資源簡介

(共31張PPT)
基因工程
基因工程的基本操作程序
【學習目標】
1.闡明基因工程的原理和基本操作程序。
2.針對人類生產或生活中的某一需求，選取適當的基因工程的技術和方法，嘗試設計獲得某一轉基因產品的方案
【重難點】
1.將目的基因導入受體細胞的具體操作方法。
2.目的基因的檢測與鑒定的方法
目 錄
基因表達載體的構建
01
03
目的基因的檢測與鑒定
將目的基因導入受體細胞
02
01
基因表達載體的構建
（核心步驟）
基因表達載體的構建（核心步驟）
1.構建基因表達載體的目的：
（1）使目的基因在受體細胞中穩定存在，且可以遺傳給下一代；
（2）使目的基因能夠在受體細胞中表達和發揮作用。
2.基因表達載體的組成
思考：各原件的作用是什么？
基因表達載體的構建（核心步驟）
注意：啟動子≠密碼子
啟動子：
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA
復制原點：
DNA復制的起始位點
標記基因：便于重組DNA分子的篩選和鑒定
終止子：
位置：基因的下游
功能：終止轉錄
目的基因：能控制表達所需要的特殊性狀
目的基因插入到啟動子和終止子之間
基因表達載體的構建（核心步驟）
項目 啟動子 終止子 起始密碼子 終止密碼子
本質
位置
功能
啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比
RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA
翻譯的起始信號(編碼氨基酸)
使轉錄在所需要的地方停下來
翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)
目的基因上游
mRNA尾端
mRNA首端
目的基因下游
DNA
DNA
mRNA
mRNA
基因表達載體的構建（核心步驟）
3.基因表達載體的構建過程：
① 用一定的限制酶切割載體，使其出現一個切口
② 用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
③ 將切下的目的基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子
基因表達載體
基因表達載體的構建（核心步驟）
質粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
圖1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
圖2
（1）構建基因表達載體時，能否用Sma Ⅰ限制酶切割質粒？為什么？
不能；因為Sma Ⅰ切割會破壞質粒的抗生素抗性基因（抗生素抗性基因是質粒上的標記基因，若被破壞，無法進一步篩選重組DNA分子）
基因表達載體的構建（核心步驟）
質粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
圖1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
圖2
（2）若只用EcoR Ⅰ限制酶切質粒和外源 DNA，則構建基因表達載體時會出現哪些結果？
質粒自身環化
正向連接
反向連接
目的基因多拷貝與質粒連接
基因表達載體的構建（核心步驟）
質粒
抗生素
抗性基因
Sma Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
圖1
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
目的基因
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
外源 DNA
圖2
（3）為避免出現上述情況可以選擇什么限制酶對質粒和外源 DNA 進行切割？
使用 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA
雙酶切法
優點：①避免質粒自身環化
②有利于載體與目的基因正向連接，避免反向連接
基因表達載體的構建（核心步驟）
4. 限制酶的選擇原則
（1）不破壞目的基因：切點應位于目的基因兩端，如圖甲中可選擇Pst Ⅰ，而不選擇Sma Ⅰ
至少要保留一個標記基因，以用于重組DNA的鑒定和篩選。
（2）保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇Sma Ⅰ
基因表達載體的構建（核心步驟）
（3）確保出現相同黏性末端原則：
切割目的基因與質粒所選的限制酶應產生相同的黏性末端
①可以選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質粒，如圖中Pst Ⅰ
②為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接（或為了保證目的基因和質粒發生定向連接），應使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖也可選擇Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制酶。
02
將目的基因導入受體細胞
將目的基因導入受體細胞
根據受體細胞和載體的不同，所采用的導入方法也不同
1.植物細胞
①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
②在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊
受體細胞：受精卵或體細胞
（1）花粉管通道法（我國科學家獨創）
將目的基因導入受體細胞
（2）農桿菌轉化法
①轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程
實質是基因重組
a. 能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力
b. 農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上
③ 利用農桿菌進行轉化的思路：
②農桿菌特點：
受體細胞：受精卵或體細胞
將目的基因插入Ti質粒的T-DNA中，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞
將目的基因導入受體細胞
植物細胞
染色體DNA
新性狀植株
農桿菌
植物細胞
表達載體
目的基因
Ti質粒
構建
轉入
導入
插入
表達
（2）農桿菌轉化法
將目的基因導入受體細胞
2.動物細胞——顯微注射法
構建基因表達載體并提純
利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中
早期胚胎培養
胚胎移植
獲得具有新性狀的動物
（2）過程
體積大
易操作
全能性高
易培養成完整個體
（1）受體細胞：受精卵
將目的基因導入受體細胞
3.微生物細胞——Ca2+處理法
繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養
大腸
桿菌
Ca2+
表達
載體
Ca2+ 處理法示意圖
使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態
Ca2+處理細胞
將重組的基因表達載體導入其中
這種細胞稱為感受態細胞
（2）過程
Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性
（1）受體細胞：常用原核細胞（大腸桿菌應用最為廣泛）
03
目的基因的檢測與鑒定
目的基因的檢測與鑒定
1.分子水平檢測
提取
DNA
轉基因棉花
PCR
是否擴增出目的基因
利用 Bt 基因的核苷酸序列設計引物
M：marker
1-6：轉基因棉花
7：非轉基因棉花
8：陰性對照
電泳
如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因
（1）轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因——利用PCR等技術檢測
目的基因的檢測與鑒定
（2）目的基因是否轉錄出mRNA——利用PCR等技術檢測
提取棉花細胞 mRNA
逆轉錄
得到 cDNA
用以 Bt 基因序列設計的
引物進行 PCR 擴增
電泳
檢測
Bt
M3
C0
T-9
T-2
T-51
T-5
T-23
T-11
T-20
T-21
T-34
T-10
10個 PCR 陽性棉花植株中，有四株 Bt 基因發生轉錄
如：檢測 Bt 基因是否轉錄出 mRNA
目的基因的檢測與鑒定
除PCR技術外，還可以利用基因探針來檢測目的基因是否導入或者轉錄
原理：在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA或mRNA雜交（遵循堿基互補配對原則），若出現雜交帶，則目的基因插入成功或轉錄出mRNA
DNA分子雜交技術
目的基因的檢測與鑒定
（3）目的基因是否翻譯成蛋白質——抗原-抗體雜交
如：檢測 Bt 基因是否翻譯出 Bt 抗蟲蛋白
從轉基因棉花中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原-抗體雜交，若出現雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質
目的基因的檢測與鑒定
2.個體生物學水平鑒定
例：通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度
（2）基因工程產品的功能活性——比較基因工程產品與天然產品的功能活性
（1）生物體是否表達出目標性狀及其表達水平——抗蟲性、抗旱性、抗病性檢測
目的基因的檢測與鑒定
個體水平檢測的具體方法及成功標志
轉基因生物 鑒定方法 成功標志
抗蟲植物 飼喂害蟲（抗蟲接種實驗） 害蟲死亡
抗病毒（菌植物） 病毒（菌）接種實驗 未染病
抗鹽植物 澆灌一定濃度的鹽水 正常生長
抗除草劑植物 噴灑一定濃度的除草劑 正常生長
獲取目的基因產物的轉基因生物 提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較 功能、活性正常
課堂小結
組成：復制原點、啟動子、終止子、目的基因、標記基因
利用個體生物學水平的檢測目的基因是否表達
構建基因文庫
通過化學方法人工合成
PCR技術擴增
花粉管通道法、農桿菌轉化法
顯微注射法
Ca2+處理法
利用DNA分子雜交技術檢測目的基因的有無
利用分子雜交技術檢測目的基因是否轉錄
利用抗原-抗體雜交檢查檢測目的基因是否轉錄
目的基因的
篩選與獲取
目的基因的
檢測與鑒定
構建
基因表達載體
目的基因
導入受體細胞
基因工程的基本操作程序
隨堂練習
1.科學家在人類的基因組中發現36種病毒基因的片段,并提取相關基因片段進行擴增及電泳鑒定。下列敘述正確的是( )
A.用PCR儀進行擴增時,擴增緩沖液中一般要添加Ca2+
B.基因片段擴增過程中,脫氧核苷酸會依次加到引物的5'端
C.電泳時,在凝膠中基因片段的遷移速率與DNA分子的構象無關
D.將基因片段與凝膠載樣緩沖液的混合液加入凝膠加樣孔時,要留一個加樣孔加標準參照物
解析：真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需Mg2+激活,因此,用PCR儀進行擴增時,擴增緩沖液中一般要添加Mg2+,A錯誤;基因片段擴增過程中,脫氧核苷酸會依次加到引物的3’端,B錯誤；電泳時,在凝膠中基因片段的遷移速率與DNA分子的大小、構象都有關,C錯誤；將基因片段與凝膠載樣緩沖液的混合液加入凝膠加樣孔時,要留一個加樣孔加指示分子大小的標準參照物,D正確
D
2.重組新型冠狀病毒疫苗的制備原理是將新型冠狀病毒S蛋白受體結合區(RBD)基因通過基因工程技術重組到中國倉鼠卵巢(CHO)細胞內，在體外大量表達出RBD二聚體，提取后制備成疫苗。下列敘述正確的是( )
A.CHO細胞作為新型冠狀病毒的宿主細胞，提供病毒所需的營養物質
B.新型冠狀病毒的RBD基因可以直接重組到CHO細胞的DNA分子上
C.體外培養重組CHO細胞時需添加適量的干擾素防止雜菌污染
D.要檢測RBD基因在CHO細胞中成功表達，可用抗原-抗體雜交方法
解析：A、CHO細胞不是新型冠狀病毒的宿主細胞，中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是基因工程的受體細胞，A錯誤； B、新型冠狀病毒為RNA病毒，不能直接與CHO中的DNA重組，B錯誤； C、體外培養重組CHO細胞時需添加適量的抗生素，其目的是防止雜菌污染，C錯誤； D、可用抗原-抗體雜交技術檢測目的基因是否成功表達出蛋白質，D正確
D
3.蘇云金桿菌會合成Bt抗蟲蛋白，在棉鈴蟲的堿性腸道環境中，Bt抗蟲蛋白在特定酶的作用下產生毒性，導致棉鈴蟲死亡。我國科學家利用花粉管通道法成功培育出轉Bt基因的抗蟲棉。下列說法錯誤的是( )
A.可根據蘇云金桿菌的DNA特定序列設計引物，用PCR技術擴增獲得Bt基因
B.需要構建含Bt基因的基因表達載體，然后將基因表達載體導入棉花細胞
C.Bt基因可以整合到棉花染色體上，抗蟲棉自交后代不會發生性狀分離
D.Bt抗蟲蛋白具有高度專一性，對害蟲天敵、人畜均無毒性，在環境中易分解
解析：蘇云金桿菌會合成Bt抗蟲蛋白，所以可以根據蘇云金桿菌的DNA特定序列設計引物，用PCR技術擴增獲得Bt基因，A正確；為了使Bt基因能夠表達和發揮作用，需要構建基因表達載體，然后將基因表達載體導入棉花細胞，B正確；Bt基因可以整合到棉花染色體上，由于只有1條染色體上含有抗蟲基因，因此該抗蟲棉自交后代會發生性狀分離，C錯誤;Bt抗蟲蛋白在特定酶的作用下產生毒性，具有高度專一性，對害蟲天敵、人畜均無毒性，其本質是蛋白質，所以在環境中易分解，D正確
C
4.用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同
B.若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用Sph Ⅰ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否
D.若用Sph Ⅰ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養基中能形成菌落
解析：若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉錄的產物可能不同，A正確。 若用Pvu Ⅰ酶切，重組質粒和質粒中都有四環素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環素)培養基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質粒的大小與質粒不同，能夠鑒定重組質粒構建成功與否，C正確；Sph Ⅰ的酶切位點位于四環素抗性基因中，若用Sph Ⅰ酶切，重組質粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養基中能形成菌落，在含Tet的培養基中不能形成菌落，D錯誤
D

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