如圖操作步驟，從土壤中分離能分解尿素的微生物。其中尿素固體培養(yǎng)基和尿素液體培養(yǎng)基均以尿素為唯一氮源。下列敘述正確的是
A.尿素固體培養(yǎng)基比尿素液體培養(yǎng)基
　多了瓊脂
B.以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基的滅菌
　方式是過濾滅菌
C.利用液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)需要振蕩以提高營養(yǎng)成分的利用率
D.兩種步驟獲得的菌落比值相等(甲1/甲2＝乙1/乙2)
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綜合強化
尿素固體培養(yǎng)基比尿素液體培養(yǎng)基多了瓊脂糖和酚紅指示劑，A錯誤；
以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基的滅菌方式是高壓蒸汽滅菌，其中的尿素溶液用過濾除菌，B錯誤；
兩種步驟獲得的菌落比值關(guān)系為甲1/甲2＞乙1/乙2，因為后者經(jīng)過了對尿素分解菌的選擇培養(yǎng)，所以尿素分解菌的比例變大，D錯誤。
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10.(2024·嘉興高二期中)益生菌是一類食用后能在腸道內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的活菌。研究小組嘗試檢測某品牌益生菌中的活菌含量，實驗步驟為制備培養(yǎng)基→調(diào)節(jié) pH→滅菌→倒平板→梯度稀釋樣品→接種→培養(yǎng)→計數(shù)。下列敘述錯誤的是
A.培養(yǎng)箱中氧含量的變化會影響所培養(yǎng)的益生菌的繁殖和代謝
B.經(jīng)高壓滅菌的空白平板和接種后的平板培養(yǎng)時均需要倒置
C.對該品牌益生菌進行計數(shù)時，稀釋涂布平板法統(tǒng)計的數(shù)目會比實際值略大
D.若要檢測培養(yǎng)基是否被污染，可將未接種的培養(yǎng)基在相同條件下進行培養(yǎng)
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由題意可知，益生菌主要在腸道內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，所以其代謝類型是厭氧型，因此培養(yǎng)箱中氧含量的變化會影響所培養(yǎng)的益生菌的繁殖和代謝，A正確；
經(jīng)高壓滅菌的空白平板和接種后的平板均需要倒置，防止水分過度揮發(fā)和冷凝水對培養(yǎng)基造成污染，B正確；
由于在平板上兩個或多個細菌可能會形成一個菌落，所以稀釋涂布平板法統(tǒng)計的數(shù)目會比實際值略小，C錯誤；
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若要檢測培養(yǎng)基是否被污染，可將未接種的培養(yǎng)基在相同條件下進行培養(yǎng)，如果出現(xiàn)了菌落，則說明培養(yǎng)基被污染，D正確。
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11.(2024·杭州高二期末)營養(yǎng)缺陷型菌株是突變后代謝過程中某些合成反應(yīng)不能正常進行的菌株。如圖是科研人員利用影印法(用無菌的絲絨布輕蓋在已長好菌落的原培養(yǎng)基上，然后不轉(zhuǎn)動任何角度，“復印”至新的培養(yǎng)基上)初檢某種氨基酸缺陷型菌株的過程。
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C.進行②過程的順序是先將絲絨布“復印”
　至完全培養(yǎng)基上，再“復印”至基本培養(yǎng)基上
D.氨基酸缺陷型菌株應(yīng)從基本培養(yǎng)基上沒有、完全培養(yǎng)基上對應(yīng)位置有的菌落
　中挑選
綜合強化
√
下列敘述錯誤的是
A.可用接種環(huán)從斜面中取出保存的菌種，
　然后誘變處理以獲得想要的營養(yǎng)缺陷
　型菌株
B.①過程接種方法為稀釋涂布平板法，
　接種后的培養(yǎng)皿不能立即進行倒置培養(yǎng)
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可用接種環(huán)從斜面中取出保存的菌種，放在搖床上振蕩培養(yǎng)然后誘變處理以獲得想要的營養(yǎng)缺陷型菌株，A正確；
由接種后的菌落分布情況可推測該過程接種的方法為稀釋涂布平板法，為防止培養(yǎng)液滴落，接種后的培養(yǎng)皿不能立即進行倒置培養(yǎng)，B正確；
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進行②過程培養(yǎng)時，為了防止將完全培養(yǎng)基中特定營養(yǎng)成分帶入基本培養(yǎng)基，應(yīng)先將絲絨布“復印”至基本培養(yǎng)基上，再“復印”至完全培養(yǎng)基上，C錯誤；
在基本培養(yǎng)基中氨基酸缺陷型菌株不
能生長，而在完全培養(yǎng)基中能夠生長，
比較基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基中的菌落可知，氨基酸缺陷型菌株應(yīng)從基本培養(yǎng)基上沒有、完全培養(yǎng)基上對應(yīng)位置有的菌落中挑選，D正確。
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12.金黃色葡萄球菌具有高度耐鹽性，在血平板(培養(yǎng)基中添加適量血液)上生長時，可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色。下列是某研究小組測定自來水中金黃色葡萄球菌濃度的實驗操作，錯誤的是
A.在金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基中加入7.5%NaCl，其作用是有利于金黃色葡萄球菌的
　篩選
B.在制作血平板時需等平板冷卻后，才可加入血液，以防止高溫破壞血細胞
C.現(xiàn)將10 mL菌液依次稀釋成10－1、10－2、10－3、10－4四個稀釋樣液，再取四個稀釋
　樣液各0.1 mL分別接種到4個血平板上，所用方法是稀釋涂布平板法
D.若在10－3組的3個血平板上(每個接種0.1 mL)，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)分別為35、
　36和37，則每升自來水中的活菌數(shù)約為3.6×106個
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由于金黃色葡萄球菌具有高度耐鹽性，7.5%NaCl在不影響金黃色葡萄球菌生長的同時還抑制其他菌的生長，因此，金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基中加入7.5%NaCl，有利于金黃色葡萄球菌的篩選，A正確；
若在10－3組的3個血平板上(每個接種0.1 mL)，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)分別為35、36和37，則每升自來水中的活菌數(shù)約為(35＋36＋37)÷3÷
10－3÷0.1×1 000＝3.6×108(個)，D錯誤。
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13.產(chǎn)脲酶的細菌可分解尿素。為篩選產(chǎn)脲酶的菌株，科研人員開展了相關(guān)研究。回答下列問題：
(1)為了篩選可分解尿素的細菌，配制的培養(yǎng)基應(yīng)選擇尿素作為唯一_______，尿素的滅菌方法是____________________________________。
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氮源
用已高壓滅菌的G6玻璃砂漏斗過濾除菌
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(2)稱取1 g土壤樣品，加入99 mL________中，制備成土壤細菌懸液。若用稀釋涂布平板法計數(shù)細菌的個數(shù)，要使所得估計值更接近實際值，應(yīng)嚴格操作，多次重復，還應(yīng)保證對待測樣品_____的比例恰當。取0.1 mL 10倍稀釋的細菌懸液涂布在固體培養(yǎng)基上，平均長出了25個菌落，則該樣本中每克土壤約有產(chǎn)脲酶的細菌__________個。
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無菌水
稀釋
2.5×105
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(3)通常篩選菌種時可以通過觀察______特征對細菌進行初步鑒定。在篩選產(chǎn)脲酶的細菌時，還可以在培養(yǎng)基中添加______作為指示劑，產(chǎn)脲酶的細菌在培養(yǎng)基中生長一段時間后，菌落周圍指示劑將變成____色。
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菌落
酚紅
紅
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14.一種廣泛使用的除草劑(含氮有機物)在土壤中不易被降解，長期使用可污染土壤。為修復被該除草劑污染的土壤，可用一定方法選育能降解該除草劑的細菌(已知該除草劑在水中溶解度低，含一定量該除草劑的培養(yǎng)基不透明)。
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(1)現(xiàn)有1 L土壤浸出液，為了對土壤中的細菌進行計數(shù)，各取0.1 mL已稀釋103倍的水樣分別接種到三個培養(yǎng)基上培養(yǎng)。接種需選擇圖1工具中的____(填字母)進行實驗操作。計數(shù)結(jié)束記錄上述三個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)分別為55、56、57，則每升原土壤浸出液中菌體數(shù)為___________個。
B
5.6×108　
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綜合強化
常用稀釋涂布平板法對土壤中細菌進行計數(shù)，稀釋涂布平板法要用B(涂布器)進行操作。每升土壤浸出液中菌體數(shù)為(55＋56＋57)÷3÷
0.1×103×103＝5.6×108(個)。
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(2)在培養(yǎng)基上形成的菌落中，有透明圈菌落利用的氮源主要是__________，據(jù)此可篩選出目的菌。實驗結(jié)果如圖2所示，圖中A～E五種菌株中，____是最理想菌株，判斷依據(jù)是_______________________________。
該除草劑
E
透明圈直徑與菌落直徑比值最大
要篩選降解該除草劑的菌體，培養(yǎng)基中應(yīng)該以該除草劑作為唯一氮源。圖中E菌株透明圈(降解圈)直徑與菌落直徑比值最大，故是最理想的菌株。
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(3)在無菌操作下，可將最理想的單菌落用接種環(huán)取出，再用_______法接種至斜面培養(yǎng)基中。
劃線
菌種保藏時，可將單菌落取出用劃線法接種在斜面培養(yǎng)基中。
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14作業(yè)2　目標微生物的分離和純化
(分值：100分)
第1～2題，每題5分；第3～13題，每題6分，共76分。
題組一　純化和分離微生物的方法
1．采用平板法培養(yǎng)微生物的過程中，使微生物均勻分布在培養(yǎng)基上需要用到的工具是(　　)
A．接種環(huán) B．涂布器
C．接種針 D．膠頭滴管
2．如圖表示培養(yǎng)和分離X細菌的部分操作步驟，下列相關(guān)敘述正確的是(　　)
A．步驟①倒平板操作時，倒好后應(yīng)立即將其倒過來放置
B．步驟②將接種環(huán)在火焰上灼燒后迅速蘸取菌液后進行平板劃線
C．步驟③應(yīng)多個方向劃線，使菌種逐漸分散，培養(yǎng)后出現(xiàn)單菌落
D．步驟④培養(yǎng)箱培養(yǎng)后可用來對X細菌進行計數(shù)
3．(2024·臺州高二期中)如圖為平板劃線法接種微生物的示意圖，下列說法錯誤的是(　　)
A．觀察或比較各種細菌菌落形態(tài)的最佳區(qū)域是④
B．劃線時要注意不能將④區(qū)域的劃線與①區(qū)域相連
C．每次劃線后，都應(yīng)將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒
D．劃線結(jié)束時即可看到劃線末端出現(xiàn)不連續(xù)單菌落
4．若在固體培養(yǎng)基上用稀釋涂布平板法接種細菌，看到的培養(yǎng)結(jié)果不可能是(　　)
5．稀釋涂布平板法是微生物培養(yǎng)的一種常用的接種方法。下列相關(guān)敘述錯誤的是(　　)
A．操作中需要將菌液進行一系列的濃度梯度稀釋
B．不同濃度的菌液均可在培養(yǎng)基表面形成單菌落
C．需將不同稀釋濃度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基表面
D．操作過程中對培養(yǎng)基和涂布器等均需進行嚴格滅菌處理
6．(2024·浙江四校高二聯(lián)考)下列有關(guān)微生物純培養(yǎng)的敘述，正確的是(　　)
A．可用稀釋涂布平板法和平板劃線法對微生物進行分離和計數(shù)
B．在酒精燈火焰附近將冷卻至室溫的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿
C．平板劃線法純化菌種，接種環(huán)的灼燒次數(shù)與劃線次數(shù)不同
D．配制培養(yǎng)基的步驟為計算→稱量→溶解→滅菌→調(diào)pH
題組二　接種、培養(yǎng)并分離酵母菌
7．下列依次表示倒平板、接種的位置以及平板劃線法接種的路徑的示意圖，其中錯誤的是(　　)
8．接種、培養(yǎng)并分離酵母菌最常用的方法是平板劃線法或稀釋涂布平板法。下列有關(guān)這兩種方法的敘述，錯誤的是(　　)
A．均將酵母菌接種在固體培養(yǎng)基的表面
B．獲得的每一個菌落均是由一個細胞生長繁殖而來的子細胞集團
C．都應(yīng)在酒精燈火焰附近操作，以防止雜菌污染
D．稀釋分散菌種的原理不同，但均能達到純化酵母菌的目的
9．在培養(yǎng)基配制和微生物接種的過程中，確保無雜菌污染被稱為無菌操作。圖中符合無菌操作要求的有(　　)
①三角瓶口通過火焰，并在火焰旁將培養(yǎng)基倒入滅菌培養(yǎng)皿　②盛菌種的試管口在火焰上灼燒　③接種前灼燒接種環(huán)　④接種前培養(yǎng)皿在火焰上灼燒　⑤靠近火焰接種
A．①②③④ B．①②③⑤
C．①③④⑤ D．②③④⑤
10．(2024·浙江大學附中高二期中)人體皮膚表面存在著多種微生物，某同學擬從中分離出葡萄球菌。下列有關(guān)敘述不正確的是(　　)
A．對配制的培養(yǎng)基進行高壓滅菌
B．使用無菌棉拭子從皮膚表面取樣
C．采用平板劃線法對獲得的菌株進行計數(shù)
D．根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色等進行初步判斷
11．(2024·浙江余姚中學高二月考)紙片擴散法是藥敏試驗中一種常用的方法。取少量大腸桿菌的培養(yǎng)液，均勻涂在培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基上，再放上4片含有鏈霉素(抗生素的一種)的圓形濾紙，然后在無菌適宜條件下培養(yǎng)12～16 h，濾紙片周圍出現(xiàn)抑制大腸桿菌生長的環(huán)圈(簡稱抑菌圈，如圖)。下列相關(guān)敘述錯誤的是(　　)
A．圖1中的培養(yǎng)基需冷卻至60 ℃左右時再倒平板，該操作需要在酒精燈旁完成
B．圖2中所示培養(yǎng)基的放置方式能防止水分過快蒸發(fā)和冷凝水珠沖散菌落
C．圖3培養(yǎng)皿上大腸桿菌的接種方式為稀釋涂布平板法，Ⅳ號紙片上抗生素濃度最高
D．圖3所示的抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)大腸桿菌菌落的原因是鏈霉素使其發(fā)生了基因突變
12．如圖所示為實驗室使用某種接種方法在培養(yǎng)基上培養(yǎng)某種微生物的結(jié)果。下列相關(guān)說法正確的是(　　)
A．該圖最可能是用稀釋涂布平板法進行接種的
B．在操作時，為防止雜菌污染，需進行嚴格的消毒和滅菌
C．該種微生物有可能是H5N1病毒
D．該培養(yǎng)基上的菌落分布不均勻，代表純培養(yǎng)失敗
13．(2024·寧波效實中學高二期中)野生型傷寒沙門氏菌(his＋)可合成組氨酸，某種突變體喪失了這種能力，必須在添加組氨酸的培養(yǎng)基上才能生長，稱為組氨酸營養(yǎng)缺陷型(his)。現(xiàn)用兩種方法接種，甲為平板劃線法，乙為稀釋涂布平板法。下列敘述正確的是(　　)
A．兩種方法所用培養(yǎng)基均為液體培養(yǎng)基
B．甲接種方法可用于對微生物的分離和計數(shù)
C．乙接種方法可用于對微生物的分離和計數(shù)
D．his菌株接種在不含組氨酸的培養(yǎng)基上能長出菌落
14．(每空3分，共9分)使用特定的接種技術(shù)可以得到目標微生物的單菌落，實現(xiàn)對目標微生物的分離。回答下列問題：
(1)一般情況下，培養(yǎng)基都可以為微生物的生存提供________________________________等。
(2)實驗前需要確定培養(yǎng)基滅菌是否徹底，具體的操作是_____________________________。
(3)下面是四種菌落的分布情況，其中屬于通過稀釋涂布平板法得到的是________(多選)。
15．(每空3分，共15分)某研究小組從黃色短桿菌(能合成L－亮氨酸)中篩選L－亮氨酸缺陷型(不能合成L－亮氨酸)突變菌株，實驗流程如圖所示。回答下列問題：
(1)培養(yǎng)基滅菌常用的方法是_______________________________________________。
(2)過程①的接種方法是____________________。過程②接種時，先將滅菌后的金絲絨與培養(yǎng)皿A中的菌落接觸一次，然后像蓋印章一樣將菌種連續(xù)接種到培養(yǎng)皿B和C的培養(yǎng)基表面，這種接種方法便于將來比較培養(yǎng)皿B、C中菌落的差異，原因是_____________________。
(3)培養(yǎng)皿A、B、C中的培養(yǎng)基都要使用固體培養(yǎng)基，原因是______________________。若培養(yǎng)皿B的培養(yǎng)基中含有L－亮氨酸，培養(yǎng)皿C的培養(yǎng)基中不含L－亮氨酸，培養(yǎng)一段時間后菌落生長情況如圖所示，研究人員應(yīng)該從培養(yǎng)皿______(填“B”或“C”)中選取目的菌落。
答案精析
1．B
2．C　[步驟①倒平板操作時，倒好后待平板冷卻凝固，然后將其倒過來放置，A錯誤；步驟②將接種環(huán)在火焰上灼燒后冷卻至室溫再蘸取菌液進行平板劃線，B錯誤；步驟④培養(yǎng)箱培養(yǎng)后可用來對X細菌進行分離純化，得到單菌落，但不可用來計數(shù)，D錯誤。]
3．D　[劃線結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后，方可看到劃線末端出現(xiàn)不連續(xù)單菌落，D錯誤。]
4．D
5．B　[稀釋涂布平板法操作中需要將菌液進行一系列的濃度梯度稀釋，以獲得單菌落，A正確；只有稀釋度足夠高的菌液才可在培養(yǎng)基表面形成單菌落，若稀釋度不夠大，細菌聚集在一起，得不到單菌落，B錯誤；操作過程中對培養(yǎng)基和涂布器等均需進行嚴格滅菌處理，以防雜菌污染，D正確。]
6．C　[稀釋涂布平板法和平板劃線法都能對微生物進行分離純化，但平板劃線法不能用于計數(shù)，A錯誤；在酒精燈火焰附近將冷卻至60 ℃左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，B錯誤；平板劃線法純化菌種，接種環(huán)的灼燒次數(shù)比劃線次數(shù)多一次，因為劃線完之后為避免污染還需再灼燒一次，C正確；配制培養(yǎng)基的步驟為計算→稱量→溶解→調(diào)pH→滅菌，D錯誤。]
7．D
8．B　[用稀釋涂布平板法分離酵母菌時，如果稀釋度不夠大，獲得的菌落就可能是由多個細胞繁殖形成的，B錯誤。]
9．B
10．C　[培養(yǎng)基通常采用高壓(蒸汽)滅菌法進行滅菌，A正確；使用無菌棉拭子從皮膚表面取樣，可以防止雜菌污染，B正確；平板劃線法無法對獲得的菌株進行計數(shù)，應(yīng)該采用稀釋涂布平板法對獲得的菌株進行計數(shù)，C錯誤；菌落形態(tài)包括菌落的大小、形狀、光澤、質(zhì)地、顏色和透明程度等，每一種細菌在一定條件下形成固定的菌落特征，故可根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色等進行初步判斷，D正確。]
11．D　[對培養(yǎng)液進行滅菌后需先冷卻再倒平板，倒平板時應(yīng)在酒精燈旁進行，可以盡可能減少培養(yǎng)基污染，A正確；接種后的培養(yǎng)基需要倒置，這樣可以防止培養(yǎng)基中水分過快蒸發(fā)，同時防止冷凝形成的水珠倒流沖散菌落，B正確；圖3所示為稀釋涂布平板法進行接種，紙片上的抗生素濃度越大，所形成的抑菌圈就越大，故Ⅳ號紙片上的抗生素濃度最高，C正確；圖3所示Ⅳ號的抑菌圈中出現(xiàn)了少數(shù)幾個菌落，說明這幾個菌落具有抗藥性，抗藥性的獲得是由于這些細菌發(fā)生了基因突變，抗生素只是將具有抗藥性突變的細菌從中篩選出來，D錯誤。]
12．B　[題圖最可能是采用平板劃線法進行接種的，A錯誤；病毒無細胞結(jié)構(gòu)，必須寄生在活細胞中才能生存，因此病毒不能用培養(yǎng)基直接培養(yǎng)，C錯誤；平板劃線法中隨劃線次數(shù)的增加，菌落密度逐漸減小，因此分布不均勻，D錯誤。]
13．C　[甲是平板劃線法，乙是稀釋涂布平板法，兩種方法都是在固體培養(yǎng)基上進行接種的操作，A錯誤；平板劃線法可用于對微生物的分離純化，但不能計數(shù)，B錯誤；稀釋涂布平板法可用于對微生物的分離和計數(shù)，C正確；由題意可知，野生型傷寒沙門氏菌可合成組氨酸，his菌株突變體喪失了這種能力，必須在添加組氨酸的培養(yǎng)基上才能生長，D錯誤。]
14．(1)水、碳源、氮源、無機鹽和生長因子　(2)將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)一段時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落出現(xiàn)　(3)ABC
15．(1)高壓蒸汽滅菌法　(2)稀釋涂布平板法　培養(yǎng)皿B、C中的菌種接種位置相同　(3)便于觀察菌落特征和分離目的菌株　B
解析　(2)根據(jù)過程①所得培養(yǎng)基中菌落的分布結(jié)果可以判斷，該過程所采用的接種方法為稀釋涂布平板法。(3)為了便于觀察菌落特征和分離目的菌株，培養(yǎng)皿A、B、C中的培養(yǎng)基都要使用固體培養(yǎng)基。在不含L－亮氨酸培養(yǎng)基中，突變菌株不能生長，而在含L－亮氨酸培養(yǎng)基中能夠生長，因此從培養(yǎng)皿B中的菌落中可挑選出突變菌株。作業(yè)3　微生物的數(shù)量測定和選擇培養(yǎng)
(分值：100分)
第1～12題，每題6分，共72分。
題組一　微生物的數(shù)量測定
1．某同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值為234，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)是(涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1 mL)(　　)
A．2.34×108個 B．2.34×109個
C．234個 D．23.4個
2．下列關(guān)于教材中用顯微鏡計數(shù)法測定酵母菌的數(shù)量的敘述，正確的是(　　)
A．對于壓在方格邊緣線上的酵母菌的處理方法是計數(shù)四條邊及其頂角的酵母菌數(shù)
B．對酵母菌計數(shù)時，用滴管吸取靜置的培養(yǎng)液滴滿血細胞計數(shù)板的方格區(qū)
C．若血細胞計數(shù)板的大方格體積為2 mm×2 mm×0.1 mm，加入稀釋10倍的培養(yǎng)液后鏡檢，大方格內(nèi)酵母菌數(shù)為M，則10 mL培養(yǎng)液中酵母菌的總數(shù)約為2.5M×105個
D．某同學按對角線方位計數(shù)5個中方格菌數(shù)分別為10、11、8、10、9，估算每一小方格的酵母菌數(shù)是0.48
3．(2024·杭州高二聯(lián)考)人們在研究、利用微生物時，需用無菌技術(shù)獲取純種微生物，并對其進行計數(shù)或保存。下列相關(guān)敘述正確的是(　　)
A．可用稀釋涂布平板法在顯微鏡下對酵母菌細胞進行計數(shù)
B．血細胞計數(shù)板若先加液體再加蓋玻片則會導致計數(shù)結(jié)果偏大
C．獲得單菌落后，利用涂布法接種至斜面培養(yǎng)基中保存
D．接種、分離后，使用過的器皿需先經(jīng)洗滌再徹底滅菌
4．丙草胺是一種廣泛應(yīng)用的除草劑，能抑制土壤細菌、放線菌和真菌的生長。某研究小組從某地土壤中分離獲得能有效降解丙草胺的細菌菌株，并對其計數(shù)(如圖所示)，以期為修復污染土壤提供微生物資源。下列有關(guān)敘述錯誤的是(　　)
A．將培養(yǎng)基調(diào)至酸性時，有利于降解菌的生長繁殖
B．利用該方法的計數(shù)結(jié)果往往比顯微鏡計數(shù)法偏小
C．用以丙草胺為唯一氮源的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)可以提高降解菌的濃度
D．5 號試管的結(jié)果表明每克土壤中的菌株數(shù)為 1.7×109個
題組二　微生物的選擇培養(yǎng)
5．分離土壤中分解尿素的細菌，可選用的培養(yǎng)基是(　　)
選項 尿素 瓊脂糖 葡萄糖 硝酸鹽
A ＋ ＋ ＋ ＋
B － － － －
C ＋ ＋ ＋ －
D ＋ － － ＋
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
6．(2024·嘉興高二期末)如圖是研究人員從紅棕壤中篩選高效分解尿素的細菌的過程示意圖。
下列敘述錯誤的是(　　)
A．步驟②的液體培養(yǎng)基含有的唯一氮源是尿素
B．步驟③的平板培養(yǎng)基是加入了適量尿素的LB固體培養(yǎng)基
C．步驟③采用稀釋涂布平板法接種，期待獲得能分解尿素的細菌的單菌落
D．步驟④挑取③中菌落分別接種，可通過溶液pH的變化比較細菌分解尿素的能力
7．通過實驗測定土壤中的細菌數(shù)量，下列與此操作有關(guān)的敘述中，不正確的是(　　)
A．將培養(yǎng)皿倒置，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48小時
B．選擇菌落數(shù)在300個以上的培養(yǎng)皿進行計數(shù)
C．取104、105、106倍的土壤稀釋液0.1 mL，分別涂布于各組平板上
D．用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板
8．“能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)”實驗中，配制LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基的目的是(　　)
A．作為實驗組，分離尿素分解菌
B．作為對照組，檢測培養(yǎng)基滅菌是否徹底
C．作為對照組，觀察尿素分解菌在含有酚紅培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)
D．作為對照組，觀察全營養(yǎng)條件下能生長的土壤微生物的種類和數(shù)量
9．某同學依據(jù)如圖操作步驟，從土壤中分離能分解尿素的微生物。其中尿素固體培養(yǎng)基和尿素液體培養(yǎng)基均以尿素為唯一氮源。下列敘述正確的是(　　)
A．尿素固體培養(yǎng)基比尿素液體培養(yǎng)基多了瓊脂
B．以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基的滅菌方式是過濾滅菌
C．利用液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)需要振蕩以提高營養(yǎng)成分的利用率
D．兩種步驟獲得的菌落比值相等(甲1/甲2＝乙1/乙2)
10．(2024·嘉興高二期中)益生菌是一類食用后能在腸道內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的活菌。研究小組嘗試檢測某品牌益生菌中的活菌含量，實驗步驟為制備培養(yǎng)基→調(diào)節(jié) pH→滅菌→倒平板→梯度稀釋樣品→接種→培養(yǎng)→計數(shù)。下列敘述錯誤的是(　　)
A．培養(yǎng)箱中氧含量的變化會影響所培養(yǎng)的益生菌的繁殖和代謝
B．經(jīng)高壓滅菌的空白平板和接種后的平板培養(yǎng)時均需要倒置
C．對該品牌益生菌進行計數(shù)時，稀釋涂布平板法統(tǒng)計的數(shù)目會比實際值略大
D．若要檢測培養(yǎng)基是否被污染，可將未接種的培養(yǎng)基在相同條件下進行培養(yǎng)
11．(2024·杭州高二期末)營養(yǎng)缺陷型菌株是突變后代謝過程中某些合成反應(yīng)不能正常進行的菌株。如圖是科研人員利用影印法(用無菌的絲絨布輕蓋在已長好菌落的原培養(yǎng)基上，然后不轉(zhuǎn)動任何角度，“復印”至新的培養(yǎng)基上)初檢某種氨基酸缺陷型菌株的過程。下列敘述錯誤的是(　　)
A．可用接種環(huán)從斜面中取出保存的菌種，然后誘變處理以獲得想要的營養(yǎng)缺陷型菌株
B．①過程接種方法為稀釋涂布平板法，接種后的培養(yǎng)皿不能立即進行倒置培養(yǎng)
C．進行②過程的順序是先將絲絨布“復印”至完全培養(yǎng)基上，再“復印”至基本培養(yǎng)基上
D．氨基酸缺陷型菌株應(yīng)從基本培養(yǎng)基上沒有、完全培養(yǎng)基上對應(yīng)位置有的菌落中挑選
12．金黃色葡萄球菌具有高度耐鹽性，在血平板(培養(yǎng)基中添加適量血液)上生長時，可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色。下列是某研究小組測定自來水中金黃色葡萄球菌濃度的實驗操作，錯誤的是(　　)
A．在金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基中加入7.5%NaCl，其作用是有利于金黃色葡萄球菌的篩選
B．在制作血平板時需等平板冷卻后，才可加入血液，以防止高溫破壞血細胞
C．現(xiàn)將10 mL菌液依次稀釋成10－1、10－2、10－3、10－4四個稀釋樣液，再取四個稀釋樣液各0.1 mL分別接種到4個血平板上，所用方法是稀釋涂布平板法
D．若在10－3組的3個血平板上(每個接種0.1 mL)，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)分別為35、36和37，則每升自來水中的活菌數(shù)約為3.6×106個
13．(16分)產(chǎn)脲酶的細菌可分解尿素。為篩選產(chǎn)脲酶的菌株，科研人員開展了相關(guān)研究。回答下列問題：
(1)為了篩選可分解尿素的細菌，配制的培養(yǎng)基應(yīng)選擇尿素作為唯一___________________，尿素的滅菌方法是___________________________________________________________。
(2)稱取1 g土壤樣品，加入99 mL__________中，制備成土壤細菌懸液。若用稀釋涂布平板法計數(shù)細菌的個數(shù)，要使所得估計值更接近實際值，應(yīng)嚴格操作，多次重復，還應(yīng)保證對待測樣品________的比例恰當。取0.1 mL 10倍稀釋的細菌懸液涂布在固體培養(yǎng)基上，平均長出了25個菌落，則該樣本中每克土壤約有產(chǎn)脲酶的細菌________個。
(3)通常篩選菌種時可以通過觀察________特征對細菌進行初步鑒定。在篩選產(chǎn)脲酶的細菌時，還可以在培養(yǎng)基中添加________作為指示劑，產(chǎn)脲酶的細菌在培養(yǎng)基中生長一段時間后，菌落周圍指示劑將變成________色。
14．(12分)一種廣泛使用的除草劑(含氮有機物)在土壤中不易被降解，長期使用可污染土壤。為修復被該除草劑污染的土壤，可用一定方法選育能降解該除草劑的細菌(已知該除草劑在水中溶解度低，含一定量該除草劑的培養(yǎng)基不透明)。
(1)現(xiàn)有1 L土壤浸出液，為了對土壤中的細菌進行計數(shù)，各取0.1 mL已稀釋103倍的水樣分別接種到三個培養(yǎng)基上培養(yǎng)。接種需選擇圖1工具中的______(填字母)進行實驗操作。計數(shù)結(jié)束記錄上述三個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)分別為55、56、57，則每升原土壤浸出液中菌體數(shù)為______________個。
(2)在培養(yǎng)基上形成的菌落中，有透明圈菌落利用的氮源主要是__________，據(jù)此可篩選出目的菌。實驗結(jié)果如圖2所示，圖中A～E五種菌株中，______是最理想菌株，判斷依據(jù)是________________________________________________________________________。
(3)在無菌操作下，可將最理想的單菌落用接種環(huán)取出，再用________法接種至斜面培養(yǎng)基中。
答案精析
1．B　[據(jù)題意分析可知，每毫升樣品中的菌落數(shù)＝234÷0.1×106＝2.34×109(個)。]
2．C　[對于壓在一個方格邊緣上的酵母菌的處理方法是只計數(shù)每一小方格上方和左側(cè)線條上的酵母菌數(shù)(即“數(shù)上不數(shù)下”“數(shù)左不數(shù)右”)，A錯誤；對酵母菌計數(shù)時，用滴管吸取振蕩均勻的培養(yǎng)液滴滿血細胞計數(shù)板的方格區(qū)，B錯誤；血細胞計數(shù)板的大方格體積＝2×2×0.1＝0.4(mm3)，其中酵母菌數(shù)為M，則10 mL培養(yǎng)液中酵母菌數(shù)＝M÷0.4×1 000×10×10＝2.5M×105(個)，C正確；某同學按對角線方位計數(shù)5個中方格(血細胞計數(shù)板規(guī)格為25×16，即每個中方格有16個小方格)菌數(shù)分別為10、11、8、10、9，估算每一小方格的酵母菌數(shù)＝(10＋11＋8＋10＋9)÷5÷16＝0.6，D錯誤。]
3．B　[可用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下對酵母菌直接計數(shù)或用稀釋涂布平板法間接計數(shù)，A錯誤；應(yīng)該先蓋蓋玻片再滴加培養(yǎng)液，若先向血細胞計數(shù)板的計數(shù)室中加培養(yǎng)液再加蓋玻片會造成統(tǒng)計結(jié)果偏大，B正確；獲得單菌落后，可挑取菌落，利用劃線法接種至斜面培養(yǎng)基中保存，C錯誤；接種、分離后，使用過的器皿需先經(jīng)高壓滅菌后再洗滌，以免造成環(huán)境污染，D錯誤。]
4．A　[細菌通常要求在中性偏堿的環(huán)境中生長，A錯誤；該計數(shù)方法為稀釋涂布平板法，由于當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，故計數(shù)結(jié)果比顯微鏡計數(shù)法偏小，B正確；若以丙草胺作為唯一氮源，則只有具有降解丙草胺能力的菌株能夠存活，故可以提高降解菌的濃度，C正確；根據(jù)5號試管的數(shù)據(jù)可知，每克土壤中菌株數(shù)為(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(個)，D正確。]
5．C
6．B　[步驟②為選擇培養(yǎng)，該液體培養(yǎng)基中含有的唯一氮源是尿素，A正確；步驟③的平板培養(yǎng)基應(yīng)該是以尿素作為唯一氮源的固體培養(yǎng)基，其目的是篩選出分解尿素的微生物，而LB固體培養(yǎng)基中本身就含有氮源，B錯誤；步驟③采用稀釋涂布平板法接種，其目的是通過梯度稀釋獲得能分解尿素的細菌的單菌落，C正確；尿素在分解過程中會產(chǎn)生氨，進而會導致培養(yǎng)基中pH發(fā)生變化，故可通過溶液pH的變化比較細菌分解尿素的能力，D正確。]
7．B　[培養(yǎng)細菌時，要將培養(yǎng)皿倒置，可防止水分過度揮發(fā)和冷凝水滴落到培養(yǎng)基表面，并在37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48小時，A正確；選擇菌落數(shù)在30～300個的3個平板進行計數(shù)，求其平均值，B錯誤。]
8．D　[配制LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基的目的是作為對照組，觀察全營養(yǎng)條件下能生長的土壤微生物的種類和數(shù)量，以區(qū)分選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用，D正確。]
9．C　[尿素固體培養(yǎng)基比尿素液體培養(yǎng)基多了瓊脂糖和酚紅指示劑，A錯誤；以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基的滅菌方式是高壓蒸汽滅菌，其中的尿素溶液用過濾除菌，B錯誤；兩種步驟獲得的菌落比值關(guān)系為甲1/甲2＞乙1/乙2，因為后者經(jīng)過了對尿素分解菌的選擇培養(yǎng)，所以尿素分解菌的比例變大，D錯誤。]
10．C　[由題意可知，益生菌主要在腸道內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，所以其代謝類型是厭氧型，因此培養(yǎng)箱中氧含量的變化會影響所培養(yǎng)的益生菌的繁殖和代謝，A正確；經(jīng)高壓滅菌的空白平板和接種后的平板均需要倒置，防止水分過度揮發(fā)和冷凝水對培養(yǎng)基造成污染，B正確；由于在平板上兩個或多個細菌可能會形成一個菌落，所以稀釋涂布平板法統(tǒng)計的數(shù)目會比實際值略小，C錯誤；若要檢測培養(yǎng)基是否被污染，可將未接種的培養(yǎng)基在相同條件下進行培養(yǎng)，如果出現(xiàn)了菌落，則說明培養(yǎng)基被污染，D正確。]
11．C　[可用接種環(huán)從斜面中取出保存的菌種，放在搖床上振蕩培養(yǎng)然后誘變處理以獲得想要的營養(yǎng)缺陷型菌株，A正確；由接種后的菌落分布情況可推測該過程接種的方法為稀釋涂布平板法，為防止培養(yǎng)液滴落，接種后的培養(yǎng)皿不能立即進行倒置培養(yǎng)，B正確；進行②過程培養(yǎng)時，為了防止將完全培養(yǎng)基中特定營養(yǎng)成分帶入基本培養(yǎng)基，應(yīng)先將絲絨布“復印”至基本培養(yǎng)基上，再“復印”至完全培養(yǎng)基上，C錯誤；在基本培養(yǎng)基中氨基酸缺陷型菌株不能生長，而在完全培養(yǎng)基中能夠生長，比較基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基中的菌落可知，氨基酸缺陷型菌株應(yīng)從基本培養(yǎng)基上沒有、完全培養(yǎng)基上對應(yīng)位置有的菌落中挑選，D正確。]
12．D　[由于金黃色葡萄球菌具有高度耐鹽性，7.5%NaCl在不影響金黃色葡萄球菌生長的同時還抑制其他菌的生長，因此，金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基中加入7.5%NaCl，有利于金黃色葡萄球菌的篩選，A正確；若在10－3組的3個血平板上(每個接種0.1 mL)，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)分別為35、36和37，則每升自來水中的活菌數(shù)約為(35＋36＋37)÷3÷10－3÷0.1×1 000＝3.6×108(個)，D錯誤。]
13．(1)氮源　用已高壓滅菌的G6玻璃砂漏斗過濾除菌　(2)無菌水　稀釋　2.5×105　(3)菌落　酚紅　紅
14．(1)B　5.6×108　(2)該除草劑　E　透明圈直徑與菌落直徑比值最大　(3)劃線
解析　(1)常用稀釋涂布平板法對土壤中細菌進行計數(shù)，稀釋涂布平板法要用B(涂布器)進行操作。每升土壤浸出液中菌體數(shù)為(55＋56＋57)÷3÷0.1×103×103＝5.6×108(個)。(2)要篩選降解該除草劑的菌體，培養(yǎng)基中應(yīng)該以該除草劑作為唯一氮源。圖中E菌株透明圈(降解圈)直徑與菌落直徑比值最大，故是最理想的菌株。(3)菌種保藏時，可將單菌落取出用劃線法接種在斜面培養(yǎng)基中。(共64張PPT)
第一章 發(fā)酵工程
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第1課時
目標微生物的分離和純化
學習目標
1.概述分離和純化微生物的平板劃線法和稀釋涂布平板法。
2.嘗試分離和純化酵母菌。
內(nèi)容索引
一、采用劃線或涂布的接種方法能夠?qū)崿F(xiàn)對目標微生物的分離和純化
課時對點練
二、活動：接種、培養(yǎng)并分離酵母菌
采用劃線或涂布的接種方法能夠?qū)崿F(xiàn)對目標微生物的分離和純化
一
梳理　教材新知
1.單菌落：在　　　培養(yǎng)基上采用劃線或稀釋涂布的方法接種，通過培養(yǎng)獲得的由__________分裂形成的、 的、有一定形態(tài)構(gòu)造的子細胞集團。
固體
一個細胞
肉眼可見
2.目標微生物分離和純化的兩種方法
微生物
連續(xù)平行
扇形
梯度稀釋
固體
涂布器
劃線的尾部
稀釋度適當
多次連續(xù)平行
提醒　(1)扇形劃線：從培養(yǎng)基上的一點出發(fā)，向多方向多次劃線，每劃一條線都要將接種環(huán)在酒精燈的火焰上滅菌，然后再次從同一起點變換方向劃線。
(2)多次連續(xù)平行劃線：劃線分3～4次進行。將培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)一定角度后，不需再次蘸取菌種，只需在上一次劃線的末端區(qū)域直接開始劃線即可。
(3)稀釋涂布平板法：接種時，通常需要先將菌液進行梯度稀釋，并在培養(yǎng)皿側(cè)面或底面做好標記。
(1)采用劃線的方法接種時，每劃一條線前接種環(huán)都要灼燒滅菌(　　)
(2)多次連續(xù)平行劃線時，接種環(huán)已滅菌，整個劃線過程中不再滅菌
(　　)
(3)與平板劃線法相比，稀釋涂布平板法分散細菌得到單菌落的效果更好(　　)
√
×
√
任務(wù)一：微生物的分離和純化的原理
1.多次連續(xù)平行劃線法的操作中，在進行第二次及之后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因：劃線后，線條末端菌種的數(shù)目比線條起始處要　　，每次從上一次劃線的末端開始，能使菌種的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步　　　，最終能得到由　　　細胞繁殖而來的菌落。
探究　核心知識
少
減少
單個
2.為什么最后一次劃線與第一次的劃線不能相連？
提示　最后一次劃線已經(jīng)將菌種稀釋成單個的細胞，如果與第一次的劃線相連則增加了菌種的數(shù)目，達不到純化的效果。
3.稀釋涂布平板法也是常用的微生物分離和純化方法。某同學欲通過稀釋涂布平板法了解某牛奶中大腸桿菌的含量，進行了相關(guān)的實驗操作。請分析回答下列問題：
(1)如何獲得該牛奶的10倍、100倍、1 000倍稀釋液？
提示　向1 mL牛奶中加入9 mL無菌水，獲得10倍稀釋液；再取1 mL 10倍稀釋液，加入9 mL無菌水，獲得100倍稀釋液；取1 mL的100倍稀釋液加入9 mL無菌水，獲得1 000倍稀釋液。
(2)接種前，該同學將表面殘留著少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上灼燒，這樣做的目的是什么？
提示　避免涂布器上可能存在的微生物污染培養(yǎng)基，影響實驗結(jié)果。
(3)該同學應(yīng)如何確定哪些菌落是大腸桿菌的單菌落？
提示　根據(jù)大腸桿菌菌落特有的形狀、大小、顏色、邊緣、表面光滑與否等特征進行確定。
核心歸納
平板劃線操作中三種灼燒的目的
項目 目的
蘸取菌液前灼燒 避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染菌種
每次劃線前灼燒 殺死上一次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時接種環(huán)上的菌種直接來源于上一次劃線的末端
劃線操作結(jié)束后灼燒 及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免菌種污染環(huán)境和感染操作者
1.(2024·寧波北侖中學高二期中)在分離、純化細菌的實驗中，劃線接種(甲)、培養(yǎng)結(jié)果(乙)如圖，a、b、c、d是劃線的四個區(qū)域。下列有關(guān)敘述錯誤的是
A.操作過程中，接種環(huán)蘸取菌液1次，至少
　需灼燒5次
B.連續(xù)劃線的目的是獲得單個細胞形成的菌落
C.蘸取菌液和劃線要在酒精燈火焰旁進行
D.圖甲中的a區(qū)域為劃線的起始區(qū)域
√
落實　思維方法
操作過程中，接種環(huán)蘸取菌液1次，劃線了4次，至少需灼燒5次，A正確；
連續(xù)劃線可以將聚集的菌種逐步稀釋，以便獲得由單個細胞生長繁殖成的單菌落，B正確；
為了防止空氣中雜菌的污染，蘸取菌液和劃線都要在酒精燈火焰旁進行，C正確；
分析圖乙可知，a對應(yīng)的區(qū)域出現(xiàn)了單菌落，d對應(yīng)區(qū)域菌落最多，因此a區(qū)域應(yīng)該為劃線的最終區(qū)域，d區(qū)域為劃線的起始區(qū)域，D錯誤。
2.圖甲所示是稀釋涂布平板法中的部分操作，圖乙所示是平板劃線法的操作結(jié)果。下列相關(guān)敘述錯誤的是
A.圖甲中涂布前要將涂布器灼燒，
　冷卻后才能涂布菌液
B.對于濃度較高的菌液，若圖甲中
　的最高稀釋倍數(shù)僅為102，則所
　得到的菌落不一定是由單個的細胞繁殖而成的
C.圖乙所示培養(yǎng)皿中每個劃線區(qū)域都可得到符合要求的菌落
D.圖乙中連續(xù)劃線的起點是上一次劃線的末端(除第一次劃線外)
√
平板劃線法中多次劃線的目的是降低菌種濃度，經(jīng)過連續(xù)劃線才有可能得到由單個細胞繁殖而成的單菌落，這種菌落才符合要求，C錯誤。
活動：接種、培養(yǎng)并分離酵母菌
二
1.目的要求
(1)用　　　　　法或稀釋涂布平板法接種酵母菌。
(2)用　　　培養(yǎng)基大量擴增酵母菌。
梳理　教材新知
平板劃線
液體
2.方法步驟
底部
灼燒滅菌
培養(yǎng)容器內(nèi)壁
稀釋
中央
不接
種菌液
斜面
(1)用記號筆標記培養(yǎng)皿中菌落時，應(yīng)標記在皿底上(　　)
(2)用接種環(huán)取出菌種后需馬上塞上裝菌種試管的棉塞，然后再劃線
(　　)
(3)用固體培養(yǎng)基更容易大量擴增酵母菌(　　)
√
×
×
任務(wù)二：酵母菌培養(yǎng)過程的注意事項和結(jié)果分析
1.如何判斷培養(yǎng)基是否被雜菌污染？
探究　核心知識
提示　培養(yǎng)未接種的培養(yǎng)基，觀察是否有菌落生長。如果有，說明培養(yǎng)基被雜菌污染。
2.如果培養(yǎng)基出現(xiàn)不同顏色特征的菌落，你認為出現(xiàn)的原因是什么？
提示　可能是接種的菌種不純或者無菌操作不規(guī)范等。
3.僅從菌落特征是否能夠認定你分離出了酵母菌？怎么進行進一步鑒定？
提示　不能。
可以利用生化實驗及顯微鏡觀察來進一步鑒定，如①挑取單菌落接入糖水中，培養(yǎng)一段時間檢查是否能產(chǎn)生酒味；
②接入面團中觀察能否發(fā)面；
③挑取菌落樣品，制作臨時裝片，在顯微鏡下觀察、識別。
4.判斷液體培養(yǎng)基中接種酵母菌成功的依據(jù)是什么？
提示　和對照組相比，培養(yǎng)基變渾濁。
5.平板倒置的目的是什么？
提示　防止水分過度揮發(fā)；防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基。
6.制作平板和平板劃線法接種時，哪些操作可防止雜菌污染？
提示　(1)倒平板：①要使三角瓶的瓶口通過酒精燈火焰；②不要讓培養(yǎng)基濺在培養(yǎng)皿內(nèi)壁與皿蓋上；③用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，將培養(yǎng)基倒入，立即蓋上皿蓋。
(2)平板劃線法接種：①在酒精燈火焰旁劃線；②接種前將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒；③取菌液前后，要將試管口通過酒精燈火焰；④劃線時將培養(yǎng)皿的皿蓋打開一條縫隙，用接種環(huán)在培養(yǎng)皿表面迅速劃線，劃線后及時蓋上皿蓋。
核心歸納
(1)培養(yǎng)未接種的培養(yǎng)基的目的是檢查培養(yǎng)基制備是否合格。未接種的培養(yǎng)基表面若有菌落生長，則說明培養(yǎng)基被污染，應(yīng)該重新制備；若無菌落生長，則說明培養(yǎng)基未被污染。
(2)在接種酵母菌的固體培養(yǎng)基上可觀察到獨立的菌落，這些菌落在顏色、形狀和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。
(3)若在固體培養(yǎng)基中觀察到不同形態(tài)的菌落，原因可能是菌種不純，混入了其他雜菌，或在實驗操作過程中被雜菌污染。
實驗結(jié)果的分析
3.將接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基都放入37 ℃恒溫箱的目的是
A.對比觀察培養(yǎng)基的成分是否相同
B.對比分析培養(yǎng)基是否被雜菌污染
C.沒必要放入未接種的培養(yǎng)基
D.為了下次接種時再使用
√
落實　思維方法
對未接種的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，起到對照作用，可確定培養(yǎng)基是否被雜菌污染。
4.平板劃線法接種酵母菌時，下列操作正確的是
A.每次劃線時，接種環(huán)都需要蘸取菌液一次
B.劃線分離結(jié)束后接種環(huán)無需再進行滅菌
C.在超凈工作臺上接種時要在酒精燈火焰旁進行
D.劃線分離后將培養(yǎng)皿正放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
√
劃線分離時，菌種只蘸取一次，A錯誤；
劃線分離結(jié)束后，接種環(huán)仍需進行灼燒滅菌，B錯誤；
微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵是無菌操作，在超凈工作臺上接種時，需要在酒精燈火焰旁進行，以防止空氣中微生物的污染，C正確；
劃線分離結(jié)束后，培養(yǎng)皿應(yīng)倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，D錯誤。
網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
課時對點練
三
題組一　純化和分離微生物的方法
1.采用平板法培養(yǎng)微生物的過程中，使微生物均勻分布在培養(yǎng)基上需要用到的工具是
A.接種環(huán) B.涂布器
C.接種針 D.膠頭滴管
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2.如圖表示培養(yǎng)和分離X細菌的部分操作步驟，下列相關(guān)敘述正確的是
A.步驟①倒平板操作時，倒好后應(yīng)立即將其倒過來放置
B.步驟②將接種環(huán)在火焰上灼燒后迅速蘸取菌液后進行平板劃線
C.步驟③應(yīng)多個方向劃線，使菌種逐漸分散，培養(yǎng)后出現(xiàn)單菌落
D.步驟④培養(yǎng)箱培養(yǎng)后可用來對X細菌進行計數(shù)
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步驟①倒平板操作時，倒好后待平板冷卻凝固，然后將其倒過來放置，A錯誤；
步驟②將接種環(huán)在火焰上灼燒后冷卻至室溫再蘸取菌液進行平板劃線，B錯誤；
步驟④培養(yǎng)箱培養(yǎng)后可用來對X細菌進行分離純化，得到單菌落，但不可用來計數(shù)，D錯誤。
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3.(2024·臺州高二期中)如圖為平板劃線法接種微生物的示意圖，下列說法錯誤的是
A.觀察或比較各種細菌菌落形態(tài)的最佳區(qū)域是④
B.劃線時要注意不能將④區(qū)域的劃線與①區(qū)域相連
C.每次劃線后，都應(yīng)將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒
D.劃線結(jié)束時即可看到劃線末端出現(xiàn)不連續(xù)單菌落
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劃線結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后，方可看到劃線末端出現(xiàn)不連續(xù)單菌落，D錯誤。
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4.若在固體培養(yǎng)基上用稀釋涂布平板法接種細菌，看到的培養(yǎng)結(jié)果不可能是
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在利用樣方法調(diào)查種群密度時需注意隨機取樣、樣方的大小和數(shù)量合適，調(diào)查數(shù)據(jù)取平均值，A、B、D三項都符合樣方法的原則，結(jié)果偏差小，C不符合隨機取樣，結(jié)果偏差大，故選C。
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5.稀釋涂布平板法是微生物培養(yǎng)的一種常用的接種方法。下列相關(guān)敘述錯誤的是
A.操作中需要將菌液進行一系列的濃度梯度稀釋
B.不同濃度的菌液均可在培養(yǎng)基表面形成單菌落
C.需將不同稀釋濃度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基表面
D.操作過程中對培養(yǎng)基和涂布器等均需進行嚴格滅菌處理
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稀釋涂布平板法操作中需要將菌液進行一系列的濃度梯度稀釋，以獲得單菌落，A正確；
只有稀釋度足夠高的菌液才可在培養(yǎng)基表面形成單菌落，若稀釋度不夠大，細菌聚集在一起，得不到單菌落，B錯誤；
操作過程中對培養(yǎng)基和涂布器等均需進行嚴格滅菌處理，以防雜菌污染，D正確。
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6.(2024·浙江四校高二聯(lián)考)下列有關(guān)微生物純培養(yǎng)的敘述，正確的是
A.可用稀釋涂布平板法和平板劃線法對微生物進行分離和計數(shù)
B.在酒精燈火焰附近將冷卻至室溫的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿
C.平板劃線法純化菌種，接種環(huán)的灼燒次數(shù)與劃線次數(shù)不同
D.配制培養(yǎng)基的步驟為計算→稱量→溶解→滅菌→調(diào)pH
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稀釋涂布平板法和平板劃線法都能對微生物進行分離純化，但平板劃線法不能用于計數(shù)，A錯誤；
在酒精燈火焰附近將冷卻至60 ℃左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，B錯誤；
平板劃線法純化菌種，接種環(huán)的灼燒次數(shù)比劃線次數(shù)多一次，因為劃線完之后為避免污染還需再灼燒一次，C正確；
配制培養(yǎng)基的步驟為計算→稱量→溶解→調(diào)pH→滅菌，D錯誤。
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題組二　接種、培養(yǎng)并分離酵母菌
7.下列依次表示倒平板、接種的位置以及平板劃線法接種的路徑的示意圖，其中錯誤的是
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8.接種、培養(yǎng)并分離酵母菌最常用的方法是平板劃線法或稀釋涂布平板法。下列有關(guān)這兩種方法的敘述，錯誤的是
A.均將酵母菌接種在固體培養(yǎng)基的表面
B.獲得的每一個菌落均是由一個細胞生長繁殖而來的子細胞集團
C.都應(yīng)在酒精燈火焰附近操作，以防止雜菌污染
D.稀釋分散菌種的原理不同，但均能達到純化酵母菌的目的
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用稀釋涂布平板法分離酵母菌時，如果稀釋度不夠大，獲得的菌落就可能是由多個細胞繁殖形成的，B錯誤。
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9.在培養(yǎng)基配制和微生物接種的過程中，確保無雜菌污染被稱為無菌操作。圖中符合無菌操作要求的有
①三角瓶口通過火焰，并在火焰旁將培養(yǎng)基倒入滅菌培養(yǎng)皿　②盛菌種的試管口在火焰上灼燒　③接種前灼燒接種環(huán)　④接種前培養(yǎng)皿在火焰上灼燒　⑤靠近火焰接種
A.①②③④ B.①②③⑤　　C.①③④⑤ D.②③④⑤
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10.(2024·浙江大學附中高二期中)人體皮膚表面存在著多種微生物，某同學擬從中分離出葡萄球菌。下列有關(guān)敘述不正確的是
A.對配制的培養(yǎng)基進行高壓滅菌
B.使用無菌棉拭子從皮膚表面取樣
C.采用平板劃線法對獲得的菌株進行計數(shù)
D.根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色等進行初步判斷
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培養(yǎng)基通常采用高壓(蒸汽)滅菌法進行滅菌，A正確；
使用無菌棉拭子從皮膚表面取樣，可以防止雜菌污染，B正確；
平板劃線法無法對獲得的菌株進行計數(shù)，應(yīng)該采用稀釋涂布平板法對獲得的菌株進行計數(shù)，C錯誤；
菌落形態(tài)包括菌落的大小、形狀、光澤、質(zhì)地、顏色和透明程度等，每一種細菌在一定條件下形成固定的菌落特征，故可根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色等進行初步判斷，D正確。
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11.(2024·浙江余姚中學高二月考)紙片擴散法是藥敏試驗中一種常用的方法。取少量大腸桿菌的培養(yǎng)液，均勻涂在培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基上，再放上
4片含有鏈霉素(抗生素的一種)的圓形濾紙，然后在無菌適宜條件下培養(yǎng)12～16 h，濾紙片周圍出現(xiàn)抑制大腸桿菌生長的環(huán)圈(簡稱抑菌圈，如圖)。
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下列相關(guān)敘述錯誤的是
A.圖1中的培養(yǎng)基需冷卻至
　60 ℃左右時再倒平板，
　該操作需要在酒精燈旁完成
B.圖2中所示培養(yǎng)基的放置方式能防止水分過快蒸發(fā)和冷凝水珠沖散菌落
C.圖3培養(yǎng)皿上大腸桿菌的接種方式為稀釋涂布平板法，Ⅳ號紙片上抗生
　素濃度最高
D.圖3所示的抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)大腸桿菌菌落的原因是鏈霉素使其發(fā)生了基因
　突變
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對培養(yǎng)液進行滅菌后需先冷卻再倒平板，倒平板時應(yīng)在酒精燈旁進行，可以盡可能減少培養(yǎng)基污染，A正確；
接種后的培養(yǎng)基需要倒置，這樣可以防止培養(yǎng)基中水分過快蒸發(fā)，同時防止冷凝形成的水珠倒流沖散菌落，B正確；
圖3所示為稀釋涂布平板法進行接種，紙片上的抗生素濃度越大，所形成的抑菌圈就越大，故Ⅳ號紙片上的抗生素濃度最高，C正確；
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圖3所示Ⅳ號的抑菌圈中出現(xiàn)了少數(shù)幾個菌落，說明這幾個菌落具有抗藥性，抗藥性的獲得是由于這些細菌發(fā)生了基因突變，抗生素只是將具有抗藥性突變的細菌從中篩選出來，D錯誤。
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12.如圖所示為實驗室使用某種接種方法在培養(yǎng)基上培養(yǎng)某種微生物的結(jié)果。下列相關(guān)說法正確的是
A.該圖最可能是用稀釋涂布平板法進行接種的
B.在操作時，為防止雜菌污染，需進行嚴格的消毒
　和滅菌
C.該種微生物有可能是H5N1病毒
D.該培養(yǎng)基上的菌落分布不均勻，代表純培養(yǎng)失敗
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題圖最可能是采用平板劃線法進行接種的，A錯誤；
病毒無細胞結(jié)構(gòu)，必須寄生在活細胞中才能生存，因此病毒不能用培養(yǎng)基直接培養(yǎng)，C錯誤；
平板劃線法中隨劃線次數(shù)的增加，菌落密度逐漸減小，因此分布不均勻，D錯誤。
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13.(2024·寧波效實中學高二期中)野生型傷寒沙門氏菌(his＋)可合成組氨酸，某種突變體喪失了這種能力，必須在添加組氨酸的培養(yǎng)基上才能生長，稱為組氨酸營養(yǎng)缺陷型(his)。現(xiàn)用兩種方法接種，甲為平板劃線法，乙為稀釋涂布平板法。下列敘述正確的是
A.兩種方法所用培養(yǎng)基均為液體培養(yǎng)基
B.甲接種方法可用于對微生物的分離和計數(shù)
C.乙接種方法可用于對微生物的分離和計數(shù)
D.his菌株接種在不含組氨酸的培養(yǎng)基上能長出菌落
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甲是平板劃線法，乙是稀釋涂布平板法，兩種方法都是在固體培養(yǎng)基上進行接種的操作，A錯誤；
平板劃線法可用于對微生物的分離純化，但不能計數(shù)，B錯誤；
稀釋涂布平板法可用于對微生物的分離和計數(shù)，C正確；
由題意可知，野生型傷寒沙門氏菌可合成組氨酸，his菌株突變體喪失了這種能力，必須在添加組氨酸的培養(yǎng)基上才能生長，D錯誤。
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14.使用特定的接種技術(shù)可以得到目標微生物的單菌落，實現(xiàn)對目標微生物的分離。回答下列問題：
(1)一般情況下，培養(yǎng)基都可以為微生物的生存提供__________________
__________________等。
(2)實驗前需要確定培養(yǎng)基滅菌是否徹底，具體的操作是______________
___________________________________________________________。
水、碳源、氮源、
無機鹽和生長因子
養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)一段時間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落出現(xiàn)
將未接種的培
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(3)下面是四種菌落的分布情況，其中屬于通過稀釋涂布平板法得到的是_______(多選)。
ABC
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15.某研究小組從黃色短桿菌(能合成L－亮氨酸)中篩選L－亮氨酸缺陷型(不能合成L－亮氨酸)突變菌株，實驗流程如圖所示。回答下列問題：
(1)培養(yǎng)基滅菌常用的方法是_________________。
高壓蒸汽滅菌法
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綜合強化
(2)過程①的接種方法是_______________。過程②接種時，先將滅菌后的金絲絨與培養(yǎng)皿A中的菌落接觸一次，然后像蓋印章一樣將菌種連續(xù)接種到培養(yǎng)皿B和C的培養(yǎng)基表面，這種接種方法便于將來比較培養(yǎng)皿B、C中菌落的差異，原因是_________________________________。
稀釋涂布平板法
培養(yǎng)皿B、C中的菌種接種位置相同
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綜合強化
根據(jù)過程①所得培養(yǎng)基中菌落的分布結(jié)果可以判斷，該過程所采用的接種方法為稀釋涂布平板法。
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綜合強化
(3)培養(yǎng)皿A、B、C中的培養(yǎng)基都要使用固體培養(yǎng)基，原因是__________
_____________________。若培養(yǎng)皿B的培養(yǎng)基中含有L－亮氨酸，培養(yǎng)皿C的培養(yǎng)基中不含L－亮氨酸，培養(yǎng)一段時間后菌落生長情況如圖所示，研究人員應(yīng)該從培養(yǎng)皿____(填“B”或“C”)中選取目的菌落。
便于觀察菌
落特征和分離目的菌株
B
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為了便于觀察菌落特征和分離目的菌株，培養(yǎng)皿A、B、C中的培養(yǎng)基都要使用固體培養(yǎng)基。在不含L－亮氨酸培養(yǎng)基中，突變菌株不能生長，而在含L－亮氨酸培養(yǎng)基中能夠生長，因此從培養(yǎng)皿B中的菌落中可挑選出突變菌株。
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