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(共22張PPT)
專題七　發酵工程　專項練習
非選擇題
1.(2022·深圳二模)米諾環素(分子式:C23H27N3O7)是一種四環素類抗生素,應用于人類疾病治療和畜禽養殖。由于進入人體或動物體內不能完全被吸收,造成其在環境中殘留。某研究人員在自然水域中篩選和分離得到了一種米諾環素高效降解菌DM13,并展開相關研究。下表是研究過程中使用的培養基種類及配方,回答下列問題。
培養基種類 配方
BP培養基 蛋白胨5.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化鈉5.0 g,蒸餾水定容至1000 ml
BPA培養基 蛋白胨5.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂25.0 g,蒸餾水定容至1000 ml
MM培養基 MgSO4·7H2O 0.15 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、
CaCl2 0.02 g、KH2PO4 1 g、Na2HPO4 1 g、
NH4NO3 1 g、葡萄糖0.5 g,蒸餾水定容至1000 ml
(1)分離微生物前,可通過選擇培養來增加米諾環素降解菌的濃度,需在BP培養基中添加一定濃度的　　 　　　,該物質同時提供微生物生長需要的　 。
(2)選擇培養得到的微生物樣品先稀釋,再涂布到 (BP/
BPA/MM)培養基的平板進行培養。如果水樣中降解米諾環素的微生物數量較少,為了避免分離篩選失敗,可采取的措施是 (回答1點)。
米諾環素溶液
碳源、氮源
把各種稀釋倍數的溶液都涂布到平板進行培養、增加重復平板的數量
BPA
(3)為了測定菌株DM13在自然水體中降解米諾環素的效果,在錐形瓶中用自然水體配制四種不同初始濃度的米諾環素溶液,進行實驗。
①8 h處理后,在米諾環素溶液初始濃度100 ug/L的水體中,空白對照測得的米諾環素溶液濃度41.8 ug/L,加入菌株DM13測得的濃度24.3 ug/L,相較空白對照組,米諾環素降解菌的降解率為　 。
②為了測定菌株DM13的實際降解效果,可選擇表中的MM培養基替換自然水體,這樣做的目的是 。
41.9%([(100-24.3)-(100-41.8)]/41.8)
排除自然水體中其他微生物的影響
【詳解】　
(1)分離微生物前,可通過選擇培養來增加米諾環素降解菌的濃度,需在BP培養基中添加一定濃度的米諾環素溶液,以提供選擇培養的條件,該物質中含有碳元素和氮元素,因而可同時提供微生物生長需要的碳源和氮源。
(2)選擇培養得到的微生物樣品先稀釋,再涂布到BPA培養基的平板進行培養,因為該培養基是固體培養基,且其中含有微生物生長所需的碳源和氮源。如果水樣中降解米諾環素的微生物數量較少,因而可能導致實驗失敗,為了避免分離篩選失敗,可把各種稀釋倍數的溶液都涂布到平板進行培養、增加重復平板的數量,從而可分離得到相應的單菌落。
(3)本實驗的目的是測定菌株DM13在自然水體中降解米諾環素的效果,因而設計在錐形瓶中用自然水體配制四種不同初始濃度的米諾環素溶液,進行實驗。
①8 h處理后,在米諾環素溶液初始濃度100 ug/L的水體中,空白對照測得的米諾環素溶液濃度41.8 ug/L,加入菌株DM13測得的濃度24.3 ug/L,相較空白對照組,米諾環素降解菌的降解率為[(100-24.3)-(100-41.8)]/41.8≈41.9%。
②為了測定菌株DM13的實際降解效果,可選擇表中的MM培養基替換自然水體,這樣做的目的可排除自然水體中其他微生物的影響。
2.(2021·廣東省一模)用大豆釀造的醬油是我國的傳統調味品,初見記載于800多年前的南宋。醬油曲霉對醬油生產的原料利用率和醬油的風味起決定性作用。以下為誘變選育醬油曲霉高酶活菌株的主要步驟:將培養基裝入錐形瓶→滅菌→接入菌種孢子→培養2天成曲→紫外燈誘變→純化接種→多次篩選→測酶活性。下表為6種菌株酶活性的檢測結果。請回答:
酶種類 不同菌株酶活性(相對值)
原始株 誘變① 誘變② 誘變③ 誘變④ 誘變⑤
堿性蛋白酶 1.00 1.31 1.49 0.89 1.20 1.57
中性蛋白酶 1.00 1.18 1.28 1.35 1.44 1.57
酸性蛋白酶 1.00 0.43 1.78 0.17 1.15 1.00
纖維素酶 1.00 1.28 0.92 1.16 1.35 1.41
a-淀粉酶 1.00 1.02 0.95 0.95 1.45 1.36
(1)盛有培養基的錐形瓶需通過　　 　　　法進行滅菌,滅菌是指 。
(2)平板劃線接種中,在做第二次以及其后的劃線操作時,總是從上一次劃線的末端開始,其目的是 。 　　　　　　　　　　　　　　　　
(3)測定蛋白酶活性時,可用單位時間內、單位體積中 .
來表示。
(4)醬油質量標準:醬油中的氨基酸含量越高,則鮮味越濃、質量越好。據上表數據分析,誘變菌株　 　(填數字)具有更好的工業化應用前景,理由是　 。
高壓蒸汽滅菌
使用強烈的理化因素殺死物體內外所有微生物,包括芽孢和孢子
得到單個菌落
蛋白質消耗量(或氨基酸生成量)
②
蛋白酶的總體活性最高,氨基酸生成量多
【詳解】　
(1)對培養基常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌,滅菌是指使用強烈的理化因素殺死物體內外所有微生物,包括芽孢和孢子。
(2)平板劃線的目的是分離菌種,以便得到單個菌落。為達到此目的,在平板劃線接種中,在做第二次以及其后的劃線操作時,總是從上一次劃線的末端開始。
(3)酶活性指的是酶對化學反應的催化效率,而蛋白酶能夠催化蛋白質水解,所以測定蛋白酶活性時,可用單位時間內、單位體積中蛋白質消耗量(或氨基酸生成量)來表示。
(4)醬油質量標準是:醬油中的氨基酸含量越高,則鮮味越濃、質量越好。分析表中信息可知,誘變菌株②的蛋白酶的總體活性最高,說明其氨基酸生成量多,因此具有更好的工業化應用前景。
3.(2021·廣州一模)乳酸菌中的谷氨酸脫羧酶(GAD)能消耗H+,將谷氨酸轉化為γ-氨基丁酸(GABA),GABA在制藥、食品等方面具有較大應用。研究人員從泡菜樣品中篩選高產GABA的乳酸菌株,并優化其發酵條件。回答下列問題:
(1)已知MRS固體培養基因含有碳酸鈣而不透明,乳酸菌所產的酸可與碳酸鈣發生反應,從而在培養基上形成 。　　　　　　　　　　從功能上判斷,MRS培養基可作為乳酸菌的　　　　培養基。
(2)利用MRS培養基分離純化乳酸菌時,首先需用　　　 　對泡菜濾液進行梯度稀釋,然后再結合其他方法篩選出具高產GABA特性的乳酸菌。進行梯度稀釋的目的是 .
　 。
透明圈
鑒別
無菌水
泡菜濾液中菌的濃度高,
直接培養很難分離得到單菌落
(3)研究人員對高產菌株產GABA的發酵時間和溫度分別進行了研究,結果顯示,發酵時間在48~60 h范圍內,GABA的相對產量較高;發酵溫度在35~39 ℃范圍內,GABA的相對產量較高。研究人員認為,要進一步提高GABA相對產量,以達到最佳生產效果,還需同時對發酵時間和發酵溫度進行優化。請為該優化實驗設計一個實驗結果記錄表。
溫度 時間
48小時 49小時 50小時 51小時 52小時 53小時 54小時
35 ℃
36 ℃
37 ℃
38 ℃
39 ℃
溫度 時間
55小時 56小時 57小時 58小時 59小時 60小時 ——
35 ℃ ——
36 ℃ ——
37 ℃ ——
38 ℃ ——
39 ℃ ——
【答案】 不同溫度、不同發酵時間GABA的相對產量
4.(2021·深圳二模)為篩選出優良的纖維素酶產生菌,某科研團隊從腐木、腐土、腐葉等樣品中采集微生物,配置馬鈴薯瓊脂培養基和羧甲基纖維素瓊脂培養基(后者的配方如下表),分別用于初篩和復篩,最終分離、純化得到降解纖維素能力較強的木霉1株(T-1)和青霉2株(P-1,P-2)。回答下列問題:
物質 質量或體積 物質 質量或體積
羧甲基纖維素鈉 10 g 蛋白胨 1 g
(NH4)2SO4 4 g 瓊脂 20 g
KH2PO4 2 g 蒸餾水 1000 mL
MgSO4·7H2O 0.5 g
(1)表中的羧甲基纖維素鈉主要為微生物生長提供　 　　,從功能上分析,該培養基屬于　　 　培養基。
(2)復篩的過程中,在培養基中添加適量的剛果紅染料,根據菌落
　　　　　　　 ,可篩選出分解纖維素的霉菌,原因是 .
.
　 。
(3)β-葡萄糖苷酶是一種纖維素酶,能將纖維二糖分解為　　 　。為了探究T-1、P-1、P-2這3株霉菌產生β-葡萄糖苷酶的活性選用甘蔗渣作為碳源的發酵產酶培養基,以水楊素(一種纖維二糖)作為酶促反應底物,寫出簡要實驗思路: .
.
.
　 。
碳源
選擇
是否產生透明圈
剛果紅不能和纖維素水解后的產物形成紅色復合物(剛果紅可以和纖維素形成紅色復合物,但不能和纖維素水解后的產物形成紅色復合物)
葡萄糖
將3株霉菌分別接種到相同發酵產酶培養基中單獨產酶,各取相同體積的酶液,加入等體積的水楊素分別進行反應,測量單位時間內水楊素的減少量或葡萄糖的增加量
【詳解】　
(1)題干信息為“篩選優良的纖維素酶產生菌”,則培養基中應該以纖維素作為唯一的碳源,故表中的羧甲基纖維素鈉主要為微生物生長提供碳源。該培養基只允許纖維素酶產生菌生存,其他的微生物無法生存,故從功能上分析,屬于選擇培養基。
(2)纖維素分解菌產生纖維素酶,可分解菌落周圍的纖維素,故根據菌落周圍是否出現透明圈,可篩選出分解纖維素的霉菌。原因是纖維素被分解后,剛果紅就不能和纖維素水解后的產物形成紅色復合物(剛果紅可以和纖維素形成紅色復合物,但不能和纖維素水解后的產物形成紅色復合物。)
(3)纖維素酶是一種復合酶,包括三種組分,即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶,葡萄糖苷酶能將纖維二糖分解為葡萄糖。為了探究T-1、 P-1、P-2這三株霉菌產生β-葡萄糖苷酶的活性,可以通過纖維素分解的速率來比較,故實驗思路為:將3株霉菌分別接種到相同發酵產酶培養基中單獨產酶,各取相同體積的酶液,加入等體積的水楊素分別進行反應,測量單位時間內水楊素的減少量或葡萄糖的增加量。
拮抗微生物數量多針對性強
5.(2022·廣州一模)番茄青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的,具有較強的侵染力和破壞力。番茄青枯病可通過以根際促生菌作為拮抗微生物抵御青枯雷爾氏菌進行生物防治。因此,發掘新的高效能拮抗青枯病病原菌的促生微生物具有重要意義。回答下列問題。
(1)進行樣本采集及拮抗細菌菌株分離純化時,應采集某地番茄青枯病發病果園中　　 (填“健康”或“患病”)植株根際土壤,在番茄青枯病發病果園中取樣的原因是　
_______。先稱取1 g土壤添加到盛有　　 　的三角瓶中均勻振蕩后,置于恒溫水浴15 min。經分離培養后,挑取單菌落進行劃線純化。
健康
無菌水
(2)進行拮抗細菌的分離篩選時,為比較不同根系微生物純化菌液對青枯病病原菌的拮抗作用效果,科研人員配制了含有青枯病病原菌的平板,在含青枯病病原菌平板上滴加　　　　　　　,在相同且適宜的條件下培養一段時間,觀察并比較抑菌圈的大小,拮抗作用越強則　 。
(3)通過對拮抗細菌產酶活性進行測定,篩選出4株菌株,隨后進行青枯病預防實驗。現有番茄幼苗、4種菌液、青枯菌菌液、無菌水等。請設計實驗比較菌株的預防效果(寫出實驗思路)。
不同根系菌液
抑制菌圈越大
將生長狀況相同且良好幼苗平均分為5等分,標注1~5 組,每組設三個平行組。 1組噴灑無菌水和青桔菌液,2~5組分別噴灑四種菌液,后噴灑青枯菌菌液,培養一段時間觀察比對生長及患病情況。
【詳解】　
(1)根據題意,拮抗細菌可通過拮抗青枯雷爾氏菌防止番茄青枯病的發生,在發病果園中存在青枯雷爾氏菌,其中健康的植株則是由于拮抗細菌的存在而使其保持健康,為了獲取拮抗菌株,我們應選取健康植株的土壤。在發病果園中取樣的原因是番茄青枯病發病果園中有較多的青枯雷爾氏菌,也有較多的拮抗細菌,即番茄青枯病發病果園中拮抗微生物數量多針對性強。稱取土壤后進行稀釋,使用無菌水進行稀釋,避免外來微生物對純化的影響,因此先稱取1 g土壤添加到盛有無菌水的三角瓶中均勻振蕩后,置于恒溫水浴15 min。
(2)為比較不同根系微生物純化菌液對青枯病病原菌的拮抗作用效果,科研人員配制了含有青枯病病原菌的平板,含青枯病病原菌平板中滴加等量的不同根系微生物純化菌液,觀察其抑菌圈的大小。根系微生物對青枯病病原菌有拮抗作用,會抑制其生存,滴加了根系微生物純化菌液的地方不會生長青枯病病原菌,其周圍生長了青枯病病原菌,形成抑菌圈,所以拮抗作用越強則抑制菌圈越大。
(3)實驗目的是進行青枯病預防實驗比較菌株的預防效果,故實驗自變量為菌株的種類,在實驗設計過程中,要遵循單一變量的原則,因此實驗思路為:將生長狀況相同且良好幼苗平均分為5等分,標注1~5組,每組設三個平行組。1組噴灑無菌水(作為對照組)和青桔菌液,2~5組分別噴灑四種菌液,后噴灑青枯菌菌液,培養一段時間觀察比對生長及患病情況。
6.(2022·江門一模)紅曲霉是一類小型腐生真菌,其菌落起初為白色,老熟后因種而異變為淡粉色、紫紅色或天黑色等。紅曲霉具有耐酸、耐乙醇、耐高溫等特性,可用作釀酒、制醋和腐乳生產的調味劑。
(1)在紅曲霉的培養基中加入淀粉和蛋白質,作為其生長所需營養物質中的　　 　　　。紅曲霉可產生淀粉酶和蛋白酶等多種酶類,將淀粉和蛋白質最終水解成　　　 　　等呈味物質。為獲取紅曲霉的單菌落,可以在無菌操作條件下通過
　　　　　 接種,此方法將混合菌株在固體培養基中培養形成單菌落,然后根據紅曲霉表現出的　 　　　　 挑選所需的目的菌株。
碳源和氮源
單糖和氨基酸
平板劃線或稀釋涂布平板
特有的菌落特征
(2)上述培養皿中培養出不同微生物的菌落后,需經多次分離才能獲得所需的紅曲霉菌株。為減少分離次數,在培養基中添加適當濃度的乳酸和乙醇,并設置合適的溫度,目的是 。
(3)在已分離得到多株紅曲霉的基礎上需進一步篩選特定的紅曲霉。研究人員通過紫外線誘變獲得多個紅曲霉突變體,再將這些突變體點種于含有牛奶的固態培養基中,通過 的比值來篩選蛋白酶活為較高的紅曲霉。
抑制紅曲霉以外的其他微生物的活性
水解圈和菌落直徑
【詳解】　(1)在紅曲霉的培養基中加入淀粉和蛋白質,作為其生長所需營養物質,其中淀粉主要作為培養基中碳源,蛋白質主要作為培養基中的氮源。紅曲霉可產生淀粉酶和蛋白酶等多種酶類,將淀粉和蛋白質最終水解成單糖(葡萄糖)和氨基酸等呈味物質。為獲取紅曲霉的單菌落,可以在無菌條件下通過平板劃線或稀釋涂布平板法在固體培養基上接種從而獲得單菌落,然后根據紅曲霉表現出的特有的菌落特征挑選所需的目的菌株,這是目的菌純化的過程。
(2)上述培養皿中培養出不同微生物的菌落后,需經多次分離才能獲得所需的紅曲霉菌株。為減少分離次數,根據紅曲霉具有耐酸、耐乙醇、耐高溫等特性,在培養基中添加適當濃度的乳酸和乙醇,并設置較高的溫度,從而選擇出目的菌株,因為很少有其他有菌種能利用乳酸和乙醇,并耐高溫,從而起到選擇的作用。
(3)在已分離得到多株紅曲霉的基礎上需進一步篩選特定的紅曲霉。研究人員通過紫外線誘變獲得多個紅曲霉突變體,再將這些突變體點種于含有牛奶的固態培養基中,通過水解圈和菌落直徑的比值大小來篩選蛋白酶活為較高的紅曲霉,該值越大說明紅曲霉的分解能力越強。

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