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(共30張PPT)
第2章 細胞工程
第2節(jié) 動物細胞工程
2.2.2 動物細胞融合技術與單克隆抗體
植物體細胞雜交
植物細胞融合
植物組織培養(yǎng)
溫故而知新
運用植物體細胞雜交技術，可以跨越不同種植物之間生殖隔離的屏障，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育出新的作物類型?！　　　　?br/>那么，有沒有技術能讓不同種動物的體細胞進行雜交，培育出集不同細胞優(yōu)勢于一身的動物細胞呢？
動物細胞融合技術
1.動物細胞融合的原理是什么？
2.形成的雜種細胞在遺傳上有什么特點？
3.誘導動物細胞融合的方法有哪些？
4.與植物細胞融合技術相比，特有的是哪種方法，其原理是怎樣的？
【活動】根據(jù)概念，分析以下問題：
細胞膜的流動性
1.概念：
具有兩個或多個細胞的遺傳信息
PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導法
滅活病毒誘導法
就是使兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。
一、動物細胞融合技術
滅活是指用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結構。滅活病毒誘導細胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。
動物細胞融合完成的標志：
相關信息
滅活病毒融合原理
細胞核的融合
2.意義：突破___________的局限，使__________成為可能。
成為研究_________、_________、腫瘤和培育新品種的重要手段; 并用于制備___________。
細胞遺傳
細胞免疫
單克隆抗體
有性雜交
遠緣雜交
3.應用：
（主要）
一、動物細胞融合技術
項目 植物體細胞雜交 動物細胞融合
原理
融合前處理 用_____________和__________去除細胞壁后誘導原生質(zhì)體融合
用____________使細胞分散后誘導細胞融合
誘導融合的方法
雜種植株（或雜交細胞）特點 雜種植株含有兩種生物的遺傳物質(zhì) 雜交細胞具有
意義和用途 克服 不親和的障礙，獲得雜種_________ 突破_________________，使__________成為可能。獲得雜交細胞，用于_______
細胞膜的流動性
植物細胞全能性
細胞膜的流動性
纖維素酶
果膠酶
胰蛋白酶或膠原蛋白酶
物理法（離心，振動，電激）化學法：PEG
物理法（離心，振動，電激）
化學法：PEG
滅活的病毒
遠緣雜交
兩個或多個細胞的遺傳物質(zhì)
遠緣雜交
單克隆抗體制備
植株
有性雜交局限
比較植物體細胞雜交和動物細胞融合
動物細胞融合能體現(xiàn)細胞的全能性嗎？
二、動物細胞融合技術與單克隆抗體
（二）單克隆抗體及其應用
1.早期獲得抗體的方法：
向動物體內(nèi)反復注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。
選擇性必修1 P68
抗原不純
抗體不純
缺點：產(chǎn)量低、純度低，
特異性差。
為解決這一難題，科學家進行了多年的研究和探索。
2.科學家發(fā)現(xiàn)哺乳動物感染病原體后，體內(nèi)會形成相應的B淋巴細胞，這些細胞能分泌抗體，抗體識別并特異性結合病原體，從而抑制病原體的增殖等。動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類超過百萬種，但每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。因此，要想獲得大量單一抗體，必須克隆單一的B淋巴細胞，形成細胞群。
遺憾的是，在體外培養(yǎng)條件下，一個B淋巴細胞是不可能無限增殖的。
如何解決這一難題？
1975年，英國科學家米爾斯坦和德國科學家科勒在前人工作的基礎上，充分發(fā)揮想象力，設計了一個極富創(chuàng)造性的實驗方案：
一種B淋巴細胞
（只產(chǎn)生一種特定抗體）
能在體外大量增殖的骨髓瘤細胞
融合
雜交瘤細胞
產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體
米爾斯坦
科勒
由于發(fā)明了單克隆抗體的制備技術，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎
大量
增殖
單克隆抗體
單克隆抗體：由單個B淋巴細胞經(jīng)過克隆（無限增殖），形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產(chǎn)生的化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體。
合作探究：請同學們自主閱讀教材P48-49，小組合作思考討論完成問題。
3.會有幾種細胞融合方式？雜交瘤細胞具有什么特點？
1.單克隆抗體制備過程中為什么給小鼠注射特定的抗原蛋白？
4.如何大規(guī)模進行培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體？
2.產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞的獲得需要幾次篩選？
各自篩選的方法和目的是什么？
3.制備單克隆抗體的過程
注射特定的抗原
多種B淋巴細胞
骨髓瘤細胞
誘導融合
（1）未融合的細胞
（2）多種雜交細胞：
①B-B細胞、
②瘤-瘤細胞、
③雜交瘤細胞
動物細胞融合
（二）單克隆抗體及其應用
3.制備單克隆抗體的過程：P48~49圖2-16
*不是為了得到抗體！
第一次篩選：獲得雜交瘤細胞
原理細胞膜的流動性
（1）未融合的細胞
（2）多種雜交細胞（3種）
雜交瘤細胞
抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞
（能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞）
用特定的選擇培養(yǎng)基
第一次篩選
克隆化培養(yǎng)、抗體檢測
第二次篩選（可進行多次）
注射到小鼠腹腔內(nèi)
體外培養(yǎng)
獲取單克隆抗體
從小鼠腹水中
從細胞培養(yǎng)液中
動物細胞培養(yǎng)
雜交瘤細胞的特點:
第二次篩選：獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞
優(yōu)點：能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結合，并且可以大量制備
原理細胞增殖
（二）單克隆抗體及其應用
3.制備單克隆抗體的過程：
動物細胞融合（原理：細胞膜的流動性）
*不是為了得到抗體！
第一次篩選：獲得雜交瘤細胞
動物細胞培養(yǎng)（原理：細胞增殖）
第二次篩選：獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞
雜交瘤細胞的特點:
優(yōu)點：能準確地識別抗原的細微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結合，并且可以大量制備
未融合的親本細胞
兩兩融合的細胞
融合的具有同種核的細胞
融合的雜交瘤細胞
B-B細胞
瘤-瘤細胞
只考慮兩兩融合，誘導融合之后，一定會得到所需雜交瘤細胞嗎？
思考1
（二）單克隆抗體及其應用
3.制備單克隆抗體的過程
不一定
二
用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的 B 淋巴細胞。
抗原1
從小鼠脾臟中獲取B淋巴細胞
B細胞1
B細胞2
B細胞3
B細胞4
……
等多種B細胞
培養(yǎng)骨髓瘤細胞
誘導融合
用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選：得到雜交瘤細胞
第一次篩選
如何從不同的雜交瘤細胞中篩選出我們所需要的雜交瘤細胞呢？
單克隆抗體——制備流程
資料：細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑。
B淋巴細胞
骨髓瘤細胞（A）
合成DNA
D途徑
S途徑
D途徑
氨基喋呤
A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3
骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合
多種雜交細胞
既能迅速大量增殖
又能產(chǎn)生抗體
篩選雜交瘤細胞
【知識拓展】
單克隆抗體——制備流程
第二次篩選的目的是獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞,那么如何篩選？
思考2
用96孔板培養(yǎng)和篩選雜交瘤細胞，（每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞），進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選就可獲得。
思考3
選擇抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞，抗體檢測原理是什么？
抗原和抗體能夠特異性結合(分子水平的鑒定）
在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的目的和方法是不相同的。
將雜交瘤細胞群稀釋，約每孔1個細胞進行培養(yǎng)（克隆化培養(yǎng)）
一段時間后，檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體
上清液可與特定抗原結合的培養(yǎng)孔為陽性孔
分泌抗體能跟特定抗原結合的細胞即為所需雜交瘤細胞
補充內(nèi)容：抗體檢測方法（抗原-抗體雜交法）
多孔細胞培養(yǎng)板
抗體檢測板
.單克隆抗體制備過程中的相關考點總結
（1）該過程中應用到的技術_______________________________________
（2）原理_______________________________________
（3）注射特定抗原的目的______________________________________________
___________________________
（4）誘導融合的方法______________________________________
動物細胞特有的誘導融合方法為_______________________
動物細胞融合、動物細胞培養(yǎng)
細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖
用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞
PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法
滅活病毒誘導法
（5）第一次篩選的目的______________________
第一次如何篩選___________________________
篩選原理____________________________________________________
_____________________________
篩選獲得雜交瘤細胞
用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選
在選擇培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長
.單克隆抗體制備過程中的相關考點總結
（6）雜交瘤細胞的特點__________________________________
（7）第二次篩選的目的________________________________________________
如何篩選_______________________________________ ____________
選擇抗體檢測呈___性的雜交瘤細胞，即_____________ _____________
（8）抗體檢測原理_______________________________________
獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞
進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進行多次篩選）
分泌的抗體能與特定的抗原結合
抗原和抗體能夠特異性結合(分子水平的鑒定）
既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體
（9）如何獲取大量所需雜交瘤細胞__________________________________________
_________________
（10）如何獲取單克隆抗體
①體外培養(yǎng)___________________________
②小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)_________________________
（11）單克隆抗體的優(yōu)點_____________________________
_________________________________________________
在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)（接種于培養(yǎng)液中）或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖
從細胞培養(yǎng)液中獲取
從小鼠腹水中獲取
能準確地識別抗原的細微差異，
與特定抗原發(fā)生特異性結合，并且可以大量制備
陽
誘導融合
選擇培養(yǎng)基
抗原-抗體雜交
體外培養(yǎng) 或
小鼠腹腔內(nèi)增殖
多種已免疫
B淋巴細胞
骨髓瘤細胞
未融合、同種融合、多種雜交細胞
多種雜交瘤細胞
單克隆抗體
能分泌所需抗體
的雜交瘤細胞
第一次篩選
第二次篩選
注射特定的抗原
【活動】構建單克隆抗體制備的流程圖，要求用“關鍵文字”+箭頭呈現(xiàn)：
現(xiàn)學現(xiàn)用：請用箭頭把以下部分步驟的字母按正確順序連接起來
B
A
E
C
G
D
H
F
4.單克隆抗體的應用
抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物發(fā)揮治療效應，如殺傷靶細胞。
1、ADC的抗體和藥物各具有什么作用？
討論
4.單克隆抗體的應用
2、除了細胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？
化學藥物、抗癌藥物等。
3、單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優(yōu)勢？
單克隆抗體診斷試劑盒:特異性強，靈敏度高，可大量制備
毒副作用小，療效高等優(yōu)點。
(3)直接用于治療疾病。
4.單克隆抗體的應用
(1)用作診斷試劑(最廣泛的應用)
①實例：
早早孕診斷試劑盒
多種疾病的診斷，如診斷腫瘤、心血管畸形等
病原體鑒定
②原理：
抗原-抗體雜交法
(2)運載藥物(主要用于癌癥的治療)
課堂小結
一、概念檢測
1、下列有關動物細胞融合與植物體細胞雜交的敘述，錯誤的是（ ）
A、它們的原理都涉及細胞膜的流動性
B、都可以用電融合法或PEG融合法誘導融合
C、融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細胞
D、前者主要是為了獲得細胞產(chǎn)品，后者主要是為了獲得雜種植株
2、科學家以SARS病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關敘述正確的是（ ）
利用該單克隆抗體可以診斷是否感染SARS病毒
體外培養(yǎng)單個B淋巴細胞可以獲得針對SARS病毒的單克隆抗體
將等量B淋巴細胞和骨髓瘤細胞混合，經(jīng)誘導融合的細胞即為雜交瘤洗白
將純化的核衣殼蛋白反復注射到小鼠體內(nèi)，從小鼠血清中分離的抗體為單克隆抗體
C
A
二、拓展應用
假如你掌握了動物細胞融合技術，你想用這種技術來解決哪些問題？解決這些問題的
大致思路是怎樣的？這樣做會有什么風險？請查閱相關資料，完善自己的思路，
并形成文字報告，與同學交流
可以利用動物細胞融合技術培育多倍體胚胎，研究其發(fā)育機制，甚至可能利用該技
術培育出新的品種。但是，目前技術還不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等問
題，并且還可能帶來一些倫理方面的問題

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