資源簡介

(共34張PPT)
基因工程
基因工程的基本操作程序
【學習目標】
1.簡述目的基因的篩選和獲取方法
2.簡述PCR的原理、條件及過程
【重難點】
利用PCR獲取和擴增目的基因
目 錄
目的基因的篩選與獲取
01
DNA片段的擴增及電泳鑒定
02
轉基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡，左）與非轉基因抗蟲棉（右）
1997年，我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節支社會經濟效益450億元。
你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？
從社會中來
01
目的基因的篩選與獲取
蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲。科學家通過實驗，將該細菌的“殺蟲基因”轉到棉花里，讓棉花也能產生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。
這個“殺蟲基因”就是培育轉基因抗蟲棉用到的
目的基因——Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因
第一步：目的基因的篩選與獲取
目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因
主要指編碼蛋白質的基因
目的基因的種類：根據需求的不同，目的基因也不同，如生物抗逆性、生產藥物、毒物降解和工業用酶等相關的基因
那么，如何篩選與獲取目的基因呢？
第一步：目的基因的篩選與獲取（篩選合適的目的基因）
隨著測序技術的發展，以及序列數據庫（GenBanK）、序列比對工具（如BLAST）等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能
從相關的已知結構和功能清晰地基因中進行篩選是較為有效的方法
第一步：目的基因的篩選與獲取
1.通過化學方法直接人工合成目的基因
獲取目的基因的方法
DNA合成儀
要求：①基因比較小
②核苷酸序列已知的基因
2.通過構建基因文庫獲取目的基因
基因文庫種類：①基因組文庫（包含一種生物的所有基因）
②部分基因文庫（只包含一種生物的部分基因，如cDNA文庫）
第一步：目的基因的篩選與獲取
拓展：基因文庫的構建過程
某生物體全部DNA
許多DNA片段
受體菌群體
限制酶
與載體連接、導入
受體菌群體
cDNA
某生物體發育的某個時期的mRNA
逆轉錄
與載體連接、導入
基因組文庫
cDNA文庫
第一步：目的基因的篩選與獲取
3.利用PCR獲取和擴增目的基因（常用）
蘇云金桿菌
Bt基因
？
快速獲得大量Bt基因
提取
前提：已知目的基因或其上下游的核苷酸序列
引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸
（長度通常為20-30個核苷酸）
⑴ 全稱：聚合酶鏈式反應
⑵ 原理：DNA的半保留復制（在體外大量復制目的基因的核苷酸序列）
⑶ 原料：DNA模版、引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶
第一步：目的基因的篩選與獲取
復習回顧：DNA復制
堿基互補配對原則（A與T、C與G配對保證復制的準確進行）
(2)條件:
4種游離的脫氧核苷酸
DNA的兩條鏈
DNA解旋酶、DNA聚合酶等
ATP
(3)復制原則:
能量：
模板：
原料：
酶：
半保留復制、邊解旋邊復制
(1)特點:
合成子鏈
解旋
形成新DNA
解旋酶
DNA聚合酶
第一步：目的基因的篩選與獲取
DNA復制和PCR反應的條件對比
解旋酶
DNA母鏈
4種脫氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常為小的單鏈RNA）
無需解旋酶，用高溫代替
DNA（目的基因）模板
4種脫氧核苷酸（dNTP)
耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）
引物（通常為小的單鏈DNA至少需要2種引物）
反應還需要其它條件，如控溫系統、緩沖液（一般添加Mg2+）---能夠調節pH，激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶
第一步：目的基因的篩選與獲取
（5） PCR擴增的過程
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變性
雙螺旋解開
PCR儀
①變性：當溫度超過90℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈
第一步：目的基因的篩選與獲取
②復性：溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合
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復性
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兩種引物
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注意：復性溫度過高會破壞引物與模板堿基互補配對
復性溫度過低，會造成引物與模板結合位點增加，導致非特異性產物增加
第一步：目的基因的篩選與獲取
③延伸：當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈
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延伸
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第一步：目的基因的篩選與獲取
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第一輪循環的產物作為第二輪反應模板，經過變性、復性和延伸三步產生第二輪循環產物
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第一步：目的基因的篩選與獲取
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第二輪循環的產物作為第三輪反應模板，經過變性、復性和延伸三步產生第三輪循環產物
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第一步：目的基因的篩選與獲取
（6） 結果與鑒定
①結果：重復循環多次，每一次循環后目的基因的量可以增加一倍，即成指數形式擴增（約為2n，其中n為擴增循環的次數
水平電泳儀
②鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物
探究·實踐
DNA片段的擴增及電泳鑒定
DNA片段的擴增及電泳鑒定
1.PCR在體外進行DNA片段的擴增原理
PCR利用了DNA熱變性和DNA半保留復制的原理。
2.DNA片段電泳鑒定的原理
DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。
在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構像等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。
DNA片段的擴增及電泳鑒定
3.材料用具
（1）試劑
①4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。
②電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。
③PCR反應體系的配方(見教材)
DNA片段的擴增及電泳鑒定
（2）用具
①PCR儀 （自動控溫，實現DNA的擴增）
②微量離心管 （實際上是進行PCR反應的場所）
③微量移液器 （用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）
④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）
⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）
PCR儀
微量離心管
DNA片段的擴增及電泳鑒定
DNA片段的擴增及電泳鑒定
（1）移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。
PCR反應體系的配方 10倍濃縮的擴增緩沖液 5ul
20mmol/l 的4種脫氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
總體積 50ul
（2）離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部。
（3）擴增：參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。
4.方法步驟（PCR）
DNA片段的擴增及電泳鑒定
4.方法步驟（電泳鑒定）
（1）配制瓊脂糖溶液：根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。
（2）制備凝膠：將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。
DNA片段的擴增及電泳鑒定
（3）加樣：將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物（Marker）。
（4）電泳、觀察：接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。
DNA片段的擴增及電泳鑒定
注意
1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。
2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。
3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。
4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。
5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。
DNA片段的擴增及電泳鑒定
5. 結果分析與評價：
（1）你是否成功擴增出 DNA 片段的斷依據是什么？
在紫外燈下直接觀察DNA條帶的分布及粗細程度（條帶的分布代表擴增產物的類型；條帶的粗細代表擴增產物量的多少）。
（2）通過電泳條帶能否確定擴增產物一定是所需的DNA 片段？為什么？
不能；因為電泳條帶僅能顯示擴增片段的大致長度，不能顯示精準的DNA堿基數量，也不能呈現堿基序列。
課堂小結
目的基因的
獲取與篩選
篩選合適的目的基因
獲取目的基因
測序技術、序列數據庫、序列對比工具
利用化學方法人工合成目的基因
通過構建基因文庫獲取目的基因
利用PCR獲取和擴增目的基因
隨堂練習
1.下列不屬于獲取目的基因的方法的是( )
A.從基因組文庫中獲取目的基因
B.利用PCR技術體外擴增目的基因
C.利用逆轉錄法獲取目的基因
D.利用DNA連接酶復制目的基因
答案：D 解析：獲取目的基因的方法有：從基因組文庫中獲取目的基因、利用PCR技術體外擴增目的基因、利用逆轉錄法獲取目的基因等。DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，利用DNA連接酶不能復制目的基因，故選D。
隨堂練習
2.傳統的多重PCR（MPCR）是在普通PCR的基礎上，在同一個反應體系中加入不同的引物對，針對不同的模板或同一模板的不同區段進行特異性的擴增，從而得到多個目的片段的技術。隨著科學技術的發展，MPCR技術在擴增方面取得新的突破，不再局限于在同一反應管中進行擴增，而是將不同的引物對和模板分散于相應獨立的空間中進行擴增。下列相關敘述錯誤的是( )
A.對于同一DNA片段的不同區段進行擴增時，不同引物的堿基排列順序不能互補
B.同一反應體系中擴增不同模板時需加入更多耐高溫的DNA聚合酶才能使擴增正常進行
C.在目的DNA片段擴增時，若復性階段溫度控制過高，可能導致無產物
D.PCR擴增DNA時打開雙螺旋的方式與細胞內不同，實質都是磷酸二酯鍵斷裂
解析：A.對同一模板不同區段進行擴增時，不同引物的堿基排列順序不能互補，如果互補就會形成雙鏈，不能與模板鏈結合，不能完成擴增，A正確；B.在同一反應體系中擴增不同模板時需要加入更多耐高溫的DNA聚合酶才能使擴增正常進行，因為擴增不同片段需要結合的酶的數量較多，B正確；C.在目的片段擴增時，溫度的控制是實驗成敗的關鍵，若復性階段溫度控制過高，導致引物不能與模板鏈結合，可能導致無產物，C正確；D.PCR擴增DNA時通過高溫將雙螺旋打開，而細胞內進行DNA復制通過解旋酶將雙螺旋打開，二者斷裂的都是氫鍵，D錯誤。
D
隨堂練習
3.反向PCR是一種通過已知序列設計引物對未知序列進行擴增的技術,其過程如圖所示。下列敘述正確的是( )
A.環化階段,可選E.coli DNA連接酶而不能選T4DNA連接酶
B.圖中環狀DNA進行PCR的過程中,沿左側引物延伸子鏈的方向是逆時針
C.PCR產物是包含所有已知序列和未知序列的環狀DNA分子,其中含有EcoR I的酶切位點
D.應選擇引物2和引物3進行PCR擴增
答案：B 解析：圖示末端為黏性末端,所以環化階段,可選E.coli DNA連接酶也能選T4DNA連接酶,A錯誤。據圖中未知序列的位置可知,圖中環狀DNA進行PCR的過程中,沿左側引物延伸子鏈的方向是逆時針,沿右側引物延伸子鏈的方向是順時針,B正確。根據題意和圖示可知,DNA分子被限制酶EcoR I切割后環化,再通過PCR擴增得到包含所有已知序列和未知序列的鏈狀DNA分子;未知序列含有EcoR I的切割位點,故PCR產物含有EcoR I的酶切位點, C錯誤。DNA子鏈合成的方向是5'→3',要通過已知序列設計引物,應選擇引物1和引物4進行PCR擴增,D錯誤。
隨堂練習
4.熒光定量PCR技術是在常規PCR的基礎上，加入與模板DNA某條鏈互補的熒光探針（一類兩端經過特殊基團修飾的單鏈DNA片段），當子鏈延伸至探針處時DNA聚合酶會水解掉探針一端并生成熒光分子，使熒光監測系統接收到熒光信號，即DNA每擴增一次，就有一個熒光分子生成，原理如圖所示。下列有關敘述正確的是( )
A.該項技術可用來直接檢測樣本中新冠病毒核酸的含量
B.1個雙鏈DNA分子經過3輪循環一共會生成8個熒光分子
C.1個雙鏈DNA分子經過5輪循環一共需要消耗15對引物
D.該PCR技術中DNA聚合酶既催化形成磷酸二酯鍵，又催化斷裂磷酸二酯鍵
答案：D 解析：A、利用熒光定量PCR技術可以進行DNA的含量測定，模板DNA越多，熒光信號越強，而新冠病毒的核酸為RNA，無法直接用該技術檢測，A錯誤；
B、熒光探針只能跟模板DNA的某條鏈互補配對，DNA分子每擴增一次，就有一個熒光分子生成，3輪循環后得到8個DNA分子，即擴增形成了7個新DNA分子，一共會生成1+2+4=7個熒光分子，B錯誤；
C、1個雙鏈DNA分子經過5輪循環一共會形成32個DNA分子，即形成64條鏈，其中62條鏈都是新合成的，一共需要消耗31對引物，C錯誤；
D、子鏈延伸時DNA聚合酶可在子鏈的3'端不斷添加脫氧核苷酸，從而形成磷酸二酯鍵，當子鏈延伸至探針處時DNA聚合酶可以利用5'-3'外切酶活性水解DNA單鏈探針的一端，使其有關基團出現熒光，D正確。

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