資源簡介

　PCR擴增及電泳圖
(2023·山東卷)科研人員構建了可表達J-V5 融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。
(1)與圖甲中啟動子結合的酶是　　　　　　。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2個結構即可)。
(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物____________。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的　　　　(填“a鏈”或“b鏈”)相應部分的序列相同。
(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了　　　　　　　　　　　　　　，條帶2所檢出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重組質粒上的J基因表達的。
解析：(1)基因表達載體中啟動子是為了啟動下游基因的表達，表達首先需要轉錄，因此與啟動子結合的酶是RNA聚合酶。作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點；②要有標記基因(如抗生素抗性基因)，以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細胞中穩定存在并復制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來。圖中甲有啟動子和終止子等，因此質粒還需具備的結構有限制酶的切割位點、標記基因、復制原點等。(2)據圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結合部位包含質粒和J基因的堿基序列，因此推測為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，進行PCR檢測時，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物F2與R1或F1與R2。轉錄時mRNA的合成方向為5′→3′，又知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，所以b鏈左側為3′端，右側為5′端；PCR擴增時引物F1與模板鏈3′端的堿基進行互補配對，故其序列應該與a鏈相應部分的序列相同。(3)據圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測，均出現條帶1，說明條帶1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗體檢測出現條帶2，抗V5抗體檢測不出現條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質粒上的J基因表達的。
答案：(1)RNA聚合酶　限制酶切割位點、標記基因、復制原點等(2個即可)　(2)F2與R1或F1與R2　a鏈　(3)J-V5融合蛋白　不是
·任務一　PCR擴增技術的分析
(1)當選擇引物F2和R2時，能否通過有無擴增產物判斷J基因連接到質粒中且插入方向正確？說明理由。
提示：不能。F2和R2分別與質粒DNA的序列互補配對，未插入J基因，也可得到擴增產物，不能確定J基因是否連接到質粒中。
(2)選擇引物F1和R1，得到擴增產物，能否說明J基因連接到質粒中且插入方向正確？說明理由。
提示：不能。F1和R1均與J基因配對，得到擴增產物，只能說明細胞中有J基因，無法判斷插入方向是否正確。
(3)為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，應選擇什么引物？
提示：F1與R2或F2與R1。
(4)PCR反應時，引物延伸的方向是什么？
提示：引物延伸的方向是從引物的5′→3′。
(5)基因轉錄時，轉錄的方向如何判定？
提示：從啟動子位置開始，沿著模板鏈的3′→5′。
(6)判斷a鏈啟動子一側到終止子一側的方向。
提示：5′→3′。
(7)與F1配對的是基因的哪條鏈？
提示：b鏈。
·任務二　電泳條帶分析
(1)J-V5融合蛋白能與哪種抗體發生特異性結合？
提示：抗J蛋白抗體，抗V5抗體。
(2)重組質粒上的J基因表達的J蛋白是否含有V5？說明理由。
提示：含有。與質粒連接的是J基因與V5基因的融合基因。
(3)用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測，均出現條帶1，說明條帶1是什么蛋白？
提示：J-V5融合蛋白。
(4)抗J蛋白抗體檢測出現條帶2，抗V5抗體檢測不出現條帶2，能否說明條帶2不是重組質粒上的J基因表達？說明理由。
提示：能。重組質粒上的J基因表達出的蛋白應是J-V5融合蛋白，該融合蛋白既能與抗J蛋白抗體結合，又能與抗V5抗體結合，而條帶2所檢出的蛋白只能與抗J蛋白抗體結合，所以說明條帶2不是重組質粒上的J基因表達。
模型一　設計引物的原則
(1)引物長度應大于16個核苷酸，可防止隨機結合；
(2)引物與靶序列間的Tm值不應過低；
(3)引物不應有發夾結構，即不能有4 bp以上的回文序列；
(4)2個引物間不應有4 bp以上的互補序列或同源序列，在3′端不應有任何互補堿基；
(5)引物中堿基的分布盡可能均勻，G＋C含量接近50%。
模型二　引物的特點
(1)引物能與DNA模板通過堿基互補配對結合；
(2)2種引物之間不能互補配對；
(3)某一引物不能自身折疊出現局部堿基互補配對；
(4)需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列；
(5)引物不能太短。
(2024·濟寧一模)為快速有效地檢測汞污染，科研人員利用啟動子J109和PmerT、汞響應蛋白(MerR)、綠色熒光蛋白(GFP)構建了非耦合雙啟動子汞全細胞生物傳感器，其原理如圖1所示。J109為組成型啟動子，在不同細胞發揮作用的效果基本一致；PmerT為誘導型啟動子，需要特定信號刺激后發揮作用。相關堿基序列和基因表達方向如表1所示。
表1
啟動子/結構基因 序列
J109 5′-TTTACAGCTA……CTGTGCTAGC-3′ 3′-AAATGTCGAT……GACACGATCG-5
PmerT 5′-TTCCATATCG……TATCCAATCC-3′ 3′-AAGGTATAGC……ATAGGTTAGG-5′
MerR基因 5′-ATGGAAAATA……TATGCCTTAG-3′ 3′-TACCTTTTAT……ATACGGAATC-5′
GFP基因 5′-ATGAGTAAAG……ATACAAATAA-3′ 3′-TACTCATTTC……TATGTTTATT-5′
注：基因表達方向“→”。
表2
引物組 序列
甲 5′-TTTACAGCTA-3′ 5′-CTAAGGCATA-3′
乙 5′-CTAGCATGGA-3′ 5′-TCCATCCTAG-3′
丙 5′-TTCCATATCG-3′ 5′-TTATTTGTAT-3′
丁 5′-AATCCATGAG-3′ 5′-CTCATGGATT-3′
(1)獲取MerR基因時，利用PCR技術對模板DNA進行了30個“95 ℃變性→50 ℃復性→72 ℃延伸”的循環處理，對其產物電泳，出現圖2所示結果。PCR反應緩沖液中加入Mg2＋的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　，圖2中③實驗結果出現的原因可能是　　　　　　　　　　　。
(2)圖1啟動子b應選擇____________________________________________，其作用是_______________________________。為確保MerR基因、GFP基因分別與相應啟動子正確連接，科研人員應選擇表2中　　　　　　　　組引物對重組 DNA 進行擴增，并作進一步驗證。
(3)研究發現，若全細胞生物傳感器在無Hg2＋狀態下GFP基因的表達量偏高，則傳感器靈敏度低。提出改造重組質粒以提高靈敏度的兩條措施：___________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)PCR反應緩沖液中加入Mg2＋的作用是激活耐高溫DNA聚合酶；獲取MerR 基因時，利用 PCR 技術對模板 DNA進行了30個“95 ℃變性→50 ℃復性→72 ℃延伸”的循環處理。對其產物電泳，由圖2可知，③號泳道實驗組的DNA片段數量多于②號泳道純目的基因對照組，說明③號泳道實驗組中除了有目的基因外，還有其他的基因片段，造成該實驗結果出現的原因可能是引物較短，特異性低，除了能作為目的基因的引物外，還能作為其他基因的引物。(2)由題意可知，J109為組成型啟動子，在不同細胞發揮作用的效果基本一致，而PmerT為誘導型啟動子，需要特定信號刺激后發揮作用。由圖1可知，啟動子a與GFP基因相連，啟動子a的作用是啟動GFP基因轉錄出mRNA，但啟動子a作用的發揮與MerR蛋白有關，所以啟動子a為誘導型啟動子，應選擇PmerT；啟動子b與MerR基因相連，啟動子b的作用是啟動MerR基因轉錄出mRNA，但啟動子b作用的發揮不需要特定信號刺激，所以啟動子b為組成型啟動子，應選擇J109。在反應體系中加入引物的作用是與目的基因的模板鏈配對，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，延伸子鏈。由前面的分析可知，MerR基因的啟動子是組成型啟動子J109，GFP基因的啟動子是誘導型啟動子PmerT，由表1和表2可知，啟動子J109和MerR基因的堿基序列可與甲組引物進行互補配對，啟動子PmerT和GFP的堿基序列可與丙組引物進行互補配對，所以為確保MerR基因、GFP基因分別與相應啟動子正確連接，應選擇表2中甲、丙組引物對重組 DNA 進行擴增，并作進一步驗證。(3)由圖1可知，全細胞生物傳感器在有Hg2＋狀態下，啟動子a才能啟動GFP基因轉錄，最終生成GFP，表現出綠色熒光；在無Hg2＋狀態下，啟動子a不能啟動GFP基因轉錄，不能表現出綠色熒光。如果全細胞生物傳感器在無Hg2＋狀態下GFP基因的表達量偏高，傳感器靈敏度低，根據圖1中全細胞生物傳感器的原理可推測出其原因可能是MerR對啟動子a的抑制作用減弱或啟動子a對GFP基因轉錄的啟動作用增強。因此為了使全細胞生物傳感器在無Hg2＋狀態下GFP基因的表達量正常，提高傳感器靈敏度，需要對重組質粒進行改造，具體措施有增強MerR與啟動子a的結合、修改啟動子b以增強MerR的表達、增加重組質粒中MerR基因的數量(拷貝數)、修改啟動子a以降低GFP基因的表達量。
答案：(1)激活耐高溫的DNA聚合酶　引物較短，特異性低　(2)J109　啟動MerR基因轉錄出mRNA　甲、丙　(3)增強MerR與啟動子a的結合、修改啟動子b以增強MerR 的表達、增加重組質粒中MerR 基因的數量(拷貝數)、修改啟動子a以降低 GFP基因的表達量(答出兩條即可)
　基因工程的操作程序
(2024·山東卷)研究發現基因L能夠通過脫落酸信號途徑調控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點處插入大豆基因L的向導DNA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉錄產物可引導核酸酶特異性結合基因組上的目標序列并發揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結果等如圖所示。
(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越　　　　(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有__________種。載體信息如圖甲所示，經BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5′-　　　　　　-3′和5′-　　　　-3′。
(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，使用抗生素　　　　　　篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產物完全酶切后的電泳結果如圖丙所示。據圖可判斷選用的限制酶是　　　　　，其中純合的突變植株是　　　(填序號)。
(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發現其體細胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為　　　　，篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
解析：(1)引物越短，特異性越低。限制酶切開 DNA 雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，BsaⅠ切割大豆基因組DNA后露出的是四個N，而N代表任一堿基，所以黏性末端可以有44種。由圖甲、圖丙可知，BsaⅠ的識別位置是，切開后的黏性末端為 5′-GTTT-3′、5′-CAAT-3′。(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，會將T-DNA片段插入大豆細胞染色體 DNA上，T-DNA上有卡那霉素抗性基因，因而可以用卡那霉素篩選。目標序列上有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，突變序列有BamHⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ酶切位點，根據電泳結果，②只有一個條帶，說明沒有被酶切，所以用的酶是SacⅠ，且②為目標序列，因為目標序列沒有SacⅠ酶切位點，酶切后④有兩個不同于②的條帶說明④是突變純合子。(3)基因L突變的純合植株基因型記為LL，T-DNA上有卡那霉素的抗性基因，體細胞中只有1條染色體有T-DNA，說明只有一個抗性基因。若T-DNA 不在L基因所在的染色體上，用A表示抗性基因，則關于抗性的基因型記為AO，植株基因型為LLAO，兩對基因遺傳時遵循自由組合定律，LLAO自交，其后代突變基因純合且抗生素敏感的植株(LLOO)所占比例為1/4。若該基因在L基因所在的染色體上植株基因型記為LL′，LL′自交其后代突變基因純合且抗生素敏感的植株(LL)占 1/4。
答案：(1)低　44　GTTT　CAAT　(2)卡那霉素　SacⅠ　④　(3)1/4
·任務一　啟動子的相關分析
(1)引物通過什么鍵與模板的結合？是否遵循堿基互補配對原則？
提示：氫鍵，是。
(2)引物越短，DNA上與之配對的序列越少，對特異性有何影響？
提示：特異性越低。
·任務二　糯性分析
(1)用BsaⅠ酶切大豆基因組的DNA序列，從其識別序列與切割位點可知，切出的黏性末端有多少個堿基？理論上可產生的黏性末端最多有多少種？
提示：4,44(256)。
(2)載體有上、下游兩個BsaⅠ酶切位點，酶切后，載體上留下的黏性末端，左側末端是什么？右側末端是什么？
提示：5′-CAAT-3′，5′-GTTT-3′。
·任務三　因果推理與論證
提示：限制酶只能識別差異序列中的一種序列　SacⅠ　①③　②　④
·任務四　建構概念模型
提示：AA純合子　突變位點純合子AA　Bb雜合子　1/4　1/4
模型一　圖解限制酶的選擇原則
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ限制酶，而不選擇SmaⅠ限制酶。
(2)保留標記基因原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ限制酶。
(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ限制酶；為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
模型二　基因表達載體的構建模型
(2024·青島一模)CRISPR-Cas12a系統是第二類用于編輯哺乳動物基因組的CRISPR-Cas 系統，該系統主要包含crRNA 和Cas12a蛋白兩部分，crRNA 能特異性識別并結合特定的DNA序列，從而引導Cas12a蛋白到相應位置剪切 DNA。某科研團隊基于CRISPR-Cas12a系統對宮頸癌細胞中的 KIFC1基因進行敲除，來探討 KIFC1基因在宮頸癌細胞中的功能及對宮頸癌 HeLa細胞增殖的影響。
(1)在CRISPR-Cas12a系統中，crRNA的序列與目的基因特定堿基序列部分結合，結合區域最多含　　　　　種核苷酸；細菌細胞中的　　　　　　　　　也能起到類似Cas12a蛋白的作用。若要將KIFC1基因從目標DNA上剪切下來，需要設計　　　　　種crRNA。
(2)為保證目的基因與PX458質粒正確連接，在擴增目的基因時，應在引物端加入相應的限制酶序列，其中P1的堿基序列為5′-　　　　　　　-3′(寫出前9個堿基)。采用PCR技術對一個DNA 進行擴增時，第n次循環共需要引物______________個。
(3)在目的基因與PX458質粒連接時，可用　　　　　　　　　(填“E.coli DNA 連接酶”或“T4 DNA 連接酶”)進行連接。
(4)將crRNA-Cas12a重組載體成功轉染至HeLa細胞，與對照組相比，實驗組中KIFC1蛋白表達最如圖乙所示，細胞數目的變化如圖丙所示，由此可得出的結論是______________________________________________________，判斷依據是___________________________________________________________。
　
解析：(1)在CRISPR-Cas12a系統中，crRNA的序列與目的基因特定堿基序列部分結合，在結合區域有DNA和RNA，組成DNA的核苷酸為4種脫氧核苷酸，組成RNA的核苷酸為4種核糖核苷酸，所以結合區域最多含8種核苷酸。由題意可知，在CRISPR-Cas12a系統中，Cas12a蛋白的作用是在 crRNA的引導下，到相應位置剪切DNA。細菌細胞中的限制酶也能剪切DNA，與Cas12a蛋白的作用類似。因為要將KIFC1基因從目標 DNA上剪切下來，需要兩個切口，每個切口都需要crRNA特異性識別并結合特定的 DNA 序列，兩個切口處的DNA序列又不同，所以需要設計2種crRNA。(2)為保證目的基因與PX458質粒正確連接，在擴增目的基因時，應在引物端加入相應的限制酶序列，由圖甲可知，PX458質粒有3種限制酶切割位點，其中KpnⅠ有2個切割位點，其中的一個切割位點在Cas12a基因上，所以不能選擇限制酶KpnⅠ，為避免目的基因與PX458質粒在切割后的環化及保證目的基因與PX458質粒正確連接，應選擇PvitⅡ和EcoR Ⅰ這兩種不同的限制酶切割質粒和含有目的基因的 DNA片段，PvitⅡ的識別序列為5′-CAG↓CTG-3′，切割后為平末端，EcoRⅠ的識別序列為5′-G↓AATTC-3′，切割后為黏性末端，PvitⅡ的識別序列離啟動子U6近，EcoRⅠ的識別序列離啟動子U6遠，目的基因的A鏈為轉錄的模板鏈，引物P1與A鏈互補配對，所以轉錄應從 A鏈的3′端開始，引物P1上應加入限制酶PvitⅡ的識別序列，由P1的箭頭方向可知，P1的前9個堿基序列為5′-CAGCTGCTC-3′。采用PCR 技術對一個 DNA 進行擴增時，第n－1次循環后，共生成了2n－1個 DNA分子，在進行第n次循環時，每個 DNA 分子都需要2個引物，所以n次循環共需要引物2×2n－1＝2n個。(3)因為目的基因和PX458質粒在用限制酶PvitⅡ和EcoRⅠ切割時，分別形成了平末端和黏性末端，E.coli DNA 連接酶只能連接黏性末端，T4 DNA連接酶既能連接黏性末端，又能連接平末端，所以在目的基因與PX458質粒連接時，可用 T4 DNA 連接酶進行連接。(4)由題意可知，該實驗的目的是探究 KIFC1基因在宮頸癌細胞中的功能及對宮頸HeLa細胞增殖的影響，對照組為含有 KIFC1 基因的 HeLa 細胞，實驗組為敲除了 KIFC1 基因的 HeLa細胞，由圖乙可知，與對照組相比，實驗組中KIFC1蛋白表達量明顯下降，證明HeLa細胞KIFC1基因敲除成功，由圖丙可知，KIFC1敲除組細胞數目顯著低于對照組，表明 KIFC1敲除可使HeLa 細胞增殖能力下降，由此可得出的結論是 KIFC1基因可以促進HeLa細胞的增殖。
答案：(1)8　限制酶(限制性內切核酸酶)　2　(2)CAGCTGCTC　2n　(3)T4 DNA 連接酶　(4)KIFC1基因可以促進 HeLa細胞的增殖　實驗組細胞株中KIFC1蛋白表達量明顯下降，證明HeLa細胞KIFC1基因敲除成功；KIFC1敲除組細胞數目顯著低于對照組，表明KIFC1 敲除可使 HeLa細胞增殖能力下降(共44張PPT)
命題區5　基因工程
(2023·山東卷)科研人員構建了可表達J-V5 融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。
題型一　PCR擴增及電泳圖
(1)與圖甲中啟動子結合的酶是________________。除圖甲中標出的結構外，作為載體，質粒還需具備的結構有____________________ ______________________________(答出2個結構即可)。
(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物________。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的__________(填“a鏈”或“b鏈”)相應部分的序列相同。
(3)重組質粒在受體細胞內正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應蛋白是否表達以及表達水平，結果如圖乙所示。其中，出現條帶1證明細胞內表達了___________________________，條帶2所檢出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重組質粒上的J基因表達的。
解析：(1)基因表達載體中啟動子是為了啟動下游基因的表達，表達首先需要轉錄，因此與啟動子結合的酶是RNA聚合酶。作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點；②要有標記基因(如抗生素抗性基因)，以便于重組后重組子的篩選；③能在宿主細胞中穩定存在并復制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來。圖中甲有啟動子和終止子等，因此質粒還需具備的結構有限制酶的切割位點、標記基因、復制原點等。(2)據圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結合部位包含質粒和J基因的堿基序列，因此推測為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，進行PCR檢測
時，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物F2與R1或F1與R2。轉錄時mRNA的合成方向為5′→3′，又知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，所以b鏈左側為3′端，右側為5′端；PCR擴增時引物F1與模板鏈3′端的堿基進行互補配對，故其序列應該與a鏈相應部分的序列相同。(3)據圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測，均出現條帶1，說明條帶1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗體檢測出現條帶2，抗V5抗體檢測不出現條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質粒上的J基因表達的。
答案：(1)RNA聚合酶　限制酶切割位點、標記基因、復制原點等(2個即可)　(2)F2與R1或F1與R2　a鏈　(3)J-V5融合蛋白　不是
·任務一　PCR擴增技術的分析
(1)當選擇引物F2和R2時，能否通過有無擴增產物判斷J基因連接到質粒中且插入方向正確？說明理由。
提示：不能。F2和R2分別與質粒DNA的序列互補配對，未插入J基因，也可得到擴增產物，不能確定J基因是否連接到質粒中。
(2)選擇引物F1和R1，得到擴增產物，能否說明J基因連接到質粒中且插入方向正確？說明理由。
提示：不能。F1和R1均與J基因配對，得到擴增產物，只能說明細胞中有J基因，無法判斷插入方向是否正確。
(3)為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，應選擇什么引物？
提示：F1與R2或F2與R1。
(4)PCR反應時，引物延伸的方向是什么？
提示：引物延伸的方向是從引物的5′→3′。
(5)基因轉錄時，轉錄的方向如何判定？
提示：從啟動子位置開始，沿著模板鏈的3′→5′。
(6)判斷a鏈啟動子一側到終止子一側的方向。
提示：5′→3′。
(7)與F1配對的是基因的哪條鏈？
提示：b鏈。
·任務二　電泳條帶分析
(1)J-V5融合蛋白能與哪種抗體發生特異性結合？
提示：抗J蛋白抗體，抗V5抗體。
(2)重組質粒上的J基因表達的J蛋白是否含有V5？說明理由。
提示：含有。與質粒連接的是J基因與V5基因的融合基因。
(3)用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測，均出現條帶1，說明條帶1是什么蛋白？
提示：J-V5融合蛋白。
(4)抗J蛋白抗體檢測出現條帶2，抗V5抗體檢測不出現條帶2，能否說明條帶2不是重組質粒上的J基因表達？說明理由。
提示：能。重組質粒上的J基因表達出的蛋白應是J-V5融合蛋白，該融合蛋白既能與抗J蛋白抗體結合，又能與抗V5抗體結合，而條帶2所檢出的蛋白只能與抗J蛋白抗體結合，所以說明條帶2不是重組質粒上的J基因表達。
模型一　設計引物的原則
(1)引物長度應大于16個核苷酸，可防止隨機結合；
(2)引物與靶序列間的Tm值不應過低；
(3)引物不應有發夾結構，即不能有4 bp以上的回文序列；
(4)2個引物間不應有4 bp以上的互補序列或同源序列，在3′端不應有任何互補堿基；
(5)引物中堿基的分布盡可能均勻，G＋C含量接近50%。
模型二　引物的特點
(1)引物能與DNA模板通過堿基互補配對結合；
(2)2種引物之間不能互補配對；
(3)某一引物不能自身折疊出現局部堿基互補配對；
(4)需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識別序列；
(5)引物不能太短。
(2024·濟寧一模)為快速有效地檢測汞污染，科研人員利用啟動子J109和PmerT、汞響應蛋白(MerR)、綠色熒光蛋白(GFP)構建了非耦合雙啟動子汞全細胞生物傳感器，其原理如圖1所示。J109為組成型啟動子，在不同細胞發揮作用的效果基本一致；PmerT為誘導型啟動子，需要特定信號刺激后發揮作用。相關堿基序列和基因表達方向如表1所示。
表1
注：基因表達方向“→”。
啟動子/結構基因 序列
J109 5′-TTTACAGCTA……CTGTGCTAGC-3′
3′-AAATGTCGAT……GACACGATCG-5
PmerT 5′-TTCCATATCG……TATCCAATCC-3′
3′-AAGGTATAGC……ATAGGTTAGG-5′
MerR基因 5′-ATGGAAAATA……TATGCCTTAG-3′
3′-TACCTTTTAT……ATACGGAATC-5′
GFP基因 5′-ATGAGTAAAG……ATACAAATAA-3′
3′-TACTCATTTC……TATGTTTATT-5′
表2
引物組 序列
甲 5′-TTTACAGCTA-3′
5′-CTAAGGCATA-3′
乙 5′-CTAGCATGGA-3′
5′-TCCATCCTAG-3′
丙 5′-TTCCATATCG-3′
5′-TTATTTGTAT-3′
丁 5′-AATCCATGAG-3′
5′-CTCATGGATT-3′
(1)獲取MerR基因時，利用PCR技術對模板DNA進行了30個“95 ℃變性→50 ℃復性→72 ℃延伸”的循環處理，對其產物電泳，出現圖2所示結果。PCR反應緩沖液中加入Mg2＋的作用是___________ _________________________________，圖2中③實驗結果出現的原因可能是_____________________________。
(2)圖1啟動子b應選擇______________________________________，其作用是___________________________________。為確保MerR基因、GFP基因分別與相應啟動子正確連接，科研人員應選擇表2中____________________________組引物對重組 DNA 進行擴增，并作進一步驗證。
(3)研究發現，若全細胞生物傳感器在無Hg2＋狀態下GFP基因的表達量偏高，則傳感器靈敏度低。提出改造重組質粒以提高靈敏度的兩條措施：____________________________________。
解析：(1)PCR反應緩沖液中加入Mg2＋的作用是激活耐高溫DNA聚合酶；獲取MerR 基因時，利用 PCR 技術對模板 DNA進行了30個“95 ℃變性→50 ℃復性→72 ℃延伸”的循環處理。對其產物電泳，由圖2可知，③號泳道實驗組的DNA片段數量多于②號泳道純目的基因對照組，說明③號泳道實驗組中除了有目的基因外，還有其他的基因片段，造成該實驗結果出現的原因可能是引物較短，特異性低，除了能作為目的基因的引物外，還能作為其他基因的引物。(2)由題意可知，J109為組成型啟動子，在不同細胞發揮作用的效果基本一致，而PmerT為誘導型啟動子，需要特定信號刺激后發揮作用。
由圖1可知，啟動子a與GFP基因相連，啟動子a的作用是啟動GFP基因轉錄出mRNA，但啟動子a作用的發揮與MerR蛋白有關，所以啟動子a為誘導型啟動子，應選擇PmerT；啟動子b與MerR基因相連，啟動子b的作用是啟動MerR基因轉錄出mRNA，但啟動子b作用的發揮不需要特定信號刺激，所以啟動子b為組成型啟動子，應選擇J109。在反應體系中加入引物的作用是與目的基因的模板鏈配對，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，延伸子鏈。由前面的分析可知，MerR基因的啟動子是組成型啟動子J109，GFP基因的啟動子是誘導型啟動子PmerT，由表1和表2可知，啟動子J109
和MerR基因的堿基序列可與甲組引物進行互補配對，啟動子PmerT和GFP的堿基序列可與丙組引物進行互補配對，所以為確保MerR基因、GFP基因分別與相應啟動子正確連接，應選擇表2中甲、丙組引物對重組 DNA 進行擴增，并作進一步驗證。(3)由圖1可知，全細胞生物傳感器在有Hg2＋狀態下，啟動子a才能啟動GFP基因轉錄，最終生成GFP，表現出綠色熒光；在無Hg2＋狀態下，啟動子a不能啟動GFP基因轉錄，不能表現出綠色熒光。如果全細胞生物傳感器在無Hg2＋狀態下GFP基因的表達量偏高，傳感器靈敏度低，根據圖1中全細胞生物傳感器的原理可推測出其原因可能是MerR對啟動子
a的抑制作用減弱或啟動子a對GFP基因轉錄的啟動作用增強。因此為了使全細胞生物傳感器在無Hg2＋狀態下GFP基因的表達量正常，提高傳感器靈敏度，需要對重組質粒進行改造，具體措施有增強MerR與啟動子a的結合、修改啟動子b以增強MerR的表達、增加重組質粒中MerR基因的數量(拷貝數)、修改啟動子a以降低GFP基因的表達量。
答案：(1)激活耐高溫的DNA聚合酶　引物較短，特異性低　
(2)J109　啟動MerR基因轉錄出mRNA　甲、丙　(3)增強MerR與啟動子a的結合、修改啟動子b以增強MerR 的表達、增加重組質粒中MerR 基因的數量(拷貝數)、修改啟動子a以降低 GFP基因的表達量(答出兩條即可)
(2024·山東卷)研究發現基因L能夠通過脫落酸信號途徑調控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點處插入大豆基因L的向導DNA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉錄產物可引導核酸酶特異性結合基因組上的目標序列并發揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結果等如圖所示。
題型二　基因工程的操作程序
(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越__________(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產生的黏性末端最多有__________種。載體信息如圖甲所示，經BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5′-________________-3′和5′-__________-3′。
(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，使用抗生素_____________篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產物完全酶切后的電泳結果如圖丙所示。據圖可判斷選用的限制酶是___________，其中純合的突變植株是_________(填序號)。
(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發現其體細胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為______，篩選出的敏感植株可用于后續的品種選育。
(2)重組載體通過農桿菌導入大豆細胞，會將T-DNA片段插入大豆細胞染色體 DNA上，T-DNA上有卡那霉素抗性基因，因而可以用卡那霉素篩選。目標序列上有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，突變序列有BamHⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ酶切位點，根據電泳結果，②只有一個條帶，說明沒有被酶切，所以用的酶是SacⅠ，且②為目標序列，因為目標序列沒有SacⅠ酶切位點，酶切后④有兩個不同于②的條帶說明④是突變純合子。(3)基因L突變的純合植株基因型記為LL，T-DNA上有卡那霉素的抗性基因，體細胞中只有1條染色體有T-DNA，說明只有一個抗性基因。若T-DNA 不在L基因所在的染色體
上，用A表示抗性基因，則關于抗性的基因型記為AO，植株基因型為LLAO，兩對基因遺傳時遵循自由組合定律，LLAO自交，其后代突變基因純合且抗生素敏感的植株(LLOO)所占比例為1/4。若該基因在L基因所在的染色體上植株基因型記為LL′，LL′自交其后代突變基因純合且抗生素敏感的植株(LL)占 1/4。
答案：(1)低　44　GTTT　CAAT　
(2)卡那霉素　SacⅠ　④　(3)1/4
·任務一　啟動子的相關分析
(1)引物通過什么鍵與模板的結合？是否遵循堿基互補配對原則？
提示：氫鍵，是。
(2)引物越短，DNA上與之配對的序列越少，對特異性有何影響？
提示：特異性越低。
·任務二　糯性分析
(1)用BsaⅠ酶切大豆基因組的DNA序列，從其識別序列與切割位點可知，切出的黏性末端有多少個堿基？理論上可產生的黏性末端最多有多少種？
提示：4,44(256)。
(2)載體有上、下游兩個BsaⅠ酶切位點，酶切后，載體上留下的黏性末端，左側末端是什么？右側末端是什么？
提示：5′-CAAT-3′，5′-GTTT-3′。
·任務三　因果推理與論證
提示：限制酶只能識別差異序列中的一種序列　SacⅠ　①③　②　④
·任務四　建構概念模型
提示：AA純合子　突變位點純合子AA　Bb雜合子　1/4　1/4
模型一　圖解限制酶的選擇原則
(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ限制酶，而不選擇SmaⅠ限制酶。
(2)保留標記基因原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ限制酶。
(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ限制酶；為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。
模型二　基因表達載體的構建模型
(2024·青島一模)CRISPR-Cas12a系統是第二類用于編輯哺乳動物基因組的CRISPR-Cas 系統，該系統主要包含crRNA 和Cas12a蛋白兩部分，crRNA 能特異性識別并結合特定的DNA序列，從而引導Cas12a蛋白到相應位置剪切 DNA。某科研團隊基于CRISPR-Cas12a系統對宮頸癌細胞中的 KIFC1基因進行敲除，來探討 KIFC1基因在宮頸癌細胞中的功能及對宮頸癌 HeLa細胞增殖的影響。
(1)在CRISPR-Cas12a系統中，crRNA的序列與目的基因特定堿基序列部分結合，結合區域最多含_____________種核苷酸；細菌細胞中的___________________________________也能起到類似Cas12a蛋白的作用。若要將KIFC1基因從目標DNA上剪切下來，需要設計_________________種crRNA。
(2)為保證目的基因與PX458質粒正確連接，在擴增目的基因時，應在引物端加入相應的限制酶序列，其中P1的堿基序列為5′-___________-3′(寫出前9個堿基)。采用PCR技術對一個DNA 進行擴增時，第n次循環共需要引物_______個。
(3)在目的基因與PX458質粒連接時，可用_____________(填“E.coli DNA 連接酶”或“T4 DNA 連接酶”)進行連接。
(4)將crRNA-Cas12a重組載體成功轉染至HeLa細胞，與對照組相比，實驗組中KIFC1蛋白表達最如圖乙所示，細胞數目的變化如圖丙所示，由此可得出的結論是______________________________，判斷依據是__________________________________。
解析：(1)在CRISPR-Cas12a系統中，crRNA的序列與目的基因特定堿基序列部分結合，在結合區域有DNA和RNA，組成DNA的核苷酸為4種脫氧核苷酸，組成RNA的核苷酸為4種核糖核苷酸，所以結合區域最多含8種核苷酸。由題意可知，在CRISPR-Cas12a系統中，Cas12a蛋白的作用是在 crRNA的引導下，到相應位置剪切DNA。細菌細胞中的限制酶也能剪切DNA，與Cas12a蛋白的作用類似。因為要將KIFC1基因從目標 DNA上剪切下來，需要兩個切口，每個切口都需要crRNA特異性識別并結合特定的 DNA 序列，兩個切口處的DNA序列又不同，所以需要設計2種crRNA。(2)為保證目的基因
與PX458質粒正確連接，在擴增目的基因時，應在引物端加入相應的限制酶序列，由圖甲可知，PX458質粒有3種限制酶切割位點，其中KpnⅠ有2個切割位點，其中的一個切割位點在Cas12a基因上，所以不能選擇限制酶KpnⅠ，為避免目的基因與PX458質粒在切割后的環化及保證目的基因與PX458質粒正確連接，應選擇PvitⅡ和EcoR Ⅰ這兩種不同的限制酶切割質粒和含有目的基因的 DNA片段，PvitⅡ的識別序列為5′-CAG↓CTG-3′，切割后為平末端，EcoRⅠ的識別序列為5′-G↓AATTC-3′，切割后為黏性末端，PvitⅡ的識別序列離啟動子U6近，EcoRⅠ的識別序列離啟動子U6
遠，目的基因的A鏈為轉錄的模板鏈，引物P1與A鏈互補配對，所以轉錄應從 A鏈的3′端開始，引物P1上應加入限制酶PvitⅡ的識別序列，由P1的箭頭方向可知，P1的前9個堿基序列為5′-CAGCTGCTC-3′。采用PCR 技術對一個 DNA 進行擴增時，第n－1次循環后，共生成了2n－1個 DNA分子，在進行第n次循環時，每個 DNA 分子都需要2個引物，所以n次循環共需要引物2×2n－1＝2n個。(3)因為目的基因和PX458質粒在用限制酶PvitⅡ和EcoRⅠ切割時，分別形成了平末端和黏性末端，E.coli DNA 連接酶只能連接黏性末端，T4 DNA連接酶既能連接黏性末端，又能連接平末端，所以在目的基因與PX458質粒連接時，可用 T4 DNA 連接酶進行連接。
(4)由題意可知，該實驗的目的是探究 KIFC1基因在宮頸癌細胞中的功能及對宮頸HeLa細胞增殖的影響，對照組為含有 KIFC1 基因的 HeLa 細胞，實驗組為敲除了 KIFC1 基因的 HeLa細胞，由圖乙可知，與對照組相比，實驗組中KIFC1蛋白表達量明顯下降，證明HeLa細胞KIFC1基因敲除成功，由圖丙可知，KIFC1敲除組細胞數目顯著低于對照組，表明 KIFC1敲除可使HeLa 細胞增殖能力下降，由此可得出的結論是 KIFC1基因可以促進HeLa細胞的增殖。
答案：(1)8　限制酶(限制性內切核酸酶)　2　(2)CAGCTGCTC　2n　
(3)T4 DNA 連接酶　(4)KIFC1基因可以促進 HeLa細胞的增殖　實驗組細胞株中KIFC1蛋白表達量明顯下降，證明HeLa細胞KIFC1基因敲除成功；KIFC1敲除組細胞數目顯著低于對照組，表明KIFC1 敲除可使 HeLa細胞增殖能力下降

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