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第2章 細(xì)胞工程
第1節(jié) 植物細(xì)胞工程
照片中兩只可愛(ài)的小猴，分別叫“中中”和“華華”，它們誕生于2017年，一出生就轟動(dòng)了全世界，這是我國(guó)科學(xué)家的研究成果。你知道它們是如何培育出來(lái)的嗎？
在這之前，科學(xué)家培育了胚胎細(xì)胞克降猴，你知道兩者有什么不同嗎？其實(shí)，自1996年首個(gè)體細(xì)胞克隆動(dòng)物多莉羊（Dolly）誕生以來(lái)，人類已經(jīng)成功克隆了馬、牛和豬等大型家畜，但為什么體細(xì)胞克隆猴的誕生能轟動(dòng)世界呢？
第2章 細(xì)胞工程
1902年，哈伯蘭特，提出細(xì)胞全能性的理論。
1958年，斯圖爾德，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細(xì)胞可分化為胚，為細(xì)胞全能性理論提供了強(qiáng)有力的支持。
1960年，科金，用真菌的纖維素酶分解番茄根的細(xì)胞壁，成功獲得了原生質(zhì)體。
1964年，古哈，在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時(shí)，首次得到了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來(lái)的胚。
1971年，卡爾森，誘導(dǎo)煙草種間原生質(zhì)體融合，獲得了第一株體細(xì)胞種間雜種植株。
1974年，土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)。之后，該質(zhì)粒應(yīng)用于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，促進(jìn)了植物細(xì)胞工程與分子生物學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合。
【科技探索之路 · 植物細(xì)胞工程的發(fā)展歷程】
1975年，米爾斯坦和科勒，創(chuàng)立單克隆抗體技術(shù)
1890年，希普，世界上首例胚胎移植成功
1907年，哈里森，
首創(chuàng)了動(dòng)物組織體外培養(yǎng)法
1951年，張明覺(jué)，
發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物精子獲能現(xiàn)象
1958年，格登，體細(xì)胞核移植成功
1959年，試管家兔誕生
1978年，胚胎分割移植工程
1981年，埃文斯，
分離和培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞
1996年，克隆羊誕生
2006年，山中伸彌，
獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
2014年，單細(xì)胞基因組測(cè)序進(jìn)行遺傳病篩查的試管嬰兒誕生
2017年，我國(guó)科學(xué)家首次培育了體細(xì)胞克隆猴
【科技探索之路·動(dòng)物細(xì)胞工程的發(fā)展歷程】
“其茅葺，其葉青青，猶綠衣郎，挺節(jié)獨(dú)立，可敬可慕。迨（dài）夫開(kāi)也，凝情瀼（ráng）露，萬(wàn)態(tài)千妍，薰風(fēng)自來(lái)，四坐芬郁，豈非入蘭室乎！豈非有國(guó)香乎”這是我國(guó)歷史上第一部蘭譜——《金漳蘭譜》（宋·趙時(shí)庚）中對(duì)蘭花的一段描述。
從古至今，我國(guó)人民都把蘭花看作高潔、典雅的象征，很多人喜歡養(yǎng)蘭花。但是，蘭花種子通常發(fā)育不全，在自然條件下萌發(fā)率極低；傳統(tǒng)分株繁殖的方法又存在繁殖周期長(zhǎng)、繁殖率低等問(wèn)題，如果靠自然繁殖，蘭花的價(jià)格可想而知了。如何能讓名貴的蘭花大量、快速地繁殖，從而走入尋常百姓家呢？
從社會(huì)中來(lái)
利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以大量、快速地培育蘭花。
葉子
花瓣
花粉
細(xì)胞
植物體
一
植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)
植物細(xì)胞工程 的基本技術(shù)
植物組織培養(yǎng)
植物體細(xì)胞雜交
植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是什么
細(xì)胞的全能性
1.概念：
細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細(xì)胞的潛能。
2.原因：
生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)（或基因或遺傳信息）。
3.體現(xiàn)全能性的標(biāo)志：
細(xì)胞（或組織或器官）→ 完整個(gè)體或其他各種細(xì)胞
實(shí)例：胡蘿卜韌皮部細(xì)胞發(fā)育成完整植株
受精卵發(fā)育成個(gè)體（動(dòng)植物）
蜜蜂受精卵發(fā)育成工蜂，卵細(xì)胞發(fā)育成雄峰
用一片葉子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株
4.發(fā)育過(guò)程中不體現(xiàn)全能性的實(shí)例：
芽原基只能發(fā)育為芽，葉原基只能發(fā)育為葉
5.發(fā)育過(guò)程中不體現(xiàn)全能性的原因：
基因在特定時(shí)間、空間條件下選擇性表達(dá)
（一）
細(xì)胞的全能性
6.全能性大小的比較：
①受精卵>胚胎干細(xì)胞>生殖細(xì)胞>體細(xì)胞；
②植物細(xì)胞>動(dòng)物細(xì)胞。
隨著細(xì)胞分化程度的不斷提高,細(xì)胞的全能性逐漸降低。
如何激活細(xì)胞的全能性呢？
植物組織培養(yǎng)技術(shù)
外植體
脫分化
愈傷組織
再分化
根、芽等
試管苗
馴化移栽
完整植株
1.概念：
3.一般過(guò)程：
指將離體的植物器官、組織或細(xì)胞等，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其形成完整植株的技術(shù)。
移栽成活
2.理論基礎(chǔ)：
植物細(xì)胞的全能性
外植體
生殖方式：無(wú)性生殖（外植體為體細(xì)胞時(shí)）或有性生殖（外植體為生殖細(xì)胞時(shí)）
分裂方式：有絲分裂
（二）
植物組織培養(yǎng)技術(shù)
（二）
植物組織培養(yǎng)技術(shù)
在___________________條件的誘導(dǎo)下，已經(jīng)分化的細(xì)胞失去其特有的結(jié)構(gòu)
和功能，轉(zhuǎn)變?yōu)開(kāi)____________，進(jìn)而形成_________的過(guò)程。
一定的激素和營(yíng)養(yǎng)等
未分化的細(xì)胞
愈傷組織
排列不規(guī)則，高度液泡化，不定形具有很強(qiáng)分裂能力的薄壁組織團(tuán)塊。
愈傷組織重新分化成芽、根等器官的過(guò)程。
（1）離體狀態(tài)
（2）無(wú)菌操作
（3）種類齊全、比例適合的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)
（4）植物激素（主要是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素）誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)
（5）適宜的外界條件（溫度、pH、光照等）
相關(guān)概念
脫分化：
愈傷組織：
再分化：
適宜的培養(yǎng)條件：
培養(yǎng)基：
（1）狀態(tài)：固體培養(yǎng)基，其中需加入凝固劑，如瓊脂等
（2）成分：水、有機(jī)物（如蔗糖等）、無(wú)機(jī)物、植物激素等
①蔗糖：提供能量、調(diào)節(jié)滲透壓。
②無(wú)機(jī)物：包括大量元素（如N、P、S、K、Ca、Mg等)和微量元素（如Fe、Mn、B、Zn、Mo、Cu等）
③植物激素：主要是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素
（3）其他條件：適宜的溫度、pH等
用酒精擦拭雙手和超凈工作臺(tái)臺(tái)面
→流水沖洗
→酒精消毒30s
→無(wú)菌水清洗2～3次
→次氯酸鈉溶液處理30min
→無(wú)菌水清洗2～3次。
外植體的消毒
外植體的切段
接種外植體
誘導(dǎo)愈傷組織
誘導(dǎo)生芽生根
移栽
外植體的消毒
外植體的切段
將消過(guò)毒的外植體置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中
→用無(wú)菌濾紙吸去表面的水分
→用解剖刀將外植體切成0.5～1cm長(zhǎng)的小段。
探究 實(shí)踐
（三）
菊花的組織培養(yǎng)
外植體的消毒
外植體的切段
接種外植體
誘導(dǎo)愈傷組織
誘導(dǎo)生芽生根
移栽
在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3～1/2插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養(yǎng)瓶上作好標(biāo)記。
注意：接種時(shí)注意外植體的方向，不要倒插！
（將“形態(tài)學(xué)上端”朝上，下端朝下）
接種外植體
探究 實(shí)踐
（三）
菊花的組織培養(yǎng)
外植體的消毒
外植體的切段
接種外植體
誘導(dǎo)愈傷組織
誘導(dǎo)生芽生根
移栽
誘導(dǎo)愈傷組織
培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：
生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素比例1：1、置于黑暗、提供有機(jī)碳源（蔗糖）、 18~22℃培養(yǎng)箱中
探究 實(shí)踐
（三）
菊花的組織培養(yǎng)
外植體的消毒
外植體的切段
接種外植體
誘導(dǎo)愈傷組織
誘導(dǎo)生芽生根
移栽
誘導(dǎo)生芽生根
注意：先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根！須經(jīng)兩次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基。
生芽過(guò)程：
生根過(guò)程：
生長(zhǎng)素比例少、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)、不需光照；
生長(zhǎng)素比例多、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)、需光照。
移栽
移栽前先打開(kāi)封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)幾日。用流水清洗掉根部的培養(yǎng)基后，將幼苗移植到消過(guò)毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中，待其長(zhǎng)壯后再移栽入土。
探究 實(shí)踐
（三）
菊花的組織培養(yǎng)
1）雙手和超凈工作臺(tái)臺(tái)面（酒精）
2）培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）
3）外植體的消毒（酒精、次氯酸鈉）
4）切段用解剖刀滅菌（干熱滅菌）
5）接種和轉(zhuǎn)接的無(wú)菌操作（酒精燈——灼燒）
6）培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)；
7）移栽到消過(guò)毒的環(huán)境中生存一段時(shí)間。
2、在整個(gè)操作過(guò)程中，是如何來(lái)實(shí)現(xiàn)無(wú)菌環(huán)境的？
思考：1.為什么整個(gè)過(guò)程要保證無(wú)菌操作？
避免雜菌在培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)防止有些雜菌危害培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。
探究 實(shí)踐（三）菊花的組織培養(yǎng)回顧實(shí)驗(yàn)
①外植體消毒
②外植體切段
③接種外植體
④誘導(dǎo)愈傷組織
⑤誘導(dǎo)生芽生根
⑥移栽
探究 實(shí)踐
（三）
菊花的組織培養(yǎng)
1. 接種3~4d后，檢查外植體的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)有多少外植體被污染，試分析它們被污染的可能原因。
2. 從剛接種的外植體到長(zhǎng)出愈傷組織需經(jīng)歷多少天？
3. 培育的試管苗能直接移栽到露地嗎？應(yīng)如何操作？
培養(yǎng)基、接種工具滅菌不徹底；
外植體消毒不徹底；
操作過(guò)程不符合無(wú)菌操作要求等。
2周左右
生根苗移栽技術(shù)的關(guān)鍵是既要充分清洗根系表面的培養(yǎng)基，又不能傷及根系。
一般使用無(wú)土栽培方法。培養(yǎng)基質(zhì)要提前消毒，可以向培養(yǎng)基質(zhì)噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的高錳酸鉀，并用塑料薄膜覆蓋12h，掀開(kāi)塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的組培苗要在溫室過(guò)渡幾天，待其長(zhǎng)壯后再移植到大田或盆中。
結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
探究 實(shí)踐
（三）
菊花的組織培養(yǎng)
4. 進(jìn)一步探究
若想探究生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的使用比例對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響，則應(yīng)如何設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)？
① 空白對(duì)照：不加任何激素；
② 實(shí)驗(yàn)組1：生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值為1；
③ 實(shí)驗(yàn)組2：生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值大于1；
④ 實(shí)驗(yàn)組3：生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值小于1。
使用比例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
生長(zhǎng)素
細(xì)胞分裂素
>
生長(zhǎng)素
細(xì)胞分裂素
<
生長(zhǎng)素
細(xì)胞分裂素
＝
有利于根的分化
有利于芽的分化，抑制根的分化
促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)
探究 實(shí)踐
（三）
菊花的組織培養(yǎng)
總結(jié)：菊花的植物組織培養(yǎng)
根、芽
植物體
脫分化
再分化
培養(yǎng)條件：
①無(wú)菌 ②營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)
③適宜環(huán)境條件（溫度、PH、光等） ④植物激素：
遮光
一定的光照
芽發(fā)育成葉，葉肉細(xì)胞中葉綠素的合成需要光照
愈傷組織
離體的植物器官、組織或細(xì)胞（外植體）
愈傷組織重新分化為芽、根等器官
失去特有結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)變成未分化的細(xì)胞
植物激素中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵。生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例和濃度都會(huì)影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向。
如：胡蘿卜的形成層、菊花幼莖段、月季的花藥…
排列不規(guī)則，高度液泡化，呈不定型狀態(tài)的薄壁細(xì)胞
自我檢測(cè)
1.植物組織培養(yǎng)是將離體的植物器官、組織或細(xì)胞等,培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上,給予適宜的培養(yǎng)條件,誘導(dǎo)其形成完整植株的技術(shù),判斷下列有關(guān)植物組織培養(yǎng)的表述是否正確。
(1)高度分化的細(xì)胞只有發(fā)育成一個(gè)完整的生物個(gè)體,才能體現(xiàn)出細(xì)胞的全能性。( × )
(2)植物的每個(gè)細(xì)胞在植物體內(nèi)和體外都能表現(xiàn)出全能性。( × )
(3)在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞的遺傳物質(zhì)一般都會(huì)發(fā)生改變。( × )
(4)誘導(dǎo)愈傷組織期間需要給予光照。( × )
2.下圖為植物組織培養(yǎng)過(guò)程,有關(guān)說(shuō)法正確的是(　　)
A.②試管中的愈傷組織細(xì)胞全能性最高
B.④試管中培育出的個(gè)體都是純合子
C.①→②的過(guò)程需要光照
D.①→④過(guò)程培養(yǎng)基保持不變
答案 A
解析 ①試管中的外植體經(jīng)脫分化形成②試管中的愈傷組織,愈傷組織是未分化的細(xì)胞,在本實(shí)驗(yàn)中全能性最高;植物組織培養(yǎng)屬于無(wú)性生殖,不改變基因型,所以產(chǎn)生的個(gè)體基因型與母本是相同的,可能是純合子也可能是雜合子;脫分化形成愈傷組織的過(guò)程中一般不需要光照;植物組織培養(yǎng)的不同階段需要的條件不同,培養(yǎng)基中所含有的物質(zhì)比例也不同,如生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵激素,它們的濃度、比例等都會(huì)影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向。
3.植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指將離體的植物器官、組織或細(xì)胞等,在人工配制的培養(yǎng)基上,給予適宜的培養(yǎng)條件,誘導(dǎo)其形成完整植株的技術(shù)。關(guān)于菊花組織培養(yǎng)的操作,下列敘述錯(cuò)誤的是(　　)
A.組織培養(yǎng)選擇植物幼嫩的部分作外植體,更易誘導(dǎo)脫分化
B.接種時(shí)用鑷子夾取菊花的外植體,全部插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中
C.將愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基上培養(yǎng),長(zhǎng)出芽后再誘導(dǎo)生根
D.將幼苗先移植到消過(guò)毒的蛭石或者珍珠巖等環(huán)境中,待其長(zhǎng)壯后再移栽入土
答案 B
解析 植物幼嫩部分全能性高,細(xì)胞分裂能力強(qiáng),更容易經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織,A項(xiàng)正確;接種時(shí)用鑷子夾取菊花的外植體,將其部分插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中,而不是全部插入,B項(xiàng)錯(cuò)誤;植株組織培養(yǎng)時(shí),將愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基上培養(yǎng),長(zhǎng)出芽后再轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根,C項(xiàng)正確;進(jìn)行移栽時(shí),將幼苗先移植到消過(guò)毒的蛭石或者珍珠巖等環(huán)境中,待其長(zhǎng)壯后再移栽入土,D項(xiàng)正確。
根、芽
植物體
脫分化
再分化
培養(yǎng)條件：
①離體、無(wú)菌
②營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)
③適宜環(huán)境條件（溫度、PH、光等）
④植物激素：
細(xì)胞分裂素 生長(zhǎng)素
如：胡蘿卜的形成層、菊花幼莖段、月季的花藥…
植物組織培養(yǎng)技術(shù)--過(guò)程
遮光
一定的光照
芽發(fā)育成葉，葉肉細(xì)胞中葉綠素的合成需要光照
排列不規(guī)則，高度液泡化，呈不定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞
愈傷組織
離體的植物器官、組織或細(xì)胞（外植體）
愈傷組織重新分化為芽、根等器官
失去特有結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)變成未分化的細(xì)胞

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