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應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等多學(xué)科的原理和方法，通過細(xì)胞器、細(xì)胞或組織水平上的操作,有目的地獲得特定的細(xì)胞、組織、器官、個體或其產(chǎn)品的一門綜合性的生物工程。
1958年 美國 斯圖爾德
1996年 英國 伊恩·維爾穆特
2017年 “中中”“華華”
細(xì)胞工程
第2章 細(xì)胞工程
第1節(jié) 植物細(xì)胞工程
一 植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)
哈伯蘭特提出了細(xì)胞全能性的理論，但相關(guān)的實(shí)驗(yàn)嘗試沒有成功。
斯圖爾德等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細(xì)胞可以分化為胚，為細(xì)胞全能性理論提供了強(qiáng)有力的支持。
科金用真菌的纖維素酶分解番茄根的細(xì)胞壁，成功獲得了原生質(zhì)體
古哈等在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時，首次得到了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來的胚。
卡爾森誘導(dǎo)煙草種間原生質(zhì)體融合，獲得了第一株體細(xì)胞種間雜種植株。
土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)。之后，該質(zhì)粒應(yīng)用于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，促進(jìn)了植物細(xì)胞工程與分子生物學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合。
1902年
1958年
1960年
1964年
1971年
1974年
【科技探索之路】植物細(xì)胞工程的發(fā)展歷程
從社會中來
高潔、典雅的蘭花頗受人喜歡。但蘭花種子通常發(fā)育不全，繁殖率低，價格不菲。如何讓它大量、快速地繁殖呢，從而走入尋常百姓家呢？
植物組織培養(yǎng)---工廠化生產(chǎn)
植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)
植物組織培養(yǎng)
植物體細(xì)胞雜交
植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是什么
細(xì)胞的全能性
一片花瓣
一個細(xì)胞
一粒花粉
細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細(xì)胞的潛能，即細(xì)胞具有全能性。
(1)定義：
細(xì)胞→ 完整個體或其他各種細(xì)胞
（3)體現(xiàn)全能性的標(biāo)志：
一 細(xì)胞的全能性
（2)原因：
一般情況下，生物體的每一個細(xì)胞含有控制該生物發(fā)育的全部基因(該物種的全套遺傳信息)
種子發(fā)育成植株，體現(xiàn)了植物種子的全能性（ ）
胡蘿卜韌皮部細(xì)胞發(fā)育成完整植株（ ）
受精卵發(fā)育成個體（ ）
胚胎干細(xì)胞分化成其他種類的細(xì)胞（ )
哺乳動物成熟的紅細(xì)胞具有全能型（ ）
芽原基發(fā)育為芽，葉原基發(fā)育為葉體現(xiàn)了全能性（ ）
×
√
√
√
×
×
生長點(diǎn)
葉原基
芽軸
芽原基
枝芽結(jié)構(gòu)示意圖
原因：在特定的時間和空間條件下，細(xì)胞中的基因會選擇性表達(dá)。
(4)生物體內(nèi)細(xì)胞并不都表現(xiàn)出全能性
①按細(xì)胞分化程度比：
②按細(xì)胞分裂能力比：
③不同類型細(xì)胞的全能性：
④不同生物細(xì)胞的全能性：
全能性：分化程度低的＞分化程度高的
全能性：分裂能力強(qiáng)的＞分裂能力弱的
受精卵＞生殖細(xì)胞（如精子、卵細(xì)胞）＞體細(xì)胞
植物細(xì)胞＞動物細(xì)胞
（5)全能性大小比較：
(6)表現(xiàn)全能性的條件：
潛能
怎么才能表現(xiàn)出來呢？
1958年Steward利用胡蘿卜韌皮部誘導(dǎo)分化產(chǎn)生了胚狀體，這是人類第一次獲得了人工胚狀體，并獲得個體植株。
植物組織培養(yǎng)技術(shù)
離體
一定的營養(yǎng)物質(zhì)、植物激素
適宜的溫度、pH等外界條件
無菌環(huán)境
外植體
有絲分裂
植物細(xì)胞的全能性
2生殖方式：
一般是無性生殖
3分裂方式：
4原理：
5成功的關(guān)鍵：
無菌操作
1概念
二 植物組織培養(yǎng)技術(shù)
將離體的植物器官、組織或細(xì)胞等，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其形成完整植株的技術(shù)。
接種外植體
脫分化
誘導(dǎo)愈傷組織
外植體經(jīng)過脫分化形成的不定形的薄壁組織團(tuán)塊
已分化的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)，失去特有的結(jié)構(gòu)和功能，轉(zhuǎn)變成未分化的細(xì)胞，進(jìn)而形成愈傷組織的過程 （重新獲得分裂能力）
誘導(dǎo)生芽
再分化
愈傷組織重新分化成芽、根等器官的過程
誘導(dǎo)生根
移栽成活
6 植物組織培養(yǎng)的流程
外植體
愈傷組織
試管苗
完整植株
脫分化
芽、根等
再分化
(1)流程
(2)決定植物脫分化、再分化的關(guān)鍵因素
外植體
愈傷組織
試管苗
完整植株
脫分化
芽、根等
再分化
關(guān)鍵激素
生長素和細(xì)胞分裂素（濃度 比例）
結(jié)果
比值≈1
比值＜1
比值＞1
促進(jìn)芽的分化
促進(jìn)根的分化
促進(jìn)愈傷組織的形成
生長素用量
細(xì)胞分裂素用量
細(xì)胞分裂素
生長素
芽分化
愈傷組織
根分化
生長素作用：用于誘導(dǎo)細(xì)胞的 和 的分化；
細(xì)胞分裂素作用：促進(jìn)組織細(xì)胞的分裂或促進(jìn) 的分化。
伸長生長
根
芽
巧記：生根分芽中愈傷
(3)脫分化與再分化的比較
接種外植體
誘導(dǎo)愈傷組織
誘導(dǎo)生芽
誘導(dǎo)生根
移栽成活
脫分化
再分化
脫分化 再分化
過程
分裂、分化
結(jié)果
需要條件
有分裂，無分化
有分裂，有分化
形成愈傷組織
形成根、芽
a.離體、適宜的營養(yǎng)
c.生長素與細(xì)胞分裂素的比例適中
d.一般不需光（有光易形成維管組織，不易形成愈傷組織）
a.離體、適宜的營養(yǎng)
c.生長素與細(xì)胞分裂素的比例高或低誘導(dǎo)生根或生芽
d.光照（誘導(dǎo)葉綠素的合成，使試管苗能夠進(jìn)行光合作用）
外植體→愈傷組織
愈傷組織→根 芽
①外植體：
幼嫩的菊花莖段
(細(xì)胞分裂旺盛，容易誘導(dǎo)形成愈傷組織)
②體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精：
對手、超凈工作臺、外植體進(jìn)行消毒
③質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%左右的次氯酸鈉溶液：
對外植體進(jìn)行消毒
④無菌水：
清洗外植體
1材料用具
【探究 實(shí)踐】菊花的組織培養(yǎng)
⑤MS培養(yǎng)基 ( P116)：包括誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基(BA，NAA 0.5mg/L)
誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基(BA 2--3mg/L,NAA 0.02--0.3mg/L)
誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基(部分物質(zhì)用量減半，NAA 0.1mg/L)
作為碳源
提供能量
植物可少量吸收，調(diào)節(jié)滲透壓
葡萄糖和果糖在與蔗糖提供相同數(shù)量碳源的前提下，其造成的滲透壓可能過高。
培養(yǎng)基名稱： ；
物理性質(zhì)： ；
碳源： 。
MS培養(yǎng)基
固體培養(yǎng)基
有機(jī)碳源（蔗糖）
問題1：植物是自養(yǎng)生物，為什么用于植物組織培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基中需要加入有機(jī)物作為碳源？
通常植物體本身進(jìn)行光合作用產(chǎn)生糖類，不需要外部供給糖，但植物組織培養(yǎng)利用的是離體組織或細(xì)胞，在其脫分化過程中不能進(jìn)行光合作用合成糖類，因此必須在培養(yǎng)基中添加糖類，作為碳源和能源物質(zhì)，同時維持細(xì)胞的滲透壓。
問題2：同微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？
微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營養(yǎng)為主。
與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機(jī)營養(yǎng)，含有植物生長必需的大量元素和微量元素，還需要添加植物激素。
3方法步驟
(1)消毒
①雙手,超凈工作臺臺面:
用酒精擦拭
②外植體:
（2)外植體切段:
外植體置于無菌的培養(yǎng)皿中→用無菌濾紙吸去表面水分→用解剖刀將外植體切成0.5～1cm長的小段
消毒與無菌水沖洗
酒精
30S
無菌水洗
2-3次
次氯酸鈉溶液
30min
2-3次
無菌水洗
切割
防止雜菌生長：①雜菌與培養(yǎng)物競爭營養(yǎng)；
②產(chǎn)生有害物質(zhì)危害培養(yǎng)物。
目的：
（3)接種外植體:
過程：在超凈工作臺酒精燈火焰旁，將外植體的1/3～1/2插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養(yǎng)瓶上作好標(biāo)記。
注意：接種時注意外植體的方向，不要倒插（將“形態(tài)學(xué)上端”朝上）
接種
提供營養(yǎng)、調(diào)節(jié)滲透壓
①生長素、細(xì)胞分裂素比例≈1：1
②提供有機(jī)碳源（蔗糖）
培養(yǎng)基：
有利于促進(jìn)愈傷組織的形成
（4)誘導(dǎo)愈傷組織（脫分化）
有光時，往往容易形成導(dǎo)管和篩管等，而不易形成愈傷組織。
①一般不需要光照：
②培養(yǎng)溫度：
③時間：15 20 d
培養(yǎng)條件：
18-220C
不定形的薄壁組織團(tuán)塊
誘導(dǎo)生根
（5)誘導(dǎo)生芽、生根（再分化）
①培養(yǎng)15 20 d后，接種到誘導(dǎo)生芽培養(yǎng)基
②長出芽后，接種到誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基
生長素：細(xì)胞分裂素＜1
每日需要給予適當(dāng)時間和強(qiáng)度的光照（有利于葉綠素的形成，促進(jìn)光合作用）。
思考1：再分化需要避光嗎？為什么？
思考2：為什么要先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根呢？
①根的質(zhì)地較硬，更換培養(yǎng)基時可能會導(dǎo)致根的損傷或斷裂
②先生芽有利于導(dǎo)管、篩管等的對接和形成，為后續(xù)生根過程中物質(zhì)的運(yùn)輸和分配提供便利。
誘導(dǎo)出芽
生長素：細(xì)胞分裂素＞1
(6)移栽培養(yǎng)：
移栽前先打開封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長幾日。
用流水清洗掉根部的培養(yǎng)基后，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中，待其長壯后再移栽入土。
①煉苗：
②移栽：
固體基質(zhì)型，含水量高、
蓄水性強(qiáng)、透性好，適合栽培
珍珠巖,是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經(jīng)急劇冷卻而成的玻璃質(zhì)巖石，有弧形或圓形裂隙，如珍珠的結(jié)構(gòu)，所以被命名為珍珠巖。
蛭石，是一種天然、無毒的礦物質(zhì)，在高溫作用下會膨脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。
4實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評價
(1)接種3～4d后，檢查外植體的生長情況，統(tǒng)計有多少外植體被污染，有多少能正常生長，試分析它們被污染的原因。
培養(yǎng)基、接種工具滅菌不徹底；
外植體消毒不徹底；
操作過程不符合無菌操作要求等。
被污染的外植體
（3）若想探究生長素與細(xì)胞分裂素的使用比例對植物組織培養(yǎng)的影響，則應(yīng)如何設(shè)計對照實(shí)驗(yàn)？
① 空白對照：不加任何激素；
② 實(shí)驗(yàn)組1：生長素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值≈1；
③ 實(shí)驗(yàn)組2：生長素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值＞1；
④ 實(shí)驗(yàn)組3：生長素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值＜1。
①培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）
②外植體的消毒（酒精、次氯酸鈉）
③接種的無菌操作（酒精、酒精燈——灼燒）
④無菌箱中的培養(yǎng)；
⑤移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時間。
（2）在整個操作過程中，是如何來實(shí)現(xiàn)無菌環(huán)境的？
補(bǔ)充：特殊的植物組織培養(yǎng)——花藥離體培養(yǎng)
生殖方式為特殊的 生殖，培養(yǎng)過程中 分裂
花藥
試管苗
脫分化
再分化
愈傷組織
單倍體：植株矮小、高度不育
秋水仙素
誘導(dǎo)
新品種(可育)
有性
只涉及有絲
拓展：植物組織培養(yǎng)的兩種途徑
胚狀體
途徑
器官發(fā)生途徑
外植體
脫分化
愈傷組織
再分化
生芽生根
或胚狀體
生長發(fā)育
試管苗
（移栽到大田）
器官發(fā)生途徑
胚狀體途徑
胚狀體：離體培養(yǎng)條件下，沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過胚胎發(fā)育過程形成的胚狀類似物，因而統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。
拓展：植物組織培養(yǎng)的兩種途徑
外植體
脫分化
愈傷組織
再分化
生芽生根
或胚狀體
生長發(fā)育
試管苗
（移栽到大田）
1.A、B過程分別為 。C是 。
A過程細(xì)胞分裂方式是 ，
B過程細(xì)胞分裂方式是 ,同時也進(jìn)行 。
A過程一般 光照；B過程需要光照，因?yàn)? 。
2.影響A、B過程的關(guān)鍵因素是 ，主要是 和 ，
二者添加的 會影響脫分化和再分化過程。
3.植物組織培養(yǎng)一般是一個 過程。（填“無性繁殖”、“有性繁殖”）
植物體
根、芽或胚狀體
外植體
有絲分裂
細(xì)胞分化
植物激素
細(xì)胞分裂素
生長素
無性繁殖
A
有絲分裂
濃度及比例
C
脫分化、再分化
愈傷組織
不需要
葉綠素的合成需要光照
B
鞏固練習(xí)
1.通過傳統(tǒng)有性雜交能實(shí)現(xiàn)嗎？為什么？
不能，不同種物種間存在生殖隔離。
2.有沒有方法可以打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，獲得“番茄-馬鈴薯雜種植株”呢？
番茄
馬鈴薯
三 植物體細(xì)胞雜交技術(shù)
（2)用什么方法使兩個細(xì)胞能發(fā)生融合？
(1)你認(rèn)為兩個植物的體細(xì)胞進(jìn)行融合，遇到的第一個障礙是什么？用什么方法解決這個障礙？
（3)得到雜種細(xì)胞后，如何培育成植株？
光學(xué)顯微鏡下的煙草細(xì)胞原生質(zhì)體
1概念：
將不同來源的植物細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新植物體的技術(shù)。
閱讀教材，結(jié)合所學(xué)知識，思考：
2 過程
A細(xì)胞
B細(xì)胞
正在融合的原生質(zhì)體
雜種細(xì)胞：再生出細(xì)胞壁
脫分化
再分化
移栽
植物細(xì)胞融合
植物組織培養(yǎng)
雜種植株
愈傷組織
A原生質(zhì)體
B原生質(zhì)體
移栽后的植株
(1)去除細(xì)胞壁
B細(xì)胞
A原生質(zhì)體
B原生質(zhì)體
去壁
去壁
A細(xì)胞
酶解法（纖維素酶和果膠酶）
①方法：
②酶溶液中一般加入一定濃度的無機(jī)鹽離子和甘露醇，目的是？
使酶溶液具有一定的滲透壓，防止原生質(zhì)體吸水過多而漲破，保持原生質(zhì)體形態(tài)正常
①原理：
②方法：
(2)原生質(zhì)體融合
細(xì)胞膜具有流動性
物理方法：電融合法、離心法
化學(xué)方法：聚乙二醇（PEG）融合法、
高Ca2+-高pH融合法
(3)再生出細(xì)胞壁——
B細(xì)胞
A原生質(zhì)體
B原生質(zhì)體
去壁
去壁
A細(xì)胞
正在融合的原生質(zhì)體
融合
融合完成的標(biāo)志
雜種細(xì)胞
有關(guān)細(xì)胞器： 。
高爾基體、
線粒體
再生出細(xì)胞壁
思考：若只考慮原生質(zhì)體的兩兩融合，A種原生質(zhì)體與B種原生質(zhì)體融合后，有哪幾種類型？而我們需要的是哪種類型？
番茄細(xì)胞原生質(zhì)體
馬鈴薯細(xì)胞原生質(zhì)體
PEG
未融合的細(xì)胞
雜種細(xì)胞
自身融合的細(xì)胞
等量混合
因此要對融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選。
(4)植物組織培養(yǎng)
植物體細(xì)胞雜交技術(shù)流程圖
（1）植物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志：
再生出新的細(xì)胞壁
（2）植物體細(xì)胞雜交完成的標(biāo)志：
培育成新植物體
打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種
3 原理
4兩個標(biāo)志
5 意義
細(xì)胞膜具有一定的流動性（原生質(zhì)體融合）
植物細(xì)胞的全能性（雜種細(xì)胞培養(yǎng)成雜種植株）
①雜種植物不一定表達(dá)出人們需要的優(yōu)良性狀
②技術(shù)復(fù)雜、工作量大
6 局限性
植物組織培養(yǎng) 植物體細(xì)胞雜交技術(shù)
原理
過程
意義
聯(lián)系
細(xì)胞膜的流動性和植物細(xì)胞的全能性
植物細(xì)胞的全能性
離體的植物器官、組織或細(xì)胞
愈傷組織
脫分化
再分化
根、芽或胚狀體
植物體
生長發(fā)育
植物組織培養(yǎng)與植物體細(xì)胞雜交技術(shù)
植物細(xì)胞A
植物細(xì)胞B
原生質(zhì)體A
去壁
原生質(zhì)體B
去壁
人工誘導(dǎo)
融合的原生質(zhì)體AB
雜種細(xì)胞AB
愈傷組織
脫分化
再生細(xì)胞壁
雜種植株
再分化
保持優(yōu)良性狀,繁殖速度快、大規(guī)模生產(chǎn)提高經(jīng)濟(jì)效益
植物體細(xì)胞雜交技術(shù)應(yīng)用了植物組織培養(yǎng)技術(shù)
打破生殖隔離，
克服不同種生物遠(yuǎn)緣雜交的障礙
課堂小結(jié)
1.植物體細(xì)胞雜交：
白菜（2N=18）與甘藍(lán)（2N=18）體細(xì)胞雜交所得植株白菜-甘藍(lán)的
細(xì)胞染色體數(shù)為 ，屬于 倍體。
36
（異源）四
2.不同物種的有性雜交：
白菜（2N=18）與甘藍(lán)（2N=18）進(jìn)行雜交（相互授粉）所得植株白菜-甘藍(lán)的細(xì)胞染色體數(shù)為 ，屬于
倍體。
（異源）二
18
基因重組
染色體數(shù)目變異
同源染色體， 正常聯(lián)會， 育
同源染色體， 正常聯(lián)會， 育
變異類型：
變異類型：
植物體細(xì)胞雜交
雜交育種
含有
能
可
不含
不能
不可
拓展：植物體細(xì)胞雜交與變異
植物A體細(xì)胞染色體數(shù)20條 植物B體細(xì)胞染色體數(shù)40條 有性雜交 后代體細(xì)胞中染色體數(shù) 條
植物體細(xì)胞雜交 后代體細(xì)胞中染色體數(shù) 條
植物A為二倍體 植物B為四倍體 有性雜交 后代為 倍體
植物體細(xì)胞雜交 后代為 倍體
30
60
三
六
植物體細(xì)胞雜交得到的雜種植株是不同于兩個親本的 。
新物種
（1）圖中過程：①為 ，②為 ，
③為 ，④為 ，⑤為 。
（2）細(xì)胞融合成功的標(biāo)志是 ，
植物體細(xì)胞雜交技術(shù)成功的標(biāo)志是 。
（3）植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的原理是 。
（4）植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的意義是 。
去除細(xì)胞壁
誘導(dǎo)細(xì)胞融合
再生出新的細(xì)胞壁
脫分化
再分化
再生出新的細(xì)胞壁
形成雜種植株
細(xì)胞膜的流動性和植物細(xì)胞的全能性
打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交
鞏固練習(xí)
一 概念檢測
1.下圖是利用甲、乙兩種植物的各自優(yōu)勢，通過植物細(xì)胞工程技術(shù)培育高
產(chǎn)、耐鹽的雜種植株的實(shí)驗(yàn)流程圖。下列相關(guān)敘述錯誤的是( )
A.進(jìn)行a處理時能用胰蛋白酶
B.b是誘導(dǎo)融合后得到的雜種細(xì)胞
C.c是培養(yǎng)后得到的具有耐鹽性狀的幼芽
D.進(jìn)行d選擇時要將植株種在高鹽環(huán)境中
2.科學(xué)家在制備原生質(zhì)體時，有時使用蝸牛消化道提取液來降解植物細(xì)胞
的細(xì)胞壁。據(jù)此分析，蝸牛消化道提取液中可能含有什么成分？
纖維素酶和果膠酶
A
練習(xí)與應(yīng)用
"番茄—馬鈴薯"雜種植株沒有如科學(xué)家所想象的那樣，地上結(jié)番茄，地下長馬鈴薯，這是為什么
生物體內(nèi)基因的表達(dá)不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，所以"番茄—馬鈴薯"雜種植株的細(xì)胞中雖然具備兩個物種的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達(dá)相互干擾，它們不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達(dá)，雜種植株自然就不能地上結(jié)番茄、地下長馬鈴薯了。
二 拓展應(yīng)用

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