資源簡介

(共34張PPT)
3.2基因工程的基本操作程序
蘇云金桿菌
與載體拼接
普通棉花
（無抗蟲特性）
棉花細胞
抗蟲棉
提取
表達Bt基因
導(dǎo)入
Bt基因
重組DNA分子
培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程
1.目的基因的篩選與獲取
2.基因表達載體的構(gòu)建
目的基因
受體細胞
3.將目的基因?qū)胧荏w細胞
4.目的基因的檢測與鑒定
基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
非編碼區(qū)
非編碼區(qū)
編碼區(qū)
編碼區(qū)上游
編碼區(qū)下游
編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。
非編碼區(qū)：不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段。
基因的結(jié)構(gòu)
1.原核生物的基因結(jié)構(gòu)
啟動子
終止子
編碼區(qū)
非編碼區(qū)
非編碼區(qū)
編碼區(qū)上游
編碼區(qū)下游
連續(xù)的、不間隔的
RNA聚合酶識別并結(jié)合的位點，
驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。
啟動子
本質(zhì)：
位置：
作用：
是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段
位于基因上游
1.原核生物的基因結(jié)構(gòu)
非編碼區(qū)
非編碼區(qū)
編碼區(qū)
編碼區(qū)上游
編碼區(qū)下游
啟動子
終止子
連續(xù)的、不間隔的
終止轉(zhuǎn)錄。
終止子
本質(zhì)：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段
位于基因下游
2.真核生物的基因結(jié)構(gòu)
啟動子
終止子
非編碼區(qū)
非編碼區(qū)
編碼區(qū)
編碼區(qū)上游
編碼區(qū)下游
間隔的、不連續(xù)的
內(nèi)含子
外顯子
外顯子
內(nèi)含子
能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。
能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.真核生物的基因結(jié)構(gòu)
非編碼區(qū)
非編碼區(qū)
編碼區(qū)
編碼區(qū)上游
編碼區(qū)下游
啟動子
終止子
轉(zhuǎn)錄
初級RNA
成熟mRNA
剪切、拼接
原核生物 真核生物
不同點 編碼區(qū)是 的 編碼區(qū)是間隔的、 的
相同點 都有能夠編碼蛋白質(zhì)的 和 具有調(diào)控作用的 區(qū)組成的
連續(xù)
不連續(xù)
編碼區(qū)
非編碼
非編碼序列
=非編碼區(qū)
原核基因
非編碼序列
真核基因
=非編碼區(qū)+內(nèi)含子
1.從基因文庫中獲取
含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。
②cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成
mRNA
雜交雙鏈
單鏈DNA
雙鏈cDNA
(cDNA)
該生物
cDNA文庫
基因組文庫中的基因含有啟動子、終止子、內(nèi)含子，
cDNA文庫中的基因不含以上結(jié)構(gòu)。
與載體連接
導(dǎo)入受體菌群
逆轉(zhuǎn)錄酶
核酸酶H
DNA聚合酶
某一發(fā)育時期
二、目的基因的獲取方法
3.利用PCR獲取和擴增目的基因
1.從基因文庫中獲取
2.通過DNA合成儀直接合成
利用PCR獲取和擴增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。
PCR是一項根據(jù) 的原理，在 提供參與DNA復(fù)制的 與 ，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)。
DNA半保留復(fù)制
體外
各種組分
反應(yīng)條件
PCR——聚合酶鏈式反應(yīng)
參與的組分 在PCR的作用
目的基因DNA
4種脫氧核苷酸
耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)
引物
緩沖液
Mg2+
高溫
使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸（兩種）
打開DNA雙鏈
提供DNA復(fù)制的模板
合成DNA子鏈的原料
催化合成DNA子鏈
維持反應(yīng)體系的pH
激活DNA聚合酶的活性
體外DNA復(fù)制所需的基本條件
第1步：變性
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
當(dāng)溫度超過90℃時，
雙鏈DNA解旋為單鏈。
95℃
PCR的過程
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第2步：復(fù)性
當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。
50℃
長度相同但C-G含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第3步：延伸
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。
72℃
DNA解鏈為單鏈
高溫(95℃)變性
低溫(50℃)復(fù)性
中溫(72℃)延伸
引物結(jié)合到互補DNA鏈
Taq酶從引物起始進行子鏈的合成
PCR過程可以在PCR擴增(PCR儀)中自動完成。
PCR相關(guān)計算
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
1
1
引物A
引物B
擴增一次
中長鏈-短鏈DNA____個
2
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
3
3
擴增兩次
中長鏈-短鏈DNA____個
4
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
7
7
短鏈-短鏈DNA______個
2
出現(xiàn)完整的目的基因
擴增三次
中長鏈-短鏈DNA____個
6
長鏈-中長鏈DNA____個
含有引物A的DNA____個
含有引物B的DNA____個
2
15
15
短鏈-短鏈DNA______個
8
擴增四次
擴增次數(shù) 1次 2次 3次 4次 n次
DNA總數(shù) 21 22 23 24 2n
長鏈-中長鏈DNA
中長鏈-短鏈DNA
短鏈-短鏈 DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2(n-1)
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
PCR相關(guān)計算
一個DNA，一對引物（A與B），通過PCR擴增n次：
①子代DNA分子數(shù)為：___個
②子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為：__個
③子代含有的目的基因數(shù)目：_____個
④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子數(shù)為：______個
⑤復(fù)制過程中共需引物_______個
⑥第n次復(fù)制需要引物___個
2n
2
2n-1
2n＋1 - 2
2n
2n-2n
二、基因表達載體的構(gòu)建
質(zhì)粒
標記基因
復(fù)制原點
啟動子
終止子
限制酶切位點
位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，具有驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的作用。
位于基因下游，使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來。
供目的基因插入載體中
便于重組DNA的篩選
能夠在受體細胞中自我復(fù)制或整合到受體DNA上
目的基因
基因表達載體需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入 ，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。
啟動子和終止子之間的部位
誘導(dǎo)型啟動子
誘導(dǎo)物
作用
激活或抑制
目的基因表達
誘導(dǎo)型啟動子
注意事項
1.基因工程中的基因表達載體≠載體：
基因表達載體與載體相比增加了 。
2.目的基因插入位點不是隨意的：
第三步.將目的基因?qū)胧荏w細胞
一、常用的受體細胞
有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。
二、將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法
1.植物細胞：
2.動物細胞：
3.微生物細胞：
花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
顯微注射技術(shù)
Ca2+處理法（感受態(tài)細胞法）
由于受體細胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，因此，基因表達載體的構(gòu)建也會有差別。
花粉管通道法—植物細胞
②在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進入胚囊。
①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法導(dǎo)入外源DNA
雙子葉、裸子植物
受損
傷口分泌酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)
吸引農(nóng)桿菌向受傷組織集中
將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞中，并且將其整合到該細胞染色體DNA上。
激活Vir區(qū)基因，導(dǎo)致T-DNA加工和轉(zhuǎn)移
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程
（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法
__________插入Ti質(zhì)粒的________中形成重組Ti質(zhì)粒
重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入__________
轉(zhuǎn)化植物細胞
目的基因插入植物細胞中的________________上
目的基因在植物細胞中穩(wěn)定存在并__________
表達
目的基因
T-DNA
農(nóng)桿菌
染色體DNA
(1)第一次拼接
______________________________________________________________________
(2)第二次拼接
______________________________________________________________________
(3)第一次導(dǎo)入
_____________________________________________________________________
(4)第二次導(dǎo)入
____________________________________________________________________
將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上
插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）
兩
兩
將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌
含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細胞（非人工操作）
03
將目的基因?qū)胧荏w細胞
據(jù)圖回答問題：
第1次拼接
第2次拼接
第1次導(dǎo)入
第2次導(dǎo)入
該過程經(jīng)過____次拼接、____次導(dǎo)入？
顯微注射法—動物細胞
目的基因的表達載體
顯微注射
到受精卵中
受精卵發(fā)育
獲得具有新性狀的動物
顯微注射技術(shù)
①體積大，易操作
②全能性高
Ca2+處理法--- 原核細胞
（1）使用Ca2+處理：
可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。
（2）過程
Ca2+處理細胞
感受態(tài)細胞
表達載體與感受態(tài)細胞混合
感受態(tài)細胞吸收DNA分子
大腸桿菌細胞
感受態(tài)
繁殖快，結(jié)構(gòu)簡單
大腸桿菌（p82）
檢測是否插入目的基因
檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄
檢測目的基因是否翻譯
基因表達的過程
生物是否具有新性狀
第四步：目的基因的檢測和鑒定
分子水平的檢測
個體生物學(xué)水平的檢測
DNA
蛋白質(zhì)
mRNA
性狀
檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性
目的：
檢測內(nèi)容：
分子水平的檢測
（1）基因是否插入(DNA)
（2）目的基因是否轉(zhuǎn)錄(mRNA)
方法：
1.PCR技術(shù)
2.分子雜交技術(shù)
需逆轉(zhuǎn)錄為cDNA再進行PCR鑒定
探針
32P
變性
變性
堿基互補配對原則
雜交DNA分子（可檢測）
32P
目的DNA
目的RNA
（3）目的基因是否翻譯
方法:
抗原-抗體雜交技術(shù)
個體生物學(xué)水平的檢測
抗蟲鑒定、抗病鑒定、抗逆鑒定等
轉(zhuǎn)基因生物 鑒定方法 成功標志
抗蟲植物
抗病毒植物
抗鹽植物
抗除草劑植物
飼喂害蟲
害蟲死亡
病毒感染（病毒接種實驗）
未出現(xiàn)病斑
鹽水澆灌
正常生長
噴灑除草劑
正常生長

展開更多......

收起↑