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(共34張PPT)
生物學（新人教版）
生物技術與工程
第一章 發酵工程
第 1 節
微生物的培養技術及應用（二）
Biology
發酵工程
目錄 /CONTENTS
01
02
03
選擇培養基
微生物的選擇培養
微生物的數量測定
課題背景
自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生 物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合的菌群中不是優勢種群時，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現。
那么我們又如何達成這一目標呢？
資料：1973年，科學家在美國黃石國家公園的熱泉中篩選出耐熱的水生棲熱菌，并從這種菌種提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于體外擴增DNA片段的聚合酶鏈式反應（PCR）。
討論：
1.為什么水生棲熱菌能從熱泉中被篩選出來呢？
問題探討
（P16）
篩選原因：因為熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數微生物，而水生棲熱菌能在70-800C高溫條件下生存。
根據微生物對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。
2. 篩選原則
耐寒微生物
耐熱微生物
石油分解菌
你還知道哪些條件能影響微生物的生存？
pH和氧氣濃度等
資料：1973年，科學家在美國黃石國家公園的熱泉中篩選出耐熱的水生棲熱菌，并從這種菌種提取出耐高溫的DNA聚合酶。這種酶目前已被廣泛用于體外擴增DNA片段的聚合酶鏈式反應（PCR）。
討論：
問題探討
2.這對在實驗室中選擇培養（篩選）特定的微生物有什么啟示？
人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。
（P16）
選擇培養基
1
選擇培養基
01
選擇培養基
1.概念:
2.類型:
在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基稱為選擇培養基。
類型 條件 分離得到的菌種
改變培養條件 70～80℃的高溫
添加某種化學物質 加入青霉素
高濃度食鹽
特殊碳、氮源 石油是唯一碳源
營養缺陷 不加碳源
不加氮源
水生棲熱菌
酵母菌、霉菌等真菌
金黃色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
自養型微生物
固氮菌
01
選擇培養基
尿素的立體結構
【思考·討論】
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質穩定，是現代農業生產中一種重要的氮肥。
尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細菌分解成NH3，再被轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。
而這些細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶。
脲酶催化尿素分解產生NH3，NH3可以為細菌生長的氮源。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
01
選擇培養基
【思考·討論】
在選擇培養基中，以尿素作為唯一氮源，只有能合成脲酶的細菌才能生長發育繁殖。
1.將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方該如何設計？
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4 ·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
瓊脂 15.0g
蒸餾水 定容到1000ml
選擇培養基
01
選擇培養基
2.該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？
【思考·討論】
除以尿素作為唯一氮源外，該培養基的其他營養成分與普通培養基基本相同。
思考：僅通過選擇培養基可以知道1g土塘中有多少能
分解尿素的細菌嗎？
1g土壤中有多少能分解尿素的細菌？
分離：獲得分解尿素的細菌的純培養物
計數：測定分解尿素的細菌的數量
用平板劃線法接種培養結果的圖片如下。請結合圖片分析，平板劃線法能否達到對細菌進行計數的目的？為什么？
　不能，平板劃線法最開始的劃線很可能菌類會長成一片，導致無法計數，此外灼燒接種環的時候也會殺死一部分菌類。
2
微生物的選擇培養
02
微生物的選擇培養
任務：閱讀P17-18，回答問題：
(1). 稀釋涂布平板法的定義。
(2).實驗過程用箭頭畫流程圖。
(3).實驗過程需要設置對照組嗎？
（一）稀釋涂布平板法
1.分離分解尿素的細菌
(1)、稀釋涂布平板法的定義 P17
02
微生物的選擇培養
1.分離分解尿素的細菌
是將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。
（一）稀釋涂布平板法
1.分離分解尿素的細菌
02
微生物的選擇培養
(2)、實驗的具體操作：
制備培養基
土壤取樣
樣品梯度稀釋
取樣涂布平板
培養與觀察
（一）稀釋涂布平板法
1.分離分解尿素的細菌
細菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3~8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。 P19
①土壤取樣
取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。
(2).步驟：
（1）梯度稀釋菌液
02
微生物的選擇培養
土樣需要滅菌嗎？
土樣中含有目的菌，不能滅菌。
（一）稀釋涂布平板法
1.分離分解尿素的細菌
將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 無菌水
90mL無菌水
10g
②樣品的稀釋
2.步驟：
（1）梯度稀釋菌液
02
微生物的選擇培養
稀釋10倍
依次稀釋10倍
（一）稀釋涂布平板法
1.分離分解尿素的細菌
③取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。
④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。
⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。
⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。
微量移液器
(2)稀釋涂布平板法操作
(2).步驟：
02
微生物的選擇培養
（一）稀釋涂布平板法
1.分離分解尿素
的細菌
稀釋涂布平板法操作視頻(2).步驟：02
微生物的選擇培養
（一）稀釋涂布平板法
1.分離分解尿素的細菌
稀釋涂布平板法操作的注意事項：
⑴各操作細節要保證“無菌”，所有操作都應在酒精燈火焰旁進行。
⑵將涂布器浸在盛有體積分數為70%的酒精的燒杯中。取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
（3）不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。
待涂布的菌液被培養基吸收
將平板倒置
30～37℃恒溫培養1～2d后進行計數
2.步驟：
（3）菌落培養
02
微生物的選擇培養
（一）稀釋涂布平板法
1.分離分解尿素的細菌
3
微生物的數量測定
03
微生物的數量測定
任務：閱讀P18，回答問題：
(1). 稀釋涂布平板法為什么可以用于細菌的計數？
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過計數平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。
03
微生物的數量測定
任務：閱讀P18，回答問題：
(2).通過稀釋涂布平板法統計的細菌數目與它的實際數目相同嗎？
因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
03
微生物的數量測定
任務：閱讀P18，回答問題：
(3).為了保證計數結果的準確，計數操作中需要遵循那些計數原則？
1.為了保證結果準確，選擇30-300個菌落的平板進行計數；
2.每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；
03
微生物的數量測定
任務：閱讀P18，回答問題：
(3).為了保證計數結果的準確，計數操作中需要遵循那些計數原則？
1.為了保證結果準確，選擇30-300個菌落的平板進行計數；
如何找到適合計數的平板？
1.在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品進行培養，例如測定土壤中細菌的數量，一般選用一般選用1×104、1×105和1×106倍稀釋的稀釋液進行平板培養，當第一次做這個實驗時可以將稀釋的范圍放寬一點。例如將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養
03
微生物的數量測定
任務：閱讀P18，回答問題：
(3).為了保證計數結果的準確，計數操作中需要遵循那些計數原則？
2.每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。
1.為了保證結果準確，選擇30-300個菌落的平板進行計數；
如何找到適合計數的平板？
防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。
03
微生物的數量測定
任務：閱讀P18，回答問題：
(3).為了保證計數結果的準確，計數操作中需要遵循那些計數原則？
2.每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；
這樣操作的目的是什么？遵行的什么實驗原則？
排出實驗中偶然因素對實驗結果造成的影響。
平行重復實驗的原則。
平板劃線法 稀釋涂布平板法
關鍵操作
接種工具
菌體獲取
優點
缺點
接種環在固體平板培養基
表面連續劃線
接種環
在具有顯著的菌落特征的區域挑取菌體
操作簡單，可以根據菌落的特點
獲得某種微生物的單細胞菌落
不能對微生物計數
①一系列的梯度稀釋
②涂布平板操作
從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體
既可以獲得單細胞菌落，
又能對微生物計數
操作復雜，需要涂布多個平板
涂布器
共同點
都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單細胞菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征。
(4). 嘗試列表比較平板劃線法和稀釋涂布平板法的異同點。
1
稀釋涂布平板計數法
（3）統計菌體數目計算公式：
M代表稀釋倍數
C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數
V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)
每g樣品中的菌落數＝
(C÷V)×M
03
微生物的數量測定
甲同學做此實驗在稀釋倍數105獲得3個平板，菌落數分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數目？
每g樣品中的菌落數＝ 9×107個
一、概念檢測
1.研究人員用無機鹽、瓊脂和石油配制的培養基從被石油污染的土壤中篩選出了一種石油降解菌。判斷下列相關表述是否正確。
（1）這種培養基是一種選擇培養基。（ ）
（2）利用這種石油降解菌可以降解石油。修復土壤。（ ）
（3）相對于未被污染的土壤,從被石油污染的土壤中更容易分離到石油降解菌（ ）
√
√
√
練習與應用
2.用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落數就能推測出樣品中的活菌數,原因是( )
A. 菌落中的細菌數目是固定的
B. 平板上的一個菌落就是一個細菌
C. 通過此方法統計的菌落數與活菌的實際數目相同
D. 平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌
二、拓展應用
1.反芻動物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。請你設計一個實驗從瘤胃中分離出能夠分解尿素的微生物。
提示：反芻動物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡。
①用“尿素為唯一氮源”的選擇培養基進行培養
②創造無氧環境進行培養
練習與應用
謝謝觀看

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