資源簡介

考題分布 考查類型 命題分析
2020·山東·T25 基因啟動子的定點編輯 通過近幾年考題分析可知，PCR或基因編輯是每年的必考知識點，多數以對某種疾病的基因治療、科研成果等為情境，考查利用PCR擴增DNA片段中引物的設計、限制酶的選擇等內容
2021·山東·T25 PCR技術
2022·山東·T25 PCR技術
2023·山東·T25 PCR檢測
2024·山東·T5 PCR技術
2024·山東·T25 PCR技術和基因編輯
1．PCR引物的設計
(1)引物長度要適宜：引物的長度一般為15～23 bp，常用的長度為18～21 bp。過長會導致其延伸溫度大于74 ℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應，過短則特異性差。
(2)引物GC含量要適宜
①引物3′端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高， 而其他三種堿基的錯誤引發效率相對小一些。
②3′端防止連續三個C或G，引物的GC含量一般為45～55%，過高或過低都不利于引發反應。
③上下游引物的GC含量不能相差太大。
(3)引物自身及引物之間不應存在互補序列：堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補。否則引物自身會折疊成發夾結構或二聚體，從而影響引物與模板的復性結合。
(4)引物5′端可以修飾，3′端不可修飾
①引物的5′ 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點，加標記熒光；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。
②引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。
③在引物的5′端連接一對限制酶的識別序列，這樣便于目的基因連接到載體上。
2．常見特殊的PCR
(1)反向PCR技術
①原理：用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段。
②過程：如圖所示
實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切核酸酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有黏性末端的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序列進行分析研究。
(2)PCR定點突變
①重疊延伸PCR：如下圖所示，該技術要使用四條引物。其中引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點，而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點)是可以互補的。因此，分別利用引物1和2，引物3和4進行PCR后，得到的DNA片段可以通過引物2和3互補的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和4進行擴增得到含有突變位點的DNA片段。通過測序可以檢驗定點突變是否成功。
②大引物PCR：大引物PCR需要用到三條引物進行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規上游引物和常規下游引物。該技術的流程如圖所示。第一輪PCR利用突變上游引物和常規下游引物進行擴增，得到不完整的含有突變位點的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴增產物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規上游引物一起擴增得到完整的含有突變位點的DNA片段。
3．CRISPR-Cas9基因編輯
(1)Cas9蛋白特點：實質是一種限制酶，會用RNA來引導自己找到目標DNA。Cas9-RNA復合物會在DNA上不停“彈跳”，直到找到正確的位點。Cas9會附著到DNA上，檢測鄰近的序列是否和充當向導的RNA匹配。這種RNA叫作向導RNA(簡稱gRNA)，而只有當gRNA和DNA匹配時，Cas9蛋白才會對DNA進行切割。
(2)基因編輯的程序
1．某科研小組采用PCR 技術構建了紅色熒光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其過程如圖所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色區域)可互補配對。下列說法錯誤的是(　　)
A．利用PCR 技術擴增基因時不需要解旋酶來打開 DNA 雙鏈
B．不能在同一反應體系中進行dsred2 基因和amy基因的擴增
C．dsred2基因和amy 基因混合后只能得到一種類型的雜交鏈
D．雜交鏈延伸得到 dsred2-amy融合基因的過程不需要加引物
C　解析：利用PCR 技術擴增基因時，高溫變性使DNA雙鏈解旋，不需要解旋酶來打開 DNA 雙鏈，A正確；引物之間的結合會干擾引物和模板鏈的結合，從而影響PCR過程，因此不能在同一個反應體系中進行dsred2 基因和amy基因的擴增，B正確；dsred2基因和amy 基因混合可以得到兩種類型的雜交鏈，C錯誤；雜交鏈延伸得到 dsred2-amy融合基因的過程中，不需要加入引物，兩條母鏈的起始位置的堿基序列即為引物，可以作為子鏈合成的引物，D正確。
2．人血清白蛋白(HSA)是血漿蛋白的主要成分，具有維持血漿滲透壓和進行物質運輸的功能。科學家利用PCR 技術來大量擴增HSA基因，下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．PCR 技術依據的原理是 DNA 半保留復制
B．擴增HSA 基因時，應選擇圖中的引物Ⅱ和引物Ⅲ
C．PCR過程每次循環分為3步，其中溫度最低的一步是延伸
D．PCR 反應緩沖液一般要添加Mg2＋，用來激活 DNA 聚合酶
C　解析：PCR技術利用DNA半保留復制的原理，使脫氧核苷酸序列呈指數方式增加，A正確；引物結合在模板鏈的3′端，使子鏈從5′→3′延伸，擴增出HSA基因并用于表達載體的構建，故應選擇引物Ⅱ和引物Ⅲ，B正確；PCR過程每次循環分為變性、復性和延伸3步，其中溫度最低的一步是復性，C錯誤；真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此在PCR反應緩沖液中加入Mg2＋的作用是激活耐高溫的DNA聚合酶，D正確。
3．熒光定量PCR可定量檢測樣本中DNA含量，其原理是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針，當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針并生成熒光分子，即DNA每擴增一次，就有一個熒光分子生成(如圖)，熒光監測系統隨時接收熒光信號變化。下列敘述正確的有(　　)
A．圖示引物與胞內DNA復制所用引物的化學本質相同
B．耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸的方向均為5′→3′
C．一段待擴增的DNA經過4次循環后，等長目標片段所占比例為1/3
D．反應管內熒光信號到達設定閾值所經歷的循環數，與樣本DNA濃度呈正相關
B　解析：細胞內DNA的復制時，引物是通過RNA聚合酶合成的RNA鏈，而PCR反應中所需的引物是人工合成的DNA鏈，A錯誤。耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸的方向均為5′→3′，所以子鏈延伸的方向也為5′→3′，B正確。
結合圖示分析，若將目標片段設為X基因，該基因第一次復制得到兩種：①和②(一條鏈帶有引物，一條鏈為模板鏈)；X基因第二次復制得到四種：①復制得①和③、②復制得②和④(其中③、④帶有兩個不同的引物，但不等長)；X基因第三次復制得到五種：①復制得①和③、③復制得③和⑤、②復制得②和④、④復制得④和⑤；X基因第四次復制得到五種：①復制得①和③、兩個③復制得兩個③和兩個⑤、兩個④復制得兩個④和兩個⑤，兩個⑤復制得到四個⑤；⑤即為目標片段，占8/16＝1/2，C錯誤。由熒光定量PCR技術原理每加入一對引物的同時加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針，并且每擴增一次，就有一個熒光分子生成推測，反應管內熒光信號到達設定閾值所經歷的循環數，與樣本DNA濃度呈負相關，D錯誤。
4．重組PCR技術是一項新的PCR技術，通過重組PCR技術能將兩個不同的DNA連接成為一個新DNA分子。某科研小組從豬源大腸桿菌中擴增得到LTB和ST1兩個基因片段，利用重組PCR技術構建了LTB-ST1融合基因，制備過程如下圖所示。回答下列問題：
(1)利用PCR技術擴增目的基因的過程中，向反應體系中加入的物質除了引物和模板鏈，還需要加入______________________________________________。利用PCR技術擴增目的基因，依據的生物學原理是______________________。
(2)從P2、P3兩種引物的角度分析，LTB和ST1基因能夠融合的關鍵是____________________________________。PCR1和PCR2不能在同一個反應體系中進行，原因是____________________________________________________。②過程不需要加入引物，原因是__________________________________。
(3)科研小組為了檢測是否成功構建出融合基因，將反應后體系中的各種DNA分子進行電泳，結果如下圖所示。則融合基因最可能是__________，判斷依據是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)PCR體系中需要加入的物質有引物、模板鏈、耐高溫的DNA聚合酶和dNTP(4種游離的脫氧核苷酸作為原料)、擴增緩沖液等等；PCR是一項體外擴增DNA的技術，利用PCR技術擴增目的基因，依據的生物學原理是DNA半保留復制。(2)LTB和ST1基因能夠融合的關鍵是P2和P3兩種引物的部分區域能發生堿基互補配對，堿基互補配對區域的堿基之間能夠結合在一起，從而將兩個基因融合在一起；由于P2和P3兩種引物能結合，因此PCR1和PCR2不能在同一個體系中進行，理由是引物之間的結合會干擾引物和模板鏈的結合，從而影響PCR過程；②過程不需要加入引物，兩條母鏈的起始段位置的堿基序列即為引物，可以作為子鏈合成的引物，為DNA聚合酶提供3′端。(3)PCR體系中存在融合和未融合的DNA分子，融合的DNA包括了2個DNA分子片段，其分子量較大。根據電泳圖可知，3號DNA分子的分子量最大，因此3號DNA分子最可能是融合基因。
答案：(1)耐高溫的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸、擴增緩沖液等　DNA半保留復制　(2)這兩種引物的部分區域能進行堿基互補配對　P2和P3能結合，會干擾引物和模板鏈的結合，影響PCR過程　兩條母鏈可作為合成子鏈的引物　(3)3　融合基因包含2個不同的基因，其分子量較大，3表示的DNA分子量最大
5．Cre酶是一種重組酶，loxP是能被Cre酶識別的特異DNA序列，當一個DNA上存在兩個相同的loxP序列且方向相同時，Cre酶能將兩個切割位點之間的核苷酸序列切除并形成環狀而失活，剩余序列會連接起來。Cre/loxP重組酶系統能夠實現特異位點的基因敲除、基因插入等操作。利用Cre/loxP重組酶系統敲除小麥細胞中某特定基因的過程如圖1所示，回答下列問題。
(1)loxP序列的方向是由圖1中的區域____(填序號)決定的。經Cre酶敲除后獲得片段1和2游離的磷酸基團增加了______個。
(2)小麥細胞中不含Cre酶，需要導入Cre酶基因，圖2質粒中部分片段序列及部分限制酶識別序列已標出。在用PCR技術獲取Cre酶基因時，為了方便后續的剪切和連接，設計引物時會將限制酶識別序列加在Cre酶基因序列的兩端，基因下游引物需要添加的限制酶識別序列為________________。使用雙酶切的方法來構建基因表達載體的優點是_______________________________________。
(3)經檢測導入成功后，抗除草劑基因若繼續留在小麥體內可能會引發基因污染，可用Cre/loxP重組酶系統將標記基因敲除，不同的Cre酶可識別不同的loxP序列，圖3為改造后的標記基因序列，啟動子M可在花粉中特異性表達，改造的目的是____________________________________________，從而避免基因污染。在培育過程中可采取多種方法達到上述目的，比如外源α-淀粉酶基因可使含有該基因的花粉失去活性，請利用α-淀粉酶基因提出一條防止基因污染的措施。________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)loxP是能被Cre酶識別的特異DNA序列，而loxP序列被Cre酶識別和切割的位點在Ⅱ區域，因此loxP序列的方向是由圖1中的區域Ⅱ決定的。基因沒有敲除前，DNA含有兩個游離的磷酸基團，DNA敲除后產生了片段1環狀DNA和片段2鏈狀DNA，環狀DNA不含游離磷酸基團，因此經Cre酶敲除后獲得片段1和2，游離的磷酸基團增加了0個。(2)為了能將Cre酶基因和質粒連接形成重組DNA分子，兩者需要含有相同的黏性末端，因此需要兩種限制酶識別序列，結合圖2可知，HindⅢ位于啟動子處，不能切割，XbeⅠ在終止子兩側都有，不能選擇XbeⅠ，因此能選擇的是NdeⅠ和BamHⅠ，NdeⅠ靠近啟動子一側，添加在基因上游引物，BamHⅠ靠近終止子，添加在基因下游引物，因此基因下游引物需要添加的限制酶識別序列為5′-GGATCC-3′。若使用一種限制酶酶切，可能導致目的基因自身環化，目的基因和質粒反向拼接等，使用雙酶切的方法來構建基因表達載體的優點是保證目的基因和質粒之間發生正確連接。(3)抗除草劑基因本身的作用是檢測目的基因是否成功導入受體細胞，但若抗除草劑基因通過花粉傳播給其他植物會導致基因污染，影響生態系統的相對穩定。由于外源α-淀粉酶基因可使含有該基因的花粉失去活性，因此將α-淀粉酶基因與抗除草劑基因導入細胞核的同一DNA分子中，可以使含有抗除草劑基因的花粉失去活性，從而避免基因污染。
答案：(1)Ⅱ　0　(2)5′-GGATCC-3′　保證目的基因和質粒之間發生正確連接　(3)防止抗除草劑基因通過花粉傳播　將α-淀粉酶基因與抗除草劑基因導入細胞核的同一DNA分子中(共36張PPT)
專題十三　基因工程、生物技術的安全性與倫理問題
命題熱點10　PCR與基因編輯
考題分布 考查類型 命題分析
2020·山東·T25 基因啟動子的定點編輯 通過近幾年考題分析可知，PCR或基因編輯是每年的必考知識點，多數以對某種疾病的基因治療、科研成果等為情境，考查利用PCR擴增DNA片段中引物的設計、限制酶的選擇等內容
2021·山東·T25 PCR技術
2022·山東·T25 PCR技術
2023·山東·T25 PCR檢測
2024·山東·T5 PCR技術
2024·山東·T25 PCR技術和基因編輯
1．PCR引物的設計
(1)引物長度要適宜：引物的長度一般為15～23 bp，常用的長度為18～21 bp。過長會導致其延伸溫度大于74 ℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應，過短則特異性差。
(2)引物GC含量要適宜
①引物3′端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高， 而其他三種堿基的錯誤引發效率相對小一些。
②3′端防止連續三個C或G，引物的GC含量一般為45～55%，過高或過低都不利于引發反應。
③上下游引物的GC含量不能相差太大。
(3)引物自身及引物之間不應存在互補序列：堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補。否則引物自身會折疊成發夾結構或二聚體，從而影響引物與模板的復性結合。
(4)引物5′端可以修飾，3′端不可修飾
①引物的5′ 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點，加標記熒光；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。
②引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。
③在引物的5′端連接一對限制酶的識別序列，這樣便于目的基因連接到載體上。
2．常見特殊的PCR
(1)反向PCR技術
①原理：用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段。
②過程：如圖所示
實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切核酸酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有黏性末端的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序列進行分析研究。
(2)PCR定點突變
①重疊延伸PCR：如下圖所示，該技術要使用四條引物。其中引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點，而這兩條引物有部分堿基(包括突變位點)是可以互補的。因此，分別利用引物1和2，引物3和4進行PCR后，得到的DNA片段可以通過引物2和3互補的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和4進行擴增得到含有突變位點的DNA片段。通過測序可以檢驗定點突變是否成功。
②大引物PCR：大引物PCR需要用到三條引物進行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規上游引物和常規下游引物。該技術的流程如圖所示。第一輪PCR利用突變上游引物和常規下游引物進行擴增，得到不完整的含有突變位點的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴增產物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規上游引物一起擴增得到完整的含有突變位點的DNA片段。
3．CRISPR-Cas9基因編輯
(1)Cas9蛋白特點：實質是一種限制酶，會用RNA來引導自己找到目標DNA。Cas9-RNA復合物會在DNA上不停“彈跳”，直到找到正確的位點。Cas9會附著到DNA上，檢測鄰近的序列是否和充當向導的RNA匹配。這種RNA叫作向導RNA(簡稱gRNA)，而只有當gRNA和DNA匹配時，Cas9蛋白才會對DNA進行切割。
(2)基因編輯的程序
1．某科研小組采用PCR 技術構建了紅色熒光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其過程如圖所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色區域)可互補配對。下列說法錯誤的是(　　)
A．利用PCR 技術擴增基因時不需要解旋酶來打開 DNA 雙鏈
B．不能在同一反應體系中進行dsred2 基因和amy基因的擴增
C．dsred2基因和amy 基因混合后只能得到一種類型的雜交鏈
D．雜交鏈延伸得到 dsred2-amy融合基因的過程不需要加引物
√
C　解析：利用PCR 技術擴增基因時，高溫變性使DNA雙鏈解旋，不需要解旋酶來打開 DNA 雙鏈，A正確；引物之間的結合會干擾引物和模板鏈的結合，從而影響PCR過程，因此不能在同一個反應體系中進行dsred2 基因和amy基因的擴增，B正確；dsred2基因和amy 基因混合可以得到兩種類型的雜交鏈，C錯誤；雜交鏈延伸得到 dsred2-amy融合基因的過程中，不需要加入引物，兩條母鏈的起始位置的堿基序列即為引物，可以作為子鏈合成的引物，D正確。
2．人血清白蛋白(HSA)是血漿蛋白的主要成分，具有維持血漿滲透壓和進行物質運輸的功能。科學家利用PCR 技術來大量擴增HSA基因，下列相關敘述錯誤的是(　　)
A．PCR 技術依據的原理是 DNA 半保留復制
B．擴增HSA 基因時，應選擇圖中的引物Ⅱ和引物Ⅲ
C．PCR過程每次循環分為3步，其中溫度最低的一步是延伸
D．PCR 反應緩沖液一般要添加Mg2＋，用來激活 DNA 聚合酶
√
C　解析：PCR技術利用DNA半保留復制的原理，使脫氧核苷酸序列呈指數方式增加，A正確；引物結合在模板鏈的3′端，使子鏈從5′→3′延伸，擴增出HSA基因并用于表達載體的構建，故應選擇引物Ⅱ和引物Ⅲ，B正確；PCR過程每次循環分為變性、復性和延伸3步，其中溫度最低的一步是復性，C錯誤；真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此在PCR反應緩沖液中加入Mg2＋的作用是激活耐高溫的DNA聚合酶，D正確。
3．熒光定量PCR可定量檢測樣本中DNA含量，其原理是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針，當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針并生成熒光分子，即DNA每擴增一次，就有一個熒光分子生成(如圖)，熒光監測系統隨時接收熒光信號變化。下列敘述正確的有(　　)
A．圖示引物與胞內DNA復制所用引物的化學本質相同
B．耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸的方向均為5′→3′
C．一段待擴增的DNA經過4次循環后，等長目標片段所占比例為1/3
D．反應管內熒光信號到達設定閾值所經歷的循環數，與樣本DNA濃度呈正相關
√
B　解析：細胞內DNA的復制時，引物是通過RNA聚合酶合成的RNA鏈，而PCR反應中所需的引物是人工合成的DNA鏈，A錯誤。耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸的方向均為5′→3′，所以子鏈延伸的方向也為5′→3′，B正確。
結合圖示分析，若將目標片段設為X基因，該基因第一次復制得到兩種：①和②(一條鏈帶有引物，一條鏈為模板鏈)；X基因第二次復制得到四種：①復制得①和③、②復制得②和④(其中③、④帶有兩個不同的引物，但不等長)；X基因第三次復制得到五種：①復制得①和③、③復制得③和⑤、②復制得②和④、④復制得④和⑤；X基因第四次復制得到五種：①復制得①和③、兩個③復制得兩個③和兩個⑤、兩個④復制得兩個④和兩個⑤，兩個⑤復制得到四個⑤；⑤即為目標片段，占8/16＝1/2，C錯誤。由熒光定量PCR技術原理每加入一對引物的同時加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針，并且每擴增一次，就有一個熒光分子生成推測，反應管內熒光信號到達設定閾值所經歷的循環數，與樣本DNA濃度呈負相關，D錯誤。
4．重組PCR技術是一項新的PCR技術，通過重組PCR技術能將兩個不同的DNA連接成為一個新DNA分子。某科研小組從豬源大腸桿菌中擴增得到LTB和ST1兩個基因片段，利用重組PCR技術構建了LTB-ST1融合基因，制備過程如下圖所示。回答下列問題：
(1)利用PCR技術擴增目的基因的過程中，向反應體系中加入的物質除了引物和模板鏈，還需要加入___________________________。利用PCR技術擴增目的基因，依據的生物學原理是______________。
(2)從P2、P3兩種引物的角度分析，LTB和ST1基因能夠融合的關鍵是______________________________。PCR1和PCR2不能在同一個反應體系中進行，原因是_________________________________。②過程不需要加入引物，原因是____________________________。
(3)科研小組為了檢測是否成功構建出融合基因，將反應后體系中的各種DNA分子進行電泳，結果如下圖所示。則融合基因最可能是__________，判斷依據是________________________________。
解析：(1)PCR體系中需要加入的物質有引物、模板鏈、耐高溫的DNA聚合酶和dNTP(4種游離的脫氧核苷酸作為原料)、擴增緩沖液等等；PCR是一項體外擴增DNA的技術，利用PCR技術擴增目的基因，依據的生物學原理是DNA半保留復制。(2)LTB和ST1基因能夠融合的關鍵是P2和P3兩種引物的部分區域能發生堿基互補配對，堿基互補配對區域的堿基之間能夠結合在一起，從而將兩個基因融合在一起；由于P2和P3兩種引物能結合，因此PCR1和PCR2不能在同一個體系中進行，理由是引物之間的結合會干擾引物和模板鏈的結合，從而影響PCR過程；②過程不需要加入引物，兩條母鏈的起始
段位置的堿基序列即為引物，可以作為子鏈合成的引物，為DNA聚合酶提供3′端。(3)PCR體系中存在融合和未融合的DNA分子，融合的DNA包括了2個DNA分子片段，其分子量較大。根據電泳圖可知，3號DNA分子的分子量最大，因此3號DNA分子最可能是融合基因。
答案：(1)耐高溫的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸、擴增緩沖液等　DNA半保留復制　(2)這兩種引物的部分區域能進行堿基互補配對　P2和P3能結合，會干擾引物和模板鏈的結合，影響PCR過程　兩條母鏈可作為合成子鏈的引物　(3)3　融合基因包含2個不同的基因，其分子量較大，3表示的DNA分子量最大
5．Cre酶是一種重組酶，loxP是能被Cre酶識別的特異DNA序列，當一個DNA上存在兩個相同的loxP序列且方向相同時，Cre酶能將兩個切割位點之間的核苷酸序列切除并形成環狀而失活，剩余序列會連接起來。Cre/loxP重組酶系統能夠實現特異位點的基因敲除、基因插入等操作。利用Cre/loxP重組酶系統敲除小麥細胞中某特定基因的過程如圖1所示，回答下列問題。
(1)loxP序列的方向是由圖1中的區域____(填序號)決定的。經Cre酶敲除后獲得片段1和2游離的磷酸基團增加了______個。
(2)小麥細胞中不含Cre酶，需要導入Cre酶基因，圖2質粒中部分片段序列及部分限制酶識別序列已標出。在用PCR技術獲取Cre酶基因時，為了方便后續的剪切和連接，設計引物時會將限制酶識別序列加在Cre酶基因序列的兩端，基因下游引物需要添加的限制酶識別序列為______________。使用雙酶切的方法來構建基因表達載體的優點是_________________________________。
(3)經檢測導入成功后，抗除草劑基因若繼續留在小麥體內可能會引發基因污染，可用Cre/loxP重組酶系統將標記基因敲除，不同的Cre酶可識別不同的loxP序列，圖3為改造后的標記基因序列，啟動子M可在花粉中特異性表達，改造的目的是_______________________，從而避免基因污染。在培育過程中可采取多種方法達到上述目的，比如外源α-淀粉酶基因可使含有該基因的花粉失去活性，請利用α-淀粉酶基因提出一條防止基因污染的措施。___________________ ________________________________________________________。
解析：(1)loxP是能被Cre酶識別的特異DNA序列，而loxP序列被Cre酶識別和切割的位點在Ⅱ區域，因此loxP序列的方向是由圖1中的區域Ⅱ決定的。基因沒有敲除前，DNA含有兩個游離的磷酸基團，DNA敲除后產生了片段1環狀DNA和片段2鏈狀DNA，環狀DNA不含游離磷酸基團，因此經Cre酶敲除后獲得片段1和2，游離的磷酸基團增加了0個。(2)為了能將Cre酶基因和質粒連接形成重組DNA分子，兩者需要含有相同的黏性末端，因此需要兩種限制酶識別序列，結合圖2可知，HindⅢ位于啟動子處，不能切割，XbeⅠ在終止子兩側都有，不能選擇XbeⅠ，因此能選擇的是NdeⅠ和BamHⅠ，
NdeⅠ靠近啟動子一側，添加在基因上游引物，BamHⅠ靠近終止子，添加在基因下游引物，因此基因下游引物需要添加的限制酶識別序列為5′-GGATCC-3′。若使用一種限制酶酶切，可能導致目的基因自身環化，目的基因和質粒反向拼接等，使用雙酶切的方法來構建基因表達載體的優點是保證目的基因和質粒之間發生正確連接。(3)抗除草劑基因本身的作用是檢測目的基因是否成功導入受體細胞，但若抗除草劑基因通過花粉傳播給其他植物會導致基因污染，影響生態系統的相對穩定。由于外源α-淀粉酶基因可使含有該基因的花粉失去活性，因此將α-淀粉酶基因與抗除草劑基因導入細胞核的同一DNA分子中，可以使含有抗除草劑基因的花粉失去活性，從而避免基因污染。
答案：(1)Ⅱ　0　(2)5′-GGATCC-3′　保證目的基因和質粒之間發生正確連接　(3)防止抗除草劑基因通過花粉傳播　將α-淀粉酶基因與抗除草劑基因導入細胞核的同一DNA分子中

展開更多......

收起↑